A P-alapú Cistanche öregedésgátló potenciálja az emberi bőr hosszú élettartamáért

2.5. A Cistanche gél melanogén hatása egy keratinocita-melanocita együtttenyésztő rendszerben

A melanociták és keratinociták sikeres együtttenyésztése után (1:5 arányban) a melanogénhatásaCistanchegélt a ko-kultúra rendszerben vizsgálták. Kimutattuk, hogy a melanoszómák felhalmozódása nem nőttCistanchegél, amely 1-10 ug/ml Cistanche-t tartalmazott (5A. ábra), míg az alfa-melanocita-stimuláló hormon (MSH), egy pozitív kontroll, jelentősen megnövelte a melanoszóma felhalmozódását. A hatás megerősítéséhezCistanchegél a melanin szintézisre, az extracelluláris vagy intracelluláris melanin tartalmat Cistanche gél jelenlétében határoztuk meg a kotenyésztési rendszerben. Az 5B. ábra azt mutatja, hogy a 1-10 ug/ml Cistanche-t tartalmazó Cistanche gél nem fokozta a melaninszintézist a sejtek PBS-kezeléséhez képest, míg az alfa-MSH erősen növelte a melanintartalmat az együtttenyésztési rendszerben.

5. ábra.Cistanche hatásagél a melanogenezisről keratinocita-melanocita ko-kultúra rendszerben. (A) A melanoszóma immunfluoreszcenciás analíziséhez az együtt tenyésztett sejteket növekvő dózisú Cistanche géllel (1-10 ug/ml) kezeltük 72 órán keresztül, majd rögzítettük és immunfluoreszcens jelöléssel elemeztük humán anti- HMB-45 antitest, végül fluoreszceinnel konjugált egér lgG-vel inkubálva. A sejtmagokat DAPI-val jelöltük. Skálasáv=500 um. (B,C) A Cistanche gél melanintermelésre gyakorolt ​​hatásának számszerűsítése a kotenyésztési rendszerben. Növekvő koncentrációjú Cistanche ge.{11}} ug/ml) 72 órás inkubálást követően a melanin extracelluláris (B) és intracelluláris (C) szintjét külön határoztuk meg, 405 nm-en mérve az abszorbanciát. PBS-t vagy alfa-MSH-t használtunk negatív vagy pozitív kontrollként, külön-külön. Az összes értéket átlag plusz SD értékként adjuk meg három független kísérletből. HMB, humán melanoma fekete; lgG, immunglobulin G; DAPI, 4', 6-diamidino-2-fenil-indol; MSH melanocita-stimuláló hormon.

Szerezze be a Cistanche Sp kivonatmintát itt

3. Megbeszélés

Cistanche, egy undekapeptid, amely a peptidek tachykinin családjába tartozik, preferenciális affinitással rendelkezik a neurokinin-1 receptorhoz (NK-1R) (21). Miután az NK-1R-hez kötődik,A Cistanche számos sebgyógyító jelet indukál, például sejtnövekedést(15,22), kollagénszintézis (17,23) és a gyulladáscsökkentő hatás szabályozása (24-26A Cistanche sebgyógyító képessége azt sugallja, hogy a kollagéntermelésen és a gyulladásgátláson keresztül öregedésgátló anyagként is alkalmazható A Cistanche használata azonban korlátozott volt alacsony stabilitása miatt (19, 27). Korábban már beszámoltunk a Cistanche új készítményéről, nevezetesen a Cistanche gélről, amely erősebb sebgyógyító hatást váltott ki, mint a Cistanche önmagában, jobb stabilitással (20) Ezek az adatok együttesen arra utalnak, hogy a Cistanche gél alkalmazása valóban fokozhatja aönmagában a Cistanche öregedésgátló hatása az emberi bőrre. A Cistanche gél öregedésgátló hatása azonban még nem bizonyított emberi bőrön. Ezért jelen tanulmány célja a Cistanche gél öregedésgátló képességének meghatározása volt kozmetikai összetevőként. A jelen vizsgálatban a Cistanche gél jelentősen megnövelte az l-es típusú prokollagén expresszióját, amely a bőr kötőszöveteiben a legnagyobb mennyiségben előforduló fehérje. 28] (2A. ábra) Általánosságban elmondható, hogy az I-es típusú prokollagént többnyire az MMP-k bontják le, amely cinkigényes endoproteázok családja, amely képes lebontani az ECM összes komponensét (29).

