huNyelv
Haza / Tudás / Tartalom

Tudás

A Ceriporia Lacerata micélium táptalaj, mint új öregedésgátló mikrobiális anyag kozmetikai alkalmazásra

Mar 27, 2023

Absztrakt:Bőrápoláskritikus fontosságú az öregedés és a bőrproblémák megelőzésében, amelyek előrehaladása esetén nehéz helyreállítani. A fejlesztés azonban hatékonyöregedésgátló megoldásokmég mindig a láthatáron van. A tanulmány célja a funkcionális hatékonyság értékelése voltCistancheszéttépexo-gyógyszerészeti anyag (CLEPS), tekintettel az innovatív bőrápoló kozmetikumokban való felhasználására. A CLEPS-ről azt találták, hogy nincs citotoxicitása a normál humán dermális fibroblasztokkal és a B16 melanoma sejtekkel szemben széles, 0,05–7 mg/ml koncentrációtartományban. Aztfehérítő hatást mutatott a melaninszintézis gátlásával, amely összehasonlítható a megfelelő referenciavegyülettel(arbutin). A CLEPS nemcsak jelentősen növelte a kollagén (65,4 százalék) és a filaggrin szintézist (36 százalék), hanem jelentősen gátolta a kollagenáz aktivitását is (93,4 százalék), ami arra utal, hogy a CLEPSmegakadályozza a bőr barrier károsodásátvagybőr ráncai. Ezen kívül kiválót mutatottgyulladáscsökkentőhatás és sebgyógyító hatás. Összességében a CLEPS kiállítottkivételesöregedésgátló hatások az emberi bőrsejtekben, kijelölve potenciális természeteskozmetikai összetevő.

Kulcsszavak:Cistanchelacerata; öregedésgátló; gyulladáscsökkentőn; antioxidáns; anti-kollagenáz; filaggrin upregulation;fehérítés; sebgyógyulás

Skincare Cistanche (2)

