Absztrakt
Cél: Ezt a vizsgálatot azért végezték, hogy megerősítsék a vegyes gyógynövénykivonat (MHE) alkalmazhatóságátöregedésgátló kozmetikaiösszetevő vizsgálatávalbőr öregedésgátlóin vitro és in vivo aktivitások. Módszerek: Ebben a vizsgálatban MHE-t készítettünk ultrahangos extrakcióval, amely Forsythiae fructus, Tribuli fructus, Salamon's Seal, Szibériai ginzeng, Ponciri Fructus és Ginseng tartalmú. Megvizsgáltuk aAz MHE öregedésgátló hatása a bőrre a dermális fibroblasztokban. Aöregedésgátló tevékenységtípusú kollagén szintézis szintjei határozták meg. A mátrix metalloproteináz-1 (MMP1) és a metalloproteináz 1 szöveti inhibitora (TIMP1) mRNS szintjét qRT-PCR-rel mértük. Az MMP1 fehérje szintjét blotting analízissel értékeltük. A bőr nedvességtartalmának, rugalmasságának, szerkezetének és ráncainak klinikai vizsgálatát 1 százalék MHE-t tartalmazó kozmetikumokkal végezték. Eredmények: Az MHE az I-es típusú pro-kollagén szintézis és a TIMP1 mRNS expresszió fokozódását idézte elő. Az MHE az MMP1 mRNS szintjének és fehérjeszintjének csökkenéséhez vezetett. Továbbá az 1 százalék MHE-t tartalmazó kozmetikumok bőrre történő felvitelét követően a bőr hidratáltsága, rugalmassága, textúrája és szarkalábak javultak 4 héttel a kezelés után. Következtetés: Az MHE öregedésgátló hatást fejt ki azáltal, hogy elősegíti a kollagén szintézist és gátolja az MMP1 génexpressziót in vitro, valamint bőrjavító hatása van in vivo. Ezért kimutatták, hogy az MHE funkcionális kozmetikai összetevőként értékes.
Kulcsszavak:Bőrápolás, Öregedésgátló, Ránctalanító, Természetes kozmetikumok, Gyógynövény
A gyógynövény-kiegészítők Cistanche az ÖREGEDÉS ELLENI
Bevezetés
A bőr olyan szerv, amely érintkezésbe kerül a külső környezettel, és létfontosságú túlélésünkhöz, elsődleges akadályként működikkülső támadások ellenfertőző ágensek és fizikai sérülések; emellett számos fontos élettani szerepet tölt be (Slominski et al., 2004; Vollmer és mtsai, 2018). Ahogy öregszünk,bőrfunkciófokozatosan romlik az ultraibolya (UV) sugarak, a környezetszennyezés és a stressz okozta atrófiás változásokkal, valamint a bőr öregedésével, amely a bőrsejtek számának és a bőr vastagságának csökkenésével jár (Farage et al., 2013).
A bőr öregedéseendogén és exogén öregedésekre osztható. Az endogén bőröregedés idővel természetesen, a külső hatásoktól függetlenül megy végbe. A dermális-epidermáliscsomópont (DEJ) kohéziója gyengül, és a differenciálódással együttA keratinociták esetében csökken a lipidképződés (Makrantonakiet al., 2007). Másrészt az exogén öregedést külső tényezők okozzákolyan tényezők, mint az UV-sugárzás, infravörös sugárzás (IR), dohányzás, finompor és életmód. Ezek közül a fotoöregedést az UV okozzaa bőrön áthatoló sugarak károsítják a kollagént és az elasztinta dermiszben. Ebben a folyamatban a rugalmas rostok és a kollagéna bőr rostjai deformálódnak, ami csökkenti a rugalmasságotés megereszkedett. A kollagén az extracelluláris sejtek egyik fő összetevőjemátrix, és fontos szerepe van a szövetek működésének meghatározásában.