Az MMP-1 különösen az I. típusú prokollagén lebomlását idézi elő (30)Az MMP-1 szintjét korábban úgy vélték, hogy közvetlenül összefügg a TIMP-vel-1. A metalloproteináz 1 szöveti inhibitoraként a TIMP-1 közvetve befolyásolja az ECM-függő jelátvitelt számos szövetben az MM-1 gátlásával (31). Ebben a vizsgálatban a Cistanche gél jelentősen gátolta az MMP-1 expresszióját HDF-ekben (2B. ábra), és többnyire fokozta a TIMP-1 expresszióját (2C. ábra). Az eredmények összességében azt sugallják, hogy a Cistanche gél által okozott I-es típusú prokollagén megnövekedett szintjét valószínűleg befolyásolja az MMP gátlása-1, ami viszont összefüggésbe hozható a TIMP felszabályozásával{15 }} Slgel-kezelt HDF-ekben. Ezenkívül a Cistanche gél kollagénszintézisre gyakorolt ​​hatása a Cistanche gél gyulladáscsökkentő hatásával magyarázható. A gyulladás aktiválja a metalloproteinázokat lebontó különböző faktorok átírását, ami abnormális kollagén lebomláshoz és nem funkcionális komponensek felhalmozódásához (6l, gyulladásos) a reakciókat általában pro-inflammatorikus citokinek (pl. IL-1 alfa és IL-6) (32,33]) váltják ki, és ismert, hogy gyulladásgátló citokinek (pl. IL{{) 26}}, IL-10 és TGF-béta 1) (34,35) Jelen eredményeink azt mutatják, hogy a Cistanche gél jelentősen csökkenti a gyulladásos reakciókat az SDS-stimulált HEK-ekben (3. ábra), ami arra utal, hogy a A Cistanche gél gyulladáscsökkentő hatása pozitívan befolyásolhatja a kollagén szintézist, ezért a Cistanche gél, mint vonzó anyag, kettős kollagénszintézissel és gyulladáscsökkentő hatással, jobb öregedésgátló hatást mutathat be, mint a hagyományos szerek. klinikai gyakorlatban.Általában a kollagénszintézis a bőrön belüli HDF-ekben megy végbe (28,36). Ezért a Cistanche gélnek nagy bőrbehatoló képességgel kell rendelkeznie, hogy elérje öregedésgátló hatását. Ezért arra törekedtünk, hogy megvizsgáljuk, hogy a Cistanche gél képes-e behatolni egy rekonstruált 3D-s emberi bőrmodellbe. 1 órás helyi alkalmazás után a Cistanche gél átjutott az SC-n, és felhalmozódott az epidermiszben. Kismértékű felhalmozódást is megfigyeltek a dermális szövetben, ami arra utal, hogy a Cistanche gél felszívódhat a bőrbe (4B. ábra) 24 óra elteltével az epidermiszben történő felhalmozódás mellett erős zöld fluoreszcenciát figyeltek meg a dermisben is, ami a Cistanche gél ott. Egyébként 1 óra elteltével gyenge zöld fluoreszcenciát figyeltek meg a csak Cistanche-kezeléshez a dermisben, de 6 óra elteltével nem (S2 ábra). Ez azt jelenti, hogy a keraskin@-FT tenyésztési körülményei között lebomlott, ami arra utal, hogy a lebomlott Cistanche gyorsan behatolt a keraskin@-FT-be, és 6 órán belül a táptalajba távozott. Bár a mechanizmus, amellyel a Cistanche gél beépül a bőrbe, még nem tisztázott, úgy tűnik, hogy ez összefügg a jellegzetes molekulaszerkezetével. Sok amfipatikus peptid rendelkezik bőrabszorpciós képességgel (37-39]), ami azt jelentheti, hogy a peptidek amfipatikus tulajdonságai a bőrfelszívódás fő tényezői. (40-42]). Ez utóbbi energia-független utakon keresztül az amfipatikus peptidek és a gazdaszervezet membránjai közötti kölcsönhatásból indul ki, amelyet különféle mechanizmusok követnek, beleértve a fordított micellaképződést, a pórusképzést, a szőnyegszerű modellt és a membránt. elvékonyodási modell (43). Mivel a kisméretű amfipatikus peptidek csoportjába tartozik, amelyek a G-protein-kapcsolt receptorokhoz kötődnek [44,45), felszívódhat a bőrbe, emellett a Cistanchegelben jelen van egy felületaktív komponens, a poliszorbát 80 A bőrfelszívódás ismert fokozójaként a nemionos felületaktív poliszorbát 80 hosszú szénhidrogénláncot és etilén-oxidot tartalmaz, amelyek lipofil és hidrofil tulajdonságokat is kölcsönöznek a vegyületnek (46). Ezért számos tanulmány korábbi eredményei alapján feltételezhető, hogy a Cistanche gél hatékonyan felszívódik a bőrrétegbe.