Kattintson ide, hogy megtudja, hogyan működik a Cistanche a bőrápolásban

1. Bemutatkozás

Más szervek mellett az emberi bőr élvonalbeli határfelület, amely folyamatosan ki van téve a káros külső ingereknek, mint például az általános anyagcsere-reakcióknak, a kozmetikumoknak és az ultraibolya (UV) besugárzásnak. Ezek a tényezők nemkívánatos biokémiai melléktermékekhez vezetnek, beleértve a reaktív oxigénfajtákat (ROS), a mátrix metalloproteinázokat (MMP-ket) és a fejlett glikációs végtermékeket (AGE), amelyek kiválthatják a bőr öregedését, beleértve a ráncokat, a pigmentációt és a bőrtónus elvesztését.1,2]. A veszélyes oxigénmolekulák, mint pleiotróp fiziológiás jeltovábbítók, főként a kollagén és az elasztin térhálósodását idézik elő, hogy ráncokat idézzenek elő, és csökkentsék a bőr regenerálódását, amelyeket az UV-sugarak és a környezetszennyezés okozta öregedés fő hajtóerejének tekintenek [3]. Az MMP-k UV-sugárzás vagy gyulladás által aktivált enzimek, amelyek hozzájárulnak a kollagén lebomlásához, miközben gátolják az új kollagén képződését.1]. Az AGE-k képződése a glükóz fehérjékkel, köztük a bőr kollagénjével való reakciójának eredménye, ami hozzájárulhat a rugalmasság elvesztéséhez, a ráncokhoz, gyulladásokhoz, a bőrsejtek növekedésének gátlásához és az öregedés felgyorsulásához.2]. Mivel az oxidatív stressz a sejtek öregedésével leginkább összefüggő metabolikus tényezők és útvonalak egyike, az antioxidáns hatású funkcionális élelmiszerek és funkcionális kozmetikumok fogyasztása jelentősen növekszik. Ezért az antioxidánsok előnyösek lehetnek az emberi szervezet számára azáltal, hogy közvetlenül vagy közvetve semlegesítik a ROS-t, szabályozzák az anyagcsere-utakat és a génexpressziót, mint a fő sejtaktivációs mechanizmusokat. A mikrobiális forrásokból származó természetes metabolitokat számos területen alkalmazták táplálkozási forrásként és bőrápolóként [4]. Közülük a gombákból származó metabolitok jelentős kereskedelmi értékű biológiailag aktív összetevőket tartalmaznak, beleértve az oligoszacharidokat, exopoliszacharidokat (EPS), enzimeket, peptideket, vitaminokat és biofelületaktív anyagokat. Ezeket a metabolitokat széles körben használják gyógyszerek, funkcionális élelmiszerek és kozmetikai termékek fő nyersanyagaként (5-9]). Több ezer antioxidánssal és gyulladáscsökkentő tulajdonsággal telve széles körben alkalmazzák őket az öregedés elleni küzdelemben a bőr állapotának javításával. természetes védekező, a bőr rugalmasságának helyreállítása, a nedvességtartalom növelése, a kollagén szintézis elősegítése, bőrfehérítő hatások (4,5) Ezen túlmenően ezeket a vegyületeket a hagyományos kémiai összetevőket helyettesítő különféle kozmetikai termékekben alkalmazzák a bőr egészségének és szépségének javítására. Az emberiség számára biztonságos és méregtelenítő módon. Különösen a gombás EPS egyedülálló biokompatibilitását, nem toxicitását és funkcionalitását széles körben alkalmazzák a kozmetikai iparban (4). Például olyan metabolikus vegyületeket, mint a skizofillán, a p{ poliszacharidja. A Schizophyllum commune-ból kivont, p-1,6 elágazású P-glükánról ismert, hogy elősegíti a bőr gyulladáscsökkentő és UV-védő hatását (101. Galactomyces fermentszűrletet (GFF) izoláltak a Galactomycescandidumtól az arcbőr pórusainak csökkentésére, a bőr pigmentációjára és az oxidatív stressz enyhítésére kifejtett kozmeceutikai hatások tanulmányozására, miközben a GFF EPS hátterében meghúzódó hatásmechanizmusok és annak összetételére vonatkozó információk még mindig ismeretlenek (11). A Cistanche lacerate a fehér-rothadt fonalas gomba egyik fajtája, amely fontos szerepet játszik a bioremediációban a cellulóz és a lignin lebontásával (12,13]) A C. lacerata micélium bioaktív hatékonysága (A CLMculture-t a hiperglikémia szintjének szabályozására tanulmányozták (14) , inzulin szekréció citoprotektív hatáson keresztül (15), és inzulin jelátvitel az AMP-aktivált protein kináz (AMPK) és a 4-es típusú glükóz transzporter (GLUT4) aktiválásán keresztül (16,17. A CLM farmakológiai hatása az antioxidációra és az antioxidánsokra -az öregedés még nem ismert.

Skincare Cistanche (24)

A kulturáltC. laceratamikroszkopikus polipórusokból áll; így úgy néz ki, mint egy fehér moha (ábra1a) A folyékony tenyésztési folyamat során a környezeti feltételektől függően különböző másodlagos metabolitok, pl. exo-metabolitok keletkeznek (ábra1b). A C. lacerate-ről vagy a CLM-ről azonban nem számoltak be a bőrápolással összefüggő hatásokról. Ezért ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy megvizsgálja a CLM antioxidáns, sebgyógyító, ránctalanító, hidratáló és fehérítő hatását a bőrsejtek öregedésgátló mechanizmusára. Legjobb tudomásunk szerint ez a tanulmány az első olyan jelentés, amely új módszert javasol a sejtszintű bőrápoláshoz, amely az öregedésgátló mechanizmuson alapul, amely a CLM, egy feltörekvő mikroorganizmus tenyészetéből származó antidiabetikus összetevőket használ.14–17]. 

Skincare Cistanche

Skincare Cistanche

1. ábra. Zöld gyártási módszerCistanche lacerataexo-gyógyszerészeti anyag (CLEPS), beleértve a szilárd tenyészetet is

a) és a következő folyamatok (b), mint például előtenyésztés (i), főtenyésztés (i) és szűrés (i).