A különböző kollagéntípusok közül az 1-es típusú kollagén a teljes kollagén körülbelül 75-80 százalékát teszi ki (Landau, 2007; Lovell és mtsai, 1987; Mays és mtsai, 1988). Amikor a bőr ki van téveAz UV-sugarak hosszú ideig szabad gyökök keletkeznek. Ezek ingyeneseka gyökök serkentik a mátrix metalloproteináz expresszióját-1(MMP1), amely elősegíti a kollagén lebomlását és gátolja a kollagéntszintézis, amely csökkenti a bőr rugalmasságát és ráncokat eredményez.Ezért az általa okozott bőrráncok megelőzésére és javításáraöregedő, olyan összetevőt kell kifejleszteni, amely elősegítia kollagéntermelést és gátolja annak expresszióját és aktivitásátMMP1 (Wlascheket al., 2001).
A bőr öregedéseszorosan összefügg az életminőséggel. Mivel a bőr a legláthatóbb szerv, felhívja a figyelmünket az öregedési folyamatra (Binic et al., 2013). Különféle erőfeszítések folynak az orvostudomány, a gyógyszeripar és a kozmetika területénmegelőzi és javítja a bőr öregedését. Aöregedésgátló összetevők fejlesztéseaz egyik legfontosabb öregedésgátló stratégia.
Ultrahangos extrakcióval gyógynövénykivonatokat készítettünk, hogy új öregedésgátló összetevőket fejlesszünk ki, amelyek Forsythiae fructus, Tribuli fructus, Salamon's Seal, Szibériai ginzeng, Ponciri fructus és Ginseng tartalmúak.
Hat gyógynövényes gyógyszert választottak ki különféle gyógyászati és bőrhatású növények közül. Forsythiae fructus, a Lian Qiao néven ismert Forsythia suspense (Oleaceae család) szárított gyümölcseKínában, először Shennong Bencao Jing, atekintélyes monográfia a hagyományos kínai orvoslásról (TCM)(Donget al., 2017). Hőtisztítónak ésméregtelenítő TCM fertőző betegségek kezelésére, mint plakut nephritis, erysipelas és fekélyek (Wanget al., 2018). Ezszéles körben használják a klinikákon egyetlen gyógyszerként vagy összetett receptként.A modern farmakológia kimutatta, hogy sokfélebioaktivitások, beleértve a gyulladáscsökkentő, antibakteriális, antivírusos, antioxidáns, daganatellenes, cukorbetegség elleni, antihiperlipidémiás,antiandrogén alopecia, hányás elleni, öregedésgátló és anti-elhízási tevékenységek és neuroprotektív, májvédő, illérrelaxáns hatások (Donget al., 2017). Ráadásul az is voltarról számolt beForsythiae fructusbőrfehérítő, anti-atópiás dermatitisz és öregedésgátló hatások. Tajvan szerintországos recept adatbázis,Forsythia Fructusvoltszerepel az atópiás kezelésére leggyakrabban használt 10 gyógynövény közöttdermatitis (15,9 százalék), csalánkiütés (11.49-13,4 százalék) és akne (22,3 százalék)(Donget al., 2017). Forsythiae fructusszaponint tartalmaz,flavonoidok,valamint alkaloidok és oleanolsav, amely hasznosfarmakológiai hatás. Ezenkívül arctigenint ésmatairesinol. Fiziológiailag aktív bőrösszetevőkként azoktirozináz inhibitorok, amelyek a melanin metabolizmusára hatnakáltal indukált útvonal - melanocita stimuláló hormon ( -MSH)és kozmetikai fehérítő anyagokként vonzzák a figyelmet(Yang és Choe, 2011).Tribuli fructus, aminek a szárított gyümölcseTribulus terrestrisL, a jelentések szerint farmakológiaia szexuális funkciókat javító, megelőzési és kezelési tevékenységekszív- és érrendszeri betegségek, valamint a neuroprotekció javítása ésmemória. Antidiabetikus, gyulladáscsökkentő ésantioxidáns hatások (Chhatreet al., 2014). Tribuli fructuskivonat tartalmaz nagy mennyiségű diosgenint, tigogeint, különféleszaponinok stb. Ezek a szaponinok a legfontosabb bioaktív anyagokkülönböző biológiai hatásokért felelős komponensek, mint plafrodiziákum, vérnyomáscsökkentő és védő hatásischaemia-reperfúziós károsodás és rákellenes hatás,antibakteriális és gombaellenes hatások (Chhatreet al., 2014).