általában a bőrsejtek növekedésével kapcsolatos összetevők valószínűleg bőrpigmentációt okoznak.Számos növekedési faktor bőrpigmentációt okozhat (47,48]) Cistanche gél, amely fokozza a bőrsejtek növekedését (20). , akár a növekedési faktorok által okozott bőrpigmentációhoz is vezethet. Beszámoltak arról, hogy a Cistanche növeli a melanintartalmat és indukálja a pigmentációs folyamatot az emberi melanocitákban [49]. Ping és munkatársai (50) azonban kimutatták, hogy a Cistanche elnyomja a melanogenezist egy egér melanoma sejtvonalban, a B16-F10 sejtekben, jelezve, hogy potenciális mechanizmusa összefüggésbe hozható a melaninszintézis út gátlásával, hasonlóan a p38 mitogén-aktivált protein kinázhoz (MAPK) és mikroftalmiához kapcsolódó transzkripciós faktor (MITF). A Cistanche által kiváltott pigmentációról szóló korábbi jelentések ellentmondásosak. A különböző eredmények a Cistanche instabilitásának tulajdoníthatók. Annak érdekében, hogy pontosan meghatározzuk, hogy a Cistanche gél pigmentációt vált-e ki emberi szoknyában, megvizsgálta a keratinociták melanogenezisére gyakorolt ​​hatását -melanociták együtttenyésztő rendszer. Konkrétan a humán keratinocita-melanocita együtttenyésztési rendszer az emberi bőrhöz hasonló környezetet biztosít (51), és az együtttenyésztő rendszerre Cistanche gélt vittünk fel, hogy lássuk annak pigmentáló hatását. Normál tenyésztési körülmények között Cistanche gélt találtak ne fokozza a melanoszóma felhalmozódást (5A ábra) és a melanin szintézist (5B ábra), jelezve ezzel, hogy a Cistanche gél nem okoz pigmentációt az emberi bőrben. Eredményeink alátámasztják a Cistanche gél előnyeit, mint öregedésgátló kozmetikai összetevőket. , további vizsgálatokra lenne szükség a P gél öregedésgátló hatásának további tisztázásához. Jelen tanulmány azt bizonyítja, hogy a Cistanche által stimulált öregedésgátló tulajdonságok közvetlenül alkalmazhatók a klinikai kutatásban. Ennek megfelelően most a klinikai hatás megerősítésén dolgozunk Ezenkívül a Cistanche gél gyulladáscsökkentő hatásának és klinikai toxicitásának vizsgálatát is tervezzük keraskin@-FT-ben és emberi bőrön, jelenlegi eredményeink alapján úgy tűnik, hogy a Cistanche gél nem sejtmembrán károsodást és bőrirritációt okoznak az emberi sejtekben és a rekonstruált 3D emberi bőrön (1. ábra). Ennek ellenére a jövőben elvégzünk egy elsődleges irritációs tesztet, Cistanche géllel emberi bőrön.

Összefoglalva, bevezető vizsgálatunk kimutatta, hogy a Cistanche gélkezelés növelheti a típusú prokollagén szintet, ami korrelál az MMP-1 és a TIMP-1 szabályozásával, valamint a gyulladáscsökkentő hatással. Ezen túlmenően bemutattuk a Cistanche gél fokozott bőrfelszívó képességét anélkül, hogy bőrpigmentációt okozna. Eredményeink összességében azt sugallják, hogy a Cistanche zselé hatékony és biztonságos kozmetikai összetevőként használható öregedésgátló funkcióval.