2. Anyagok és módszerek
2.1. Cistanche Lacerata exo-gyógyszerészeti anyag készítmény
A kísérletben használt törzset CLM (FugenCellTech,Sangju, Korea) burgonya dextróz agaron (PDA, Difco. Co., Sparks, MD, USA)
és tenyészteni 25 évesen◦C 9 napig. A kultúrlevesC. laceratamicélium volt preburgonya dextróz lében tenyésztjük 10 napig. Az előtenyésztés befejezése után a micéliumtenyésztő tápközeget glükózzal (12,5 g/l), burgonyakeményítővel (2,5 g/l), zsírtalanított szójával (5 g/l) és növényi olajból származó zsírsavak glicerin-észtereivel kevertük össze ( 0,12 g/l) mintegy habzásgátlóágens, majd további 11 napos inkubáció 23-án◦C. Elvételévelcentrifugálása csapadék elválasztásához a táptalaj tiszta felülúszójaA CLM-et ultraszűrési technikával ultraszűrtük, poliszulfon membránt alkalmazva3,6-8.{3}} m-rel2(levágott molekulatömeg: 30-100 kDa). A törzsoldat (100 százalék).A CLEPS-t feloldottuk a tenyészoldatban és felhasználtuk az összes biológiai elemzéshezoldószer, társoldószer, reagens vagy vegyszer hozzáadása nélkül működik, ami megerősítibiológiailag biztonságos és kiváló minőségű zöld kozmetikai összetevők.


2.2. Antioxidáns aktivitás mérése2.2.1. 2,2-difenil-1-pikril-hidrazil-hidrát (DPPH)

Befogó aktivitási vizsgálat A CLEPS szabad gyökfogó képességét DPPH gyökfogó fotometriás vizsgálattal teszteltük Choi és munkatársai által leírt módszertan szerint. (18] és Kedare et al. (19. A CLEPS-t 90 mM metanolos DPPH-val kevertük össze, hogy a végső oldat koncentrációja 0,5, 1 és 5 mg/ml legyen {{7}-ben). }lyukas lemezeket, amelyeket 30 percig 25 fokon inkubáltunk, és az abszorbanciát (OD) mikrolemez-leolvasóval (Multiskan GOThermofisher Scientific, Waltham, MA, USA) olvastuk le 517 nm hullámhosszon. Három független kísérlet Pozitív kontrollként aszkorbinsavat (AA, 1 mg/ml) használtunk A DPPH gátlási százalékot az alábbi képlet alapján számítottuk ki: DPPH megkötő százalék=kontroll A0 - minta A1/kontroll A0] x 100, ahol A1 a minta, míg A0 a kontroll (a DPPH metanolos oldata) abszorbanciáját jelöli.

Skincare Cistanche (15)

2.2.2. 2,2-Azinobisz-(3-etil-benzotiazolin-szulfonsav) (ABTS)

Gyökfogó aktivitás A CLEPS oldatok szabad gyökfogó aktivitásának meghatározását ABTS gyökkation-színtelenítési vizsgálattal végeztük a bKedare és munkatársai által leírt módszer szerint. (19]. Az ABTS kationgyökképződést 10mg ABTS és 2 mg kálium-perszulfát vízben történő elegyítésével végeztük. Az oldatot felhasználás előtt kb. 12 órára 25 fokos sötétbe helyeztük. ml) 60 ml metanollal hígítottuk, majd a CLEPS-t 90 uM metanolos ABTS-sel összekevertük, így 0,5, 1 és 5 mg/ml végső oldatkoncentrációt kaptunk 96-lyukú lemezeken. A lemezeket25 ◦C-on 30 percig, és az OD-t 734 nm-es hullámhosszon mértük Multiskan segítségével.GO hangszer. Három független kísérletet végeztünk. aszkorbinsav (AA,1 mg/ml) használtuk pozitív kontrollként. Az ABTS gátlási százalékot az alábbi módszerrel számítottuk kiaz alábbi képlet szerint:ABTS ürítési százalék {{0}} [kontroll A0− minta A1/kontroll A0]× 100 ahol A1 jelzia minta abszorbanciája, míg az A0 a kontroll (metanolos oldat) abszorbanciáját jelöliaz ABTS).


2.3. Sejtéletképességi vizsgálat

A CLEPS sejt életképességének értékelése a bőrsejteken, a humán dermális fibroblasztokon(NHDF) (ATCC) DMEM-ben (magas glükóz) (WelGENE, KR) tenyésztettük.

10 százalék magzati szarvasmarha szérummal (FBS) (WelGENE, Gyeongsan, Korea) és 1 százalék pénisszelcillin/sztreptomicin (WelGENE, Gyeongsan, Korea) 37 évesen◦C 5 százalékos CO-ban2 inkubátor (UP50H,Forma Scientific, Marietta, OH, USA). A sejteket 7 °C-on inkubáltuk× 104sejt/kút beegy 12-kútlemez. A sejtadhézió megerősítése után szérummentesre vittük áttáptalajt és az oldatokat munkakoncentrációban kezeltük mindegyik lyukban 72 órán keresztül. A tiazolilkék tetrazólium-bromid (MTT) (Sigma, St. Louis, MO, USA) oldataegy koncentrációt100-bólµMinden lyukba g/ml-t adtunk, és 37 °C-on inkubáltuk◦C, 5 százalék CO2 számára2 óra. Ezután az összes táptalajt eltávolítottuk és 500-atµL DMSO (Duchefa Biochemicals, Haarlem, Hollandia) adtunk minden egyes lyukhoz. Az abszorbancia 570 nm-en voltELISA olvasóval (Epoch, Bio-tek INC, Winooski, VT, USA) mértük. A sejtkultúratápközeget használtunk negatív kontrollként (kontroll (-)).


2.4. Filaggrin kifejezési szintje

Annak bemutatására, hogy a CLEPS hogyan befolyásolja a bőr barrier funkcióját, a filaggrin mRNS expressziós szintjét RT-PCR-rel mértük. A HaCaT sejtet 2 °C-on tenyésztettük× 104 sejt/lyuk egy 24-lyuk lemezen 10% FBS-t, 1% penicillint és 1% sztreptomicint tartalmazó DMEM táptalajt használva, majd tenyésztjük 37 °C-on◦C, 5 százalék CO2 inkubátorban 24 órán keresztül. A felülúszó eltávolítása után minden mintát FBS-t nem tartalmazó DMEM táptalajba adtunk 24 órán át 37 °C-on.◦C, 5 százalék CO2 inkubátor. Inkubálás után a felülúszót eltávolítottuk, és az RNS-t a kézikönyvnek megfelelően Easy Blue lízisreagens (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea) alkalmazásával összegyűjtöttük. RT PreMix-et (BIONEER, Daejeon, Korea) 42-ben használtak◦C-on 60 percig és 95 percig◦C-on 5 percig a cDNS szintéziséhez. A PCR primereket (Macrogen, Daejeon, Korea) a táblázatban bemutatott módon terveztük1 és Western blottingot végeztünk a filaggrin expresszió mennyiségének meghatározására.