Egyéb összetevők közé tartoznak a furostanol és spirostanol szaponinok, poliszacharidok, flavonoid glikozidok, alkaloidok és amidok. Ezen túlmenően patkányokban hatékony atópiás dermatitisz ellen, és gyulladáscsökkentő hatása is van (Chhatre et al., 2014). Beszámoltak arról, hogy a Tribuli fructus kivonat öregedésgátló hatása növeli az I-es típusú prokollagén és elasztin termelődését a HS68 sejtekben, elősegíti a zsírsejtek lipid felhalmozódását, és végső soron javítja a bőr ráncait és rugalmasságát (Kim et al., 2016). ). A szibériai ginzeng (Acanthopanax senticosus) az Oga családjába tartozó lombhullató cserje a ginzenggel és a vadon élő ginzenggel együtt. A szibériai ginzengnek sok hasonlósága van a ginzenggel, és gyógynövényként használják szélütés, magas vérnyomás és cukorbetegség kezelésére. A szibériai ginzeng kivonatot régóta használják a keleti gyógyászatban, és egészen a közelmúltig különböző vizsgálatokban farmakológiai és élettani eredményekről számoltak be. A szibériai ginzeng eddig azonosított komponensei közé tartozik az eleuthero oldalak A, B, C, D, E, I, K, L és M, valamint szezamin, chiizanozid, kávésav, klorogénsav, kampeszterol, vitaminok és ásványi anyagok (Park et al., 2010).
Triterpenoid szaponinokat, lignánokat, kumarinokat, illflavonoidok, amelyek közül a fenolos vegyületeket tartják a legaktívabb komponenseknek (Huang et al., 2011). Számos jelentés szól a szibériai ginzeng kivonat bőrön való hatásosságáról.A ránctalanító hatás,antioxidáns hatás,kollagén szintézis, valamint a fotoöregedés elleni kollagenáz gátló hatásról számoltak be (Park et al., 2010). Beszámoltak arról, hogy a szibériai ginzeng kivonat szabályozza a IV-es típusú kollagén szintézisét, befolyásolja az epidermális őssejtek proliferációs képességét és megvastagítja az epidermiszt (Choi et al., 2016). A Salamon pecsét a Polygonatum odoratum (szinonimája: P.officinale) rizóma, amely tonizáló hatású, és a keleti gyógyászatban szívelégtelenség és cukorbetegség kezelésére használják. Salamon pecsétje ciklus- és köhögéscsillapító; oldja a szívfeszültséget, vizelethajtó, energizáló, hipoglikémiás, nyugtató és tonik; tüdőbetegségek kezelésére használják, beleértve a tuberkulózist és a gyomor-bélrendszeri betegségeket (Haroon et al., 2012). Ezenkívül széles körben alkalmazzák vérbetegségek kezelésében; jótékony hatással van a vesecsatornákra, és megelőzi az ősz hajat, a látásproblémákat, a szédülést és az ótvart. Ez egy idegerősítő, és a cukorbetegség kezelésére használják (Haroon et al., 2012). A Salamon pecsét magas fenoltartalommal és antioxidáns hatással rendelkezik. A Solomon pecsétből származó homoizoflavanonok gátolják a fejlett glikozilációs végtermékek képződését. A Salamon-pecsét erős bélrendszeri szabályozó aktivitást mutatott, és képes az oszteoklasztok differenciálódását és a lektin által kiváltott apoptózist indukálni. A P. odoratum levélkivonat esetében példaként említik a sebgyógyító funkciót (Fathi et al., 2014). A Ponciri fructus immatures a Rutaceae családjába tartozó Poncirus trifoliata Rafinesque éretlen termése (Jung et al., 2016). A közelmúltban gyulladáscsökkentő és túlérzékenységi hatásokról számoltak be, és a zsíriszap kivonatának hatása a rákos sejtek apoptózisát indukálja (Lee et al., 2008). A Ponciri fructusról ismert, hogy hatékony az atópiás dermatitisz kezelésében. A Ponciri fructus kivonat bőrön történő alkalmazása révén beszámoltak az atópiás dermatitisek, például az epidermális hiperkeratózis, a bőrödéma és a citokinek elleni hatásáról. Különösen a viszketés, a hízósejtek számának, az