1. RÉSZ A Cistanche Tubulosa kivonat antidepresszáns-szerű hatásai a krónikus, kiszámíthatatlan stresszes patkányokra a bélmikrobióta homeosztázisának helyreállítása révén

Egyre több bizonyíték mutat rá, hogy a neuropszichiátriai rendellenességek, mint például a depresszió, a bél-agy tengelyen keresztül kapcsolódnak a bél mikrobiómához.Cistanches Herbajól ismert a "vese-yang" hiányának kezelésére a hagyományos kínai orvoslásban (TCM), és az elmúlt években neurodegeneratív betegségek kezelésére alkalmazták. Ebben a tanulmányban a krónikus, kiszámíthatatlan stressz (CUS) által kiváltott depresszió modellt hozták létre, hogy feltárják aCistanche tubulosakivonat (CTE) viselkedési tesztekről, monoamin neurotranszmitterekről és neurotróf faktorokról a hippocampusban és a vastagbélben, a bél mikrobiota összetételéről és a rövid láncú zsírsavak (SCFA-k) termeléséről. Ezenkívül korrelációs analízist alkalmaztak a megváltozott bélmikrobióta, a megváltozott neurotranszmitterek és neurotrofinok hippokampuszban és vastagbélben, valamint az SCFA-k zavart koncentrációja közötti funkcionális kapcsolat értékelésére. A CTE szignifikánsan javította a depresszióhoz hasonló viselkedést patkányokban CUS alatt. A 5-hidroxi-triptamin (5-HT) agyi szintjét és az agyból származó neurotróf faktor (BDNF) expresszióját CUS-patkányokban a CTE helyreállította. A bél mikrobiota relatív bősége, valamint az acetát és hexánsav koncentrációja szintén módosítható CTE kezeléssel. Kimutattuk továbbá, hogy a CTE alkalmazása CUS-patkányokban erős korrelációt eredményezett a károsodott bélmikrobióta összetétel, a hippocampus neurotranszmitter szintje és a neuroaktív metabolit SCFA-k termelése között. Összességében ezek az eredmények a CTE-t a depressziós tünetek lehetséges kezelési módjaként azonosítják azáltal, hogy helyreállítják a bél mikrobiota homeosztázisát a mikrobiota-bél-agy tengely rendellenességei esetén, új utakat nyitva a neuropszichofarmakológia területén.

Kulcsszavak: Cistanche tubulosa, antidepresszáns, krónikus, kiszámíthatatlan stressz, bélmikrobióta, mikrobiota-bél-agy tengely

További információért forduljon:Joanna.jia@wecistanche.com

A Cistanche deserticolának számos hatása van, kattintson ide, ha többet szeretne megtudni

BEVEZETÉS

Cistanches Herba(kínaiul Rou Cong-Rong) hivatalosan a szárított zamatos szárként tartják nyilvánCistanche deserticola(YC Ma) ésCistanche tubulosa(Schrenk) a Kínai Gyógyszerkönyvi Bizottságban (2015). Jól ismert hagyományos kínai orvoslás (TCM) veseelégtelenség, impotencia, női meddőség, kóros leucorrhoea, súlyos metrorrhagia,