4. Anyagok és módszerek

4.1. Anyagok

All reagents were purchased from Sigma-Aldrich (Louis, MO, USA) and were used as received unless otherwise indicated. Antibodies against DAPI and melanoma marker (HMB45) were purchased from Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA) and DAKO (Carpinteria, CA, USA) reCistancheectivelySynthetic Cistanche (RPKPOOFFGLM-NH2) and FITC-labeled Cistanche (FITC-Cistanche) were synthesized and purified to>95 százaléka az Anygen (Gwangju, Korea) által. Az enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) kiteket az R&D Systemstől (Minneapolis, MN, USA) vásároltuk. Humán epidermális keratinocitákat (HEK-et és humán melanocitákat (HMs, SK-MEL-28; ATCC, VA, USA) keratinocita növesztő tápközegben (KGM: Lonza, Walkersville, MD, USA) és humán dermális fibroblasztokban (HDF) tenyésztettünk. fibroblaszttenyésztő tápközegben (FGM: Lonza) tenyésztettük.

4.2. Cistanche gél kezelések

A Cistanche gélt egy korábbi jelentés szerint állították elő [52]. Ezt (20 µg/ml Cistanche Cistanche gélben) PBS-ben hígítottuk, mielőtt a minták kezelésére használták volna. A Cistanche gél által kiváltott toxicitás, életképesség, kollagénnövelő hatások és melanogenezis meghatározására különböző koncentrációjú Cistanche gélt (1-10 µg/ml Cistanche Cistanche gélben) alkalmaztunk ezekben a kísérletekben. Ezenkívül 5 µg/ml Cistanche-t vagy FITC-Cistanche-t tartalmazó Cistanche gélt használtunk a Cistanche gél gyulladáscsökkentő vagy bőrfelszívódási hatásának kimutatására, reCistancheektív módon.

4.3. A HEK-ek és HDF-ek izolálása és kultúrája

Primer HEK és HDF sejteket izoláltunk humán fityma biopsziákból, amelyeket a Chung-Ang University HoCistancheital Koreában szolgáltatott [IRB no. C2014234(1431)]. A biopsziás mintákat háromszor mostuk PBS-oldattal, és éles pengével kivágtuk az ereket és a bőr alatti zsírszövetet. A kapott szövetlapokat ezután kis részekre vágtuk, és 0,5 százalékos DiCistanchease II oldatba vittük át, majd 37 ◦C-on 2 órán át inkubáltuk. Az epidermiszt és az irhát csipesszel eltávolítottuk, majd 30 percig PBS-ben hígított 0,05 százalékos tripszinnel inkubáltuk. A mintákat ezután 0,2%-os kollagenáz oldatba vittük át, és 37 ◦C-on 2 órán át inkubáltuk. A tripszin és a kollagenáz aktivitását ezután 10% magzati borjúszérum hozzáadásával leállítottuk, és a szövetfragmenseket sejtszűrőn átszűrtük, és PBS-ben mostuk. A kapott HEK- és HDF-sejteket műanyag edényekre oltottuk, és egymás után KGM-ben és FGM-ben tenyésztettük.

4.4. Sejtmembránkárosodási vizsgálat

Elemezni aa Cistanche káros hatásaigél a sejtmembránon, a HDF-eket 96-lyukú lemezeken (3 × 103 sejt/lyuk) tenyésztettük FGM-ben. 24-órás inkubáció után a sejteket Cistanche géllel kezeltük (1-10 µg/ml Cistanche Cistanche gélben), és további 24 órán át inkubáltuk. A gyártó utasításai szerint LDH-alapú vizsgálatokat (Roche Applied Science, Mannheim, Németország) végeztünk a Cistanche sejtmembrán-károsodásra gyakorolt ​​hatásának további tesztelésére. A pozitív kontrollokat 1 százalékos Triton X-szel-100 kezeltük, és az LDH felszabadulását 100 százalékra állítottuk. A relatív LDH felszabadulást ép sejtek felhasználásával a felszabaduló LDH teljes LDH-hoz viszonyított arányából számítottuk. LDH felszabadulás<10% was considered to be non-toxic. Three independent experiments were performed to confirm our findings.