IgE-termelésnek és az idegi növekedési faktor expressziójának jelentős csökkenéséről számoltak be. A Ponciri fructus kivonat hatékony gyulladáscsökkentő hatást fejt ki az atópiás dermatitisz ellen és viszketés elleni hatékonyságot az immunmechanizmusok szabályozásával. Ezenkívül a Ponciri fructus kivonat szájon át történő beadásáról ismert, hogy hasznos az allergiás betegségek kezelésében és megelőzésében (Hwang et al., 1997). A ginzeng egy széles körben használt hagyományos gyógynövény, amely többfunkciós hatással rendelkezik. A ginzenget gyulladáscsökkentő, antioxidáns, daganatellenes és öregedésgátló hatása miatt használták (Choi, 2008; Kim & Ko, 2020). Számos tanulmányt végeztek a ginzeng bőrre gyakorolt hatásáról (He et al., 2018). Közülük számos jelentés található a szaponinokról és ginzenozidokról, amelyek a ginzeng reprezentatív összetevői. A szaponinok olyan vegyületek, amelyek a legtöbb növényben kiterjedten megtalálhatók, és különféle formákban léteznek. A szaponinok felgyorsíthatják a különféle biológiai aktivitásokat, például a hemolízist, valamint az antibakteriális, antivirális és antioxidáns funkciókat. Ezenkívül a szaponinok gyulladásgátló tulajdonságokkal rendelkeznek, amelyek csökkenthetik a duzzanatot és a bőrgyulladást. A ginzenozidok növelik az interleukin (IL)-1 gyulladásos citokinek egyikét, amelyről ismert, hogy elősegíti az angiogenezist, és indukálja a vaszkuláris endothel növekedési faktorát és felhalmozódásátegerek bőrégési helyein. Beszámoltak a makrofágok bőrsebekből való eltávolítására és a sebgyógyulást elősegítő hatásukról is (Kim et al., 2011).
A tanulmány célja egy kevert gyógynövénykivonat (MHE) bőröregedésgátló hatásának tisztázása volt in vitro és in vivo.
Mód
1. In vitro hatékonysági értékelés
1) Az MHE elkészítése
A Forsythia suspense aszalt gyümölcse, a Tribulus Terrestris L. szárított gyümölcse, a szibériai ginzeng (Acanthopanax senticosus (Eleuthero) gyökér), a Salamon pecsét (Rhizóma és a Polygonatum Officinale gyökere), a Poncirus Trifoliata Rafinesque (Panax) gyümölcse helyi piacról vásárolt. A Hagyományos Kínai Orvoslás (TCM) "Yin-Yang" és "Five Elements" elmélete alapján a Forsythia suspensa, a Tribulus terrestris L. és a Poncirus trifoliata Rafinesque a "Yang"-nak és a szibériai ginzengnek, ginzengnek és Salamon pecsétjének felel meg. "Yin" lett kiválasztva. A hat gyógynövényt ismét az öt elemnek megfelelő tulajdonságokra osztották (fa, tűz, víz, fém vagy arany, valamint föld vagy talaj). Ezeket a gyógynövényeket az egyes elemek egyensúlya érdekében azonos arányban kevertük össze, a Poncirus trifoliata-t és a Földnek megfelelő ginzenget pedig a többi elemmel kombináltuk az arányoknak megfelelően (1. táblázat). A hat gyógynövényt 30 százalékos etanolban ultrahangos kezeléssel (20 kHz, 2 óra) extraháltuk. Rotációs bepárlóval végzett betöményítés után 30 térfogatszázalék butilénglikolt adunk hozzá, és az oldatot hígítva 1 százalék szilárdanyag-tartalmú kivonatot kapunk.
1. táblázat: Gyógynövénykeverékek összetétele
2) Sejttenyészetek és reagensek
A humán primer fibroblaszt sejteket (HDFn) a PromoCell-től szereztük be (Normal human dermal fibroblasts juvenile fityma, C-12300; PromoCell, Németország). Sejttenyészetek Dulbecco-valmódosított Eagle-féle közepesen magas glükóz (DMEM high glucose, SH30243.01, Hyclone, Cytiva), amely 10 térfogatszázalék szarvasmarha-magzatszérumot (FBS, SH30084.03, Hyclone) és 1 százalék antibiotikumot tartalmazgombaellenes szereket (Anti-anti, 15240-062, Gibco, USA) tenyésztettünk 37 fokon 5 százalékos CO2 inkubátorban.