Echinakozida cistanche-ban elősegíthetisebgyógyulás

és szenilis székrekedés (Kínai Gyógyszerkönyv Bizottság, 2015). Korábbi tanulmányok több fő kémiai összetevőt tártak felCistanches Herbaideértve a fenil-etanoid glikozidokat (PhG-ket), iridoidokat és iridoid glikozidokat, lignánokat, alditolokat, oligoszacharidokat és poliszacharidokat. A farmakológiai elemzés kimutatta, hogy a Cistanches Herba neuroprotektív, immunmoduláló, gyulladáscsökkentő és májvédő hatások széles skáláját mutatja (Jiang és Tu, 2009; Fu et al., 2017). A PhG-ket a Cistanches Herba fő aktív összetevőinek tekintik, amelyek különféle farmakológiai hatásokkal rendelkeznek, például neuroprotektív, immunmoduláló, gyulladásgátló, májvédő, antioxidáns stb. (Jiang és Tu, 2009; Fu és mtsai, 2017). A Cistanches Herba eredetileg a gyógynövényekről szóló, i.sz. 200 és 250 között íródott jól ismert könyvben, a gyógynövényekről szóló klasszikusban (kínaiul "Shennong Bencao Jing") került rögzítésre, mint "magas gyógynövény", amely képes szabályozni az "öt (zsigerek") ) megerőltetések és hét (túlevés, harag, nedvesség, hideg, aggodalom, szél és eső, valamint félelem) károsodás” (Huang, 1982). Manapság a Cistanches Herba széles körben elfogadott gyógynövényi tonik az általános legyengülés ellen (Fu et al., 2017).C. tubulosaglikozid kapszulákat (Memoregain®) használnak az Alzheimer-kór kezelésére (Guo et al., 2013). A diszfunkcionális dopaminerg rendszer a depresszió monoamin-hipotézisének egyik kulcsfontosságú patogenezise (Duman et al., 1997; Krishnan és Nestler, 2008). Az echinakozidról (az egyik PhG-ről) és a Cistanche salsa PhG-jeiről megállapították, hogy megvédik a dopaminerg neuronokat a 1-metil-4-fenil-1,2,3,{ által kiváltott dopamin (DA) neurotoxicitás ellen. {8}}tetrahidropiridin (MPTP), amely növelheti a DA szintet a C57 egerek striatumában (Tian és Pu, 2005; Geng és mtsai, 2007). Ezenkívül a katalpol és a genipozid a Cistanches Herba két reprezentatív iridoidja, és azt találták, hogy javítják a krónikus, kiszámíthatatlan stressz (CUS) által kiváltott depresszióhoz hasonló viselkedést azáltal, hogy helyreállítják a hipotalamusz-hipofízis-mellékvese (HPA) tengely diszfunkcióit, és a katalpol képes feljavítani az agy működését. származtatott neurotróf faktor (BDNF) expressziója (Cai et al., 2015; Wang és mtsai, 2015). Ezen túlmenően, a legújabb publikáció friss bizonyítékot ad arra vonatkozóan, hogy a Cistanches Herba főzet jelentősen csökkentette az egérfarok felfüggesztési tesztjének mozdulatlansági idejét, ami erősen arra utal, hogy a Cistanches Herba potenciális antidepresszáns-szerű tulajdonságokkal rendelkezik (WangD. et al., 2017).

A hagyományos kínai orvoslás egyre nagyobb figyelmet kelt a depresszió kezelésére, viszonylag mérsékelt mellékhatásai miatt (Sarris et al., 2011; Feng és mtsai, 2016). Különféle típusú TCM-ek, például a nyers gyógyszerekből származó egyedi vegyületek (ginzenozid Rb1, ginzenozid Rg3 és Yuanzhi-1) (Jin és mtsai, 2015; Kang és mtsai, 2017; Wang GL et al., 2017) ), egyedi kínai gyógyászati ​​anyagok (Panax ginseng gyökér, Acorus tatarinowii rizóma és Morinda Officinalis) (Dang és mtsai, 2009; Han és mtsai, 2013; Xu et al., 2016) és TCM-főzetek (Kai-Xin- San, Chaihu-Shu-Gan-San, Xiaoyaosan és Xiaochaihutang) (Dai et al., 2010; Su és mtsai, 2011; Su és mtsai, 2014; Yan és mtsai, 2016) alaposan tanulmányozták és bemutatták a depresszióhoz hasonló tünetek visszafordítására vagy enyhítésére. Például azt találták, hogy a Kai-Xin-San jelentősen enyhíti a CUS-indukált depressziós patkányok tüneteit azáltal, hogy növeli a neurotranszmitterek, a neurotróf faktorok és a megfelelő receptorok számát, valamint elősegíti a szinaptotagmin expresszióját és a dendrites gerinc sűrűségét (Yan et al. , 2016).

Mindazonáltal a TCM korábbi tanulmányai depresszáns-szerű viselkedési tesztek eredményeire támaszkodnak, és a hagyományos farmakológiai hatásmechanizmusra összpontosítanak. Az orálisan beadott TCM antidepresszáns hatékonysága és a bél mikrobiota közötti összefüggés nem teljesen ismert. Egyre több bizonyíték támasztja alá, hogy a bél mikrobiota kulcsfontosságú szerepet játszik az agyi funkciók szabályozásában, különösen a depresszió és más stresszel kapcsolatos rendellenességek szabályozásában (Foster és Neufeld, 2013; Sherwin et al., 2017). Például a krónikus stressz a patkánybél mikrobiális szerkezetének szabályozási zavarát eredményezi, a Firmicutes/Bacteroidetes arány csökkenésével, pontosabban a Lactobacillus relatív abundanciájának csökkenésével és az Oscillibacter növekedésével (Meng et al., 2017). Ezen túlmenően a depressziós betegek diszregulált mikrobiótájának bélsár-transzplantációja csíramentes egerekbe depresszió-szerű fenotípust eredményezett ezekben az állatokban, ami azt jelzi, hogy a szabályozatlan bélmikrobióta a depresszió és a szorongás viselkedési és fiziológiai tüneteit okozza (Kelly et al., 2016; Zheng et al. ., 2016). Állatkísérletek során egyes mikrobióta-modulátorokról, például a probiotikumokról és a prebiotikumokról azt találták, hogy javítják a krónikus stresszben szenvedő egerek depressziószerű viselkedését azáltal, hogy javítják a bélmikrobiótát (Bravo és mtsai, 2011; Bharwani et al., 2017; Burokas et al., 2017). ).