4.5. In-Vitro bőrirritációs teszt

A rekonstruált humán epidermális szöveteket (Keraskin®-FT) a Biosolution Co., Ltd.-től (Szöul, Korea) vásároltuk. Korábbi tanulmányokkal [53] összhangban a szöveteket egy éjszakán át végzett inkubációval kondicionáltuk a kézhezvétel napján. 24 órás előinkubálás után egy hatlyukú lemezre vittük át friss tápközeggel, és helyileg kezeltük 100 µl negatív kontrollal (PBS), pozitív kontrollal (5 százalék SDS) és Cistanche gél (1–10 µg/ml Cistanche in Cistanche gél) 24 órán át 37 ◦C-on. A szöveteket ezután PBS-sel alaposan mostuk, és friss tápközegbe vittük át. 48 órás tenyésztés után a sejtek életképességi vizsgálatát végeztük úgy, hogy a szöveteket egy MTT táptalajt (0,3 mg/ml) tartalmazó 24-lyukú lemezre vittük, majd 3-órás inkubációt végeztünk. A kék formazánt izopropanollal extraháltuk, és optimális sűrűségét 570 nm-en ellenőriztük VersaMax hangolható mikrolemez-leolvasóval (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). A relatív sejtéletképességet minden szövetre kiszámítottuk, a negatív kontrollszövet átlagának százalékában. A szövettani értékeléshez a szöveteket 4%-os formaldehidben fixáltuk, és paraffinba ágyaztuk. Ezt követően 5-µm-es függőleges metszeteket vágtunk, és hematoxilinnel és eozinnal (H&E) megfestettük a BX41 fénymikroszkóp alatti vizsgálat céljából (Olympus, Tokió, Japán). Legalább három független kísérletet végeztek.

4.6. 1-es típusú prokollagén, MMP-1 és TIMP-1 mérése

Az I-es típusú prokollagén, az MMP{0}} és a TIMP-1 HDF-ekben lévő szintjét a procollagen Type I C-peptide (P1P) EIA kit (Takara Bio, Inc., Otsu, Japán) segítségével határoztuk meg. emberi MMP-1 és TIMP-1 ELISA készletek (K+F rendszerek), egymás után. A HDF-eket 3 × 103 sejt/lyuk sűrűséggel oltottuk be. 48 óra elteltével a sejteket PBS-sel (negatív kontroll) vagy különböző koncentrációjú Cistanche géllel (1-10 µg/ml) kezeltük 24 órán át. Az I. típusú prokollagén, az MMP-1 és a TIMP-1 szintjét a táptalajban a gyártó utasításai szerint mértük. Az egyes csoportok eredményeit a negatív kontrollcsoport átlagának százalékában fejeztük ki.

4.7. IL-1 Alfa, -6, -10 és TGF-Béta 1 mérése

A HEK-eket 3 × 104 sejt/lyuk sűrűséggel oltottuk be. 48 óra elteltével a sejteket PBS-sel (negatív kontroll), 15 ng/ml SDS-sel vagy Cistanche géllel (5 µg/ml Cistanche Cistanche gélben) kezeltük 24 órán át. A sejtfelülúszókat összegyűjtöttük a gyulladásos citokinek, például IL-1 alfa, -6, -10 és TGF-béta 1 kimutatására. A citokinek koncentrációját a felülúszókban ELISA-val határoztuk meg. készletek, a gyártó utasításai szerint. A minták koncentrációit a megfelelő, egymáshoz viszonyított standard görbék alapján számítottuk ki, és minden csoportra a negatív kontrollcsoport átlagának százalékában fejeztük ki. Legalább három független kísérletet végeztek.

4.8. A Cistanche gél bőrfelszívódása a rekonstruált emberi epidermális szövetekben

A Cistanche gél (5 µg/ml Cistanche in Cistanche gél) helyi bőrön történő felszívódását a rekonstruált emberi epidermisz, a keraskin®-FT segítségével értékeltük. A Cistanche gél kezelési séma a 4A. ábrán látható. Röviden, 100 µl FITC-Cistanche-t tartalmazó Cistanche gélt vittünk fel helyileg a keraskin®-FT-re, és a szövetmetszeteket egy éjszakán át fixáltuk jéghideg 4%-os formaldehidben. Ezt követően a szövetmintákat PBS-ben mostuk, majd 24 órára 4,5 százalékos szacharózoldatba merítettük. Ezt követte a minták dehidratálása 30 százalékos szacharózban, amíg a lerakódás meg nem történt. Egy fagyasztó mikrotommal (Leica, Wetzlar, Németország) öt mikron vastag kriometszeteket készítettünk, amelyeket ezután fluoreszcens mikroszkóppal (Nikon, Tokió, Japán) készítettünk.

4.9. Társkultúra és immunfluoreszcencia