3) Sejtéletképességi vizsgálat (MTT vizsgálat)
Az MTT assay mérte a sejtek életképességét és meghatározta az MHE citotoxicitását. A sejteket 5×103 sejt/lyuk arányban egy 96-lyukú lemezre oltottuk, és 24 órán keresztül sejttenyészetben tenyésztettük.körülmények. Ezután a táptalajt eldobtuk, a sejteket foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS, 21-040-CV; Corning, USA) mostuk, a sejteket új szérummentes táptalajba helyeztük, ésa sejteket {{0}}.01, 0.025, {{10}}.05. a minták 0,10, 0,25, 0,50, 0,75 és 1.{15}} százalékát, és a sejteket 24 és 48 órán keresztül inkubáltuk. Ezután 100 μl MTT oldatot adtunk hozzá(0,5 százalék , 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazólium-bromid) mindegyikhez jól inkubáljuk a sejteket további 2 órán át. A táptalaj eltávolítása után 100 μl 100 százalékos dimetil-szulfoxidot (DMSO) adtunk hozzá, 10 percig ráztuk a sejteket, majd mikrolemez-leolvasóval (Epoch 2 microplate reader, BioTek, USA) mértük az abszorbanciát 590 nm-en.
4) Pro-kollagén I-es típusú generáció mérése
Az I-es típusú prokollagén koncentrációját a sejttenyésztő tápközegben a kereskedelemben kapható ELISA kit (Procollagen Type I C-peptide EIA Kit, MK101, TaKaRa) segítségével mérték.Bio, Japán) a gyártó utasításai szerint. Minden mintát három ismétlésben elemeztünk.
5) Az mRNS expressziós szintjének mérése kvantitatív módszerrel
Valós idejű polimeráz láncreakció (qRT PCR) A sejteket 1×105 sejt/lyuk arányban oltottuk be 6-lyukú lemezekre. A HDFn sejteket 24 órán át tenyésztettük; majd a sejteket 24 órán keresztül szinkronizáltuk FBS nélküli, magas glükóztartalmú DMEM-mel. A táptalajt szérummentes táptalajra cseréltük, és a minták 0.05, 0.10, 0,25, 0,5 és 0,75 százalékos koncentrációjával kezeltük. 24 és 48 órán keresztül. Az RNS extrakciót a HDFn sejtekkel RNS extrakciós készlettel (TaKaRa MiniBEST Universal RNA extraction kit, 9767A, Takara Bio, USA) végeztük, és a mintákat a gyártó protokollja szerint tisztítottuk. Az izolált RNS-t (1 ug) cDNS-vé szintetizáltuk egy TR reagenskészlet (PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser, RR047A, Takara Bio, USA) segítségével. SYRB Green Realtime PCR Master Mix (Power SYBRTM Green PCR Master Mix, 4367659, Applied BiosystemsTM, USA) és QuantStudioTM 3 (QuanStudioTM 3 Real-Time PCR műszer, A28132, Thermo Fisher Scientific, USA) segítségével a valós idejű PCR gép a génexpressziós szinteket a gliceraldehid 3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) housekeeping génre standardizálták. A vizsgálatban használt primereket a 2. táblázat mutatja be. A kísérleteket két párhuzamosban végeztük három független ismétléssel. Olvadási görbe elemzésminden primer készletre elvégeztük.
6) Western blot analízis
A fibroblaszt sejtekből származó fehérjelizátumokat lízispufferrel (EzRIPA Lysis Kit, WSE{0}}; ATTO Corporation, Japán) extraháltuk. A fehérjék mennyiségi meghatározására a Bradford-módszert alkalmazták.Egyenlő mennyiségű fehérjét kevertünk össze 5X mintapufferrel (TLP-102-01, TransLab, Korea), és 99 fokon 10 percig denaturáltuk. A fehérjéket 10%-os SDS-PAGE-val választottuk el 150 V-on 150 percig, és PVDF membránokra vittük (Clear Blot Membrane, 3322546, ATTO Corporation, Japán). A membránokat 0,5 százalékos szarvasmarha-szérumalbuminnal (BSA, A4503-10G; Sigma) blokkoltuk 1 órán át, majd Tris-pufferolt sóoldattal mostuk, amely Tween-20-t tartalmazott (10X TBS Tween 30-zal, TR{ {17}}; Biosesang, Korea) háromszor; a membránokat ezután MMP-1 (Rekombináns Anti-MMP1 antitest [EP1249Y], ab134184, Abcam, USA), -Actin (Anti- -Actin (N-tern) és PA0207 (Abfrontier) elleni elsődleges antitestekkel inkubáltuk. Öblítés után a membránokat másodlagos antitestként anti-nyúl IgG-torma-peroxidázzal (HRP) (Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody, #7074; Cell Signaling Technology, USA) kezeltük. A kemilumineszcenciás detektálást az ECL Prime Western blot detektáló reagens (GE Healthcare, USA) és az ATTO WSE-6100 LuminoGraph (ATTO Corporation, Japán) segítségével végeztük. A kvantitatív elemzéshez a rögzített képeket az Image programmal elemeztük. szoftver (CS analizátor 4, ATTO Corporation, Japán).
7) Statisztikai elemzés
A statisztikai elemzést a GraphPad Prism 3.03 for Windows (GraphPad Software, USA) verziójával végeztük. Az eredményeket 3 kísérlet átlag±SD-jeként mutatjuk be. Egy páratlanStudent-féle t-próbát és p értékeket használtunk<0.05 were considered statistically significant.
2. In vivo hatásosság értékelése
1) Reagensek és kozmetikai termékek
A teszttermékek bőrápoló, esszenciális krém és szemkrém voltak; ezek a krémek 1 százalékban tartalmazták az MHE-t hatóanyagként a 3. táblázatban.
2) Emberi résztvevők
Valamennyi önkéntes beleegyezett a teszt céljába és tartalmába, és a teszt megkezdése előtt aláírta a beleegyező nyilatkozatot. Más bőrápoló terméket nem használhattak, a teszttermékeket bőr-szemkrém (csak szarkalábakra)-esszencia krém-tejkrém sorrendben kenték fel az arcra. A vizsgálatot a Helsinki Nyilatkozat irányelvei szerint végezték, és a Koreai Nemzeti Bioetikai Politikai Intézet Intézményi Felülvizsgáló Testülete (#P01-202108-13-001) hagyta jóvá.
3) Hatékonysági teszt
Huszonegy, 45 és 55 év közötti (átlag ±SD 50,81±2.86) év közötti normál bőrű nő vett részt ebben a vizsgálatban. A teszttermékeket naponta kétszer (reggel és este) alkalmaztuk 4 héten keresztül. A résztvevők 2 hetente jártak a kutatóközpontban, a teszthelyeket laboratóriumban mérték, ahol a környezeti hőmérsékletet 22±2 fokon, a relatív páratartalmat 50±5 százalékon tartották. A résztvevők 20 percig akklimatizálódtak a laboratóriumban az arcmosás után, és megvizsgálták a bőr hidratáltságát, rugalmasságát, textúráját és szarkalábakat. A bőr hidratáltságát Corneometer® CM825 (C plus K electronic GmbH, Köln, Németország) segítségével mértük; a rugalmasságot Cutometer® MPA 580 (C plus K electronic GmbH, Köln, Németország), a textúrát és a szarkalábakat pedig DermaTOP 3D-HE (EOTECH SAS, francia) készülékkel mértük.
4) A bőr nemkívánatos reakcióinak értékelése
A mellékhatásokat minden látogatáson kérdőívvel és megfigyeléssel ellenőriztük. Az értékelés során a szubjektív paramétereket a viszketés, szúró, csiklandozó, égő, csípő,merevség és feszülés, az objektív paraméterek pedig erythema, ödéma, pikkely és papulák voltak.
5) Statisztikai elemzés
Az adatokat az SPSS® szoftverrel elemeztük. Az időpontok közötti különbségek statisztikai szignifikanciáját ismételt mérések elemzésével határoztuk meg; egy p-érték<0.05 statisztikailag szignifikánsnak számított. Az alapértékhez viszonyított változási arányt ( százalék ) a következőképpen számítottuk ki:
Változási arány=((kezelés után – kiindulási érték)/alapvonal) × 100 százalék