Tekintettel a bélmikrobióta és a betegségek kialakulása közötti összefüggésre, valamint a bélmikrobióta szerkezetének plaszticitására, úgy döntöttünk, hogy megvizsgáljuk a bélmikrobióta depressziót közvetítő hatásait, amelyek felkeltették a figyelmünket, és megvizsgálták (Chang et al., 2017; Xu et al. ., 2017). Ennek elérése érdekében a 16S rRNS génszekvenálás kombinált metastatisztikus elemzését (White et al., 2009) végezték el a bél mikrobiota összetételének elemzésére. A jelen tanulmánybanC. tubulosaazért választották ki, hogy értékeljék antidepresszáns-szerű hatását, mert magasabb a PhG-szintje, mint aC. deserticola. Egy patkány CUS-indukált depresszió modellt hoztak létre a hatás feltárásáraC. tubulosa kivonat(CTE, amely 48,6 százalék PhG-ből, 6,9 százalék iridoid glikozidból és 20,0 százalék teljes szacharidból áll) viselkedési teszteken, monoamin neurotranszmittereken és neurotróf faktorokon a hippocampusban és a vastagbélben, a bél mikrobiota összetételében és a rövid láncban zsírsav (SCFA) termelés. Ezenkívül a megváltozott bélmikrobióta közötti funkcionális kapcsolatot mind a hippocampusban, mind a vastagbélben megváltoztatták a neurotranszmittereket és a neurotrofinokat, és tanulmányozták az SCFA-k zavart koncentrációját. Korrelációs elemzést alkalmaztak annak alátámasztására, hogy a CTE a bélmikrobiótát célozza meg a depresszió kezelésében a mikrobiota-bél-agy tengely modulálásával.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Anyagok

A fluoxetint (FLX) az Aladdin Industrial Inc.-től (Sanghaj, Kína) vásároltuk. A 5-hidroxitriptamin (5-HT), noradrenalin (NE) és BDNF ELISA készleteket a Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute-tól (Nanjing, Kína) vásároltuk. A HPLC-minőségű acetonitrilt a Mercktől (Darmstadt, Németország) vásároltuk. Az ionmentesített vizet desztillált vízből állítottuk elő Milli-Q víztisztító rendszerrel (Millipore, Bedford, MA, Egyesült Államok). Az összes többi felhasznált reagens és vegyszer analitikai minőségű volt.

Szárított szárakC. tubulosaHetian megyéből (Xinjiang, Kína) gyűjtötték. Az utalványmintákat Prof. Xiaobo Li hitelesítette, és a Shanghai Jiao Tong Egyetem (Sanghaj, Kína) Gyógyszerészeti Iskola herbáriumában helyezték el. A homogén porítottC. tubulosaA töveket tízszeres 70%-os etanolban szuszpendáltuk, és háromszor 1 órán át 100 °C-on visszafolyató hűtő alatt forraltuk. Az extraktumokat gézzel szűrjük, vákuumban 65 °C-on bepároljuk és liofilizáljuk. A mintát újra feloldottuk, majd makropórusos D101 gyantával elválasztottuk. Az adszorpció után a vízzel eluált frakciót elöntjük. A CTE-t 40%-os etanollal eluáltuk, majd vákuumban 65 fokon bepároltuk és liofilizáltuk.

A CTE kémiai összetételének elemzése

A CTE-ben a PhG-k relatív tartalmát UV-spektrofotometriával határoztuk meg 330 nm-en, standardként echinakozidot használva. Az iridoidok és iridoid glikozidok relatív tartalmát UV spektrofotometriával mértük kettős hullámhosszú módszerrel, hogy elkerüljük a PhG-k spektrális zavarását (spektroszkópiai kvantifikációhoz 237 nm, referencia hullámhosszként 280 nm izobesztikus pontot használtunk), genipozidot használtunk. mint a szabvány. A CTE teljes szénhidráttartalmát fenol-kénsav kolorimetriás módszerrel határoztuk meg, standardként glükózzal (Chow és Landhausser, 2004).