Skincare Cistanche


A filaggrin fehérjeszintjének mérésére minden sejtet aliquot részekre osztunk egy 6-lyuk lemezre 1 °C-on.× 105sejt/lyuk DMEM táptalajt használva, amely 10% FBS-t, 1% penicillint tartalmaz, és
1 százalék sztreptomicin24 órás inkubáció követi. Miután a felülúszó oldatot újramozgatva és friss tápközeggel újratöltöttük, a sejteket tovább tenyésztettük 24 órán át. A lemezt, amelyről a felülúszót eltávolítottuk, fehérjeoldattal (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea), hogy lizálják a sejteket, majd centrifugálják (13,000 fordulat/perc, 15 perc, 4 ◦C). Ezután a felülúszó fehérjekoncentrációjának mérésére összekevertük30-alµg NuPAGE LDS mintapuffer (Novex, CA) és 100 °C-on forraljuk◦C-on 5 percig. Alattiezt követően a fehérjét transzfer membránokra vitték át (Millipore, Burlington, MA,USA) SDS-PAGE után Mini PROTEAN használatával® Tetra sejtek (552BR, Bio-Rad, Hercules, CA,EGYESÜLT ÁLLAMOK). A nem specifikus fehérjekötő részeket Tris-pufferrel reagáltatva blokkoltuksóoldat 0,1 százalékos Tweennel® 20 (TBST) és 5 százalék sovány tej 1 órán át. Az elsődleges antitest(Filaggrin: Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) 1:1000-re hígítottuk (v/v), kevertéjszaka at4◦C, és háromszor mossuk TBST-vel 15 percig. Ezután a másodlagos antitestoldatot adunk hozzá, majd 25 °C-on keverjük◦C-on 1 órán át, majd 3-szor mossuk TBST-velszámára15 perc, majd az Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (MerckMillipórus, Darmstadt, Németország) használták a sávok lefoltozására, amelyek Omegával készültek.

Lum G (Aplegen, Pleasanton, CA, USA). Standard belső fehérjeként -aktin (Sigma,St. Louis, MO, USA) használtuk.


2.5. B16 melanomasejtek melanogenezisgátlási tesztje

A melanin gátlási teszt biztonságos dózisainak megtalálásához és a melanin gátló aktivitásának megfigyeléséhez a CLEPS mintakezeléssel, B16 melanoma sejtek (ATCC) 1× 105 sejteket/lyuk olyan 6-lyukú tenyésztőlemezen tenyésztettük, amely DMEM tápközeget tartalmazott 10% FBS-sel és 1% penicillin-sztreptomicinnel 37 °C-on.◦C és 5 százalék CO2 feltétel. Melanin szintézis induktor, - melanocita stimuláló hormon ( -MSH), úgy állítottuk elő, hogy feloldottuk 10%-os DMSO-ban 50 jim koncentrációbanµM. 24 órás inkubálás után a CLEPS-oldatokat hozzáadtuk és azonnal kezeltük -MSH (50 nM), majd további 72 órás inkubálás követi. Ezután a sejtlemezeket kétszer mostuk PBS-sel és tripszineztük, majd a kinyert sejteket 5000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 10 percig, hogy eltávolítsuk a felülúszót, majd sejtpelletet kapunk. Az intracelluláris melanintartalmat a korábban ismertetett módszer szerint határoztuk meg, kisebb módosításokkal [20]: a melanint 10% DMSO-t tartalmazó 2 N NaOH-ban 60 °C-on gyűjtöttük össze.◦C-on 4 órán át, amit átvittünk egy 96-lyuk lemezre. DMSO (0,1 százalékv/v) volt a kontroll és a vizsgálati minták oldószere -MSH. Az abszorbanciát 475 nm-en mértük ELISA olvasóval.


2.6. Nitrogén-oxid (NO) gyulladásgátló vizsgálata

Az NO-termelés vizsgálatához RAW 264.7 sejteket (ATCC) tenyésztettünk és oltottunk be.1-es sűrűségnél× 104sejt/lyuk egy 96-lyuk lemezen. A sejteket CLEPS-nek (100vagy 500µg/ml) 1 órán át, majd a sejteket lipopoliszachariddal (LPS) stimulálják.(1 µg/ml). 10 µg/ml -liponsavat (LA) (Sigma) használtunk pozitív kontrollként. Után24 h, a NO mennyiségét a sejtközegben 100 térfogatban mértükµL állóaz A oldat 1:1 arányú keveréke (1% 4-aminobenzolszulfonamid, 0,2% N1- (naftalin-1-il)-etán-1, 2-diamin-dihidroklorid) és B-oldat (5%-os foszforsav), amelyazonos térfogatú táptalajjal adjuk hozzá. 15 perc elteltével az abszorbancia mérése megtörtént550 nm-en végeztük mikrolemez-leolvasóval (Multiskan GO műszer). A kultúra

LPS nélküli tápközeget (normál csoport) használtunk negatív kontrollként.

Echinacoside in cistanche (8)

2.7. Indukálható nitrogén-oxid-szintáz (iNOS), ciklooxigenáz-2 (COX2) és tumornekrózis faktor gyulladásgátló vizsgálata (TNF )

A RAW 264.7 cellák (5× 104 cella6 cm-es edényeken egy éjszakán át tenyésztettükés 1 órán át előkezeltük CLEPS-sel. A sejteket LPS-nek tesszük ki (1µg/ml) és24 órán át inkubáltuk. 10µg/ml -liponsavat (LA) (Sigma) használtunk pozitív kontrollként.Miután megkaptuk a fehérjéket lízispufferrel (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA,USA), foszfatáz inhibitor koktéllal és proteázzal (Thermo FisherScientifific, Inc., Waltham, MA, USA), majd a teljes lizátumot mértükmosószer-kompatibilisfehérjevizsgálat (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). AA fehérjéket SDS-PAGE gélelektroforézissel választottuk el. Az átvitt membránok(Immobilon®-P, Millipore, Burlington, MA, USA) blokkolták a TBST pufferben (Sigma,St. Louis,MO, USA), amely 5 százalék sovány tejet tartalmazott, és a membránokat 4-en tartották◦C iNOS, COX2 vagy TNF elleni antitestekkel (1:1000). A táptalaj LPS nélkül(normál csoport) használtuk negatív kontrollként.



2.8. Kollagén szintézise és a kollagenáz gátlása

Az NHDF sejteket tenyésztettük és előkezeltük CLEPS-sel, hogy megvizsgáljuk a hatásosságátCLEPS a kollagénképződésre és a kollagenáz gátlására I. típusú prokollagén szedésévelC-peptid EIA kit (Takara, Kusatsu, Japán) és egy humán pro-MMP-1 Quantikine ELISAkit (K+F rendszer, Minneapolis, MN, USA), ill. A kollagént lebontó enzim, a kollagenáz aktivitási szintjének mérésére szolgáló módszerként.kollagenázt (MMP{0}}), míg Phorbol 12-mirisztát 13-acetátot (PMA) (Sigma)az MMP kifejezésének aktiválására szolgál-1. 10 ng/ml TGF- (Sigma) feloldódotta tápközegben, és pozitív kontrollként használtuk, míg a táptalaj anegatív kontroll.



2.9. In vitro sebgyógyulási vizsgálat

A CLEPS sebgyógyulásra gyakorolt ​​hatásának vizsgálatához a HaCaT sejteket (1× 104sejt/kút)48 órára 12-lyuklemezekre szélesztettük, és ~100 százalékos összefolyásig nőttek. Az egyrétegű voltsteril 200-as hegyével megsebesítveµL pipetta. A sejttörmeléket mosással távolítottuk elkétszer PBS-sel. Ezeket a sejteket azután friss, 1%-os szérumtápközeggel helyettesítettük, illCLEPS nélkül (100, 500 és 1000µg/mL), majd 0–48 órán át tartó stimuláció. Egy vezérlőcsoportot használtuk a sebgyógyulási tulajdonságok összehasonlítására jelenlétében és távollétébena CLEPS. A sebzáródásról (sejtvándorlás) készült mikrofényképek 0–48 óránálugyanazon sebzett területeket fordított mikroszkóppal (Zeiss, Jena, Németország). Aa képpontokban kifejezett sebterület százalékos változását manuálisan számszerűsítettük minden egyes kép esetében az ImageJ segítségévelSzoftver (v1.52a, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).


2.10. Statisztikai analízis

A CLEPS biofunkcionális vizsgálatait minden platformon három párhuzamosban végeztük el. Aaz eredményeket átlagban fejeztük ki± szórás. Statisztikai elemzéseket végeztünkANOVA segítségével, majd Tukey HSD posthoc teszttel vagy Student's teszttelt-teszt. Ezek a tesztekSPSS szoftverrel (v25, International Business Machines, Armonk, NY,USA) és a Microsoft Excel (v1905, Microsoft, USA). Ap-értéknak,-nek<0.05 was considered statisztikailag szignifikáns.

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950


















Akár ez is tetszhet