A CTE fő kémiai összetevőit UPLC-Q-TOF-MS jellemezte. Az UPLC-Q-TOF-MS elemzést Waters ACQUITY UPLC rendszeren (Waters Corp., Milford, MA, Egyesült Államok) ACQUITY UPLC BEH C18 oszloppal (100 mm x 2,1) végeztük. mm id, 1,7 µm, Waters Corp., Egyesült Államok) gradiens elúcióval 0,1% hangyasav-acetonitril (A) és 0,1% hangyasav vízben (B) alkalmazásával. áramlási sebessége 0,4 ml/perc. A gradiens profil: 0-5 perc (A: 5-20 százalék), 5-7,5 perc (A: 20-30 százalék), 7.5-10 perc ( A: 30-70 százalék ), 10-11 perc (A: 70-100 százalék ), és 1,5 percig tartott. A gradienst 0,5 perc alatt visszavezettük 5 százalékra, és 2,5 percig tartottuk a következő futtatáshoz. Az injekció térfogata 3 [il. Az oszlopos kemence hőmérsékletét 35 fokra állítottuk be.

A tömegspektrometriát Waters Vion IMS tömegspektrométerrel (Waters Corp., Milford, MA, Egyesült Államok) végeztük. Az ionizációt negatív elektrospray (ESI) módban végeztük. Az MS paraméterek a következők voltak: kapilláris feszültség, 2.0 kV; kúpfeszültség, 20 V; forráshőmérséklet, 120 fok ; deszolvatációs hőmérséklet, 500 fok ; a kúp és a deszolvatáció gázáramlása 50, illetve 1,000 L/h. A pontos tömegmérés érdekében leucin-enkefalint használtunk zárótömegként [MH]-ion létrehozásához (m/z 554,2615). Az MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) kísérletet két letapogatási funkcióval a következőképpen végeztük: 1. funkció (alacsony energia): m/z 50-1, 000, 0,25 s pásztázási idő, 0,02 s pásztázási késleltetés , 6 eV ütközési energia; 2. funkció (nagy energia): m/z 50-1,000, 0,25 s pásztázási idő, 0,02 s pásztázási késleltetés, ütközési energia rámpája 20-45 eV. Az adatokat UNIFI 1.8.1 szoftverrel dolgoztuk fel (Waters Corp., Milford, MA, Egyesült Államok).

cistanchetudjavítja a veseműködést

Állatkísérletek

A hím Sprague-Dawley patkányokat (200 土 20 g) a Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company-tól (Peking, Kína) szereztük be, és a Shanghai Jiao Tong Egyetem (Sanghaj, Kína) Laboratory Animal Centerében helyezték el őket. Az állatokat csoportokban, szabályozott szobahőmérsékleten (25 °C 2 fok, 55 °C 10% relatív páratartalom) tartottuk, 12:12 órás világos-sötét ciklussal. A patkányok 1 hétig szabad hozzáférést kaptak a szokásos laboratóriumi patkányok táphoz és vízhez. Az állatokra vonatkozó létesítményeket és protokollokat a Shanghai Jiao Tong Egyetem (Sanghaj, Kína) Állat-etikai Bizottsága hagyta jóvá.

1 hetes akklimatizációt követően 40 naiv patkányt vetettünk alá 72 órás szacharóz edzésnek és szacharóz alaptesztnek. A patkányokat öt csoportra osztották (n=8) a szacharóz-preferencia alapján a szacharóz alaptesztben (S1 kiegészítő ábra). A kontrollcsoport és a CUS csoport sóoldatot kapott (10 ml/kg). A másik három csoport esetében: CTE magas dózisban (CTEH) (400 mg/kg), alacsony dózisú (CTEL) (200 mg/kg) és FLX (10 mg/kg) intragasztrikusan adták be 1 órával a CUS-eljárás előtt (8:00 és 9:00 óra között) 4 héten keresztül.

A krónikus, előre nem látható stresszt a korábban leírtak szerint alakítottuk ki (Willner, 1997; Xue és mtsai, 2013), a nem stresszes kontrollcsoport kivételével a patkányokon egy sor stresszort alkalmaztunk: éjszakai alacsony intenzitású stroboszkópos megvilágítás (120 villanás/ min), fehér zaj (100 dB) 1 óráig, vízhiány 24 óráig, üres kulacsok 1 óráig (vízelvonás után), ételmegvonás 24 óráig, kényszerúszás (5 perc), fizikai korlátozás ({{11) }} h), szennyezett ketrec 24 órán keresztül (200 ml víz 100 g fűrészpor ágyneműben), farok csípés (1 perc), 45 fokos ketrec dőlés 24 óráig, sokkolás 30 percig és éjszakai megvilágítás (12 óra). A stresszorokat folyamatosan és véletlenszerűen alkalmazták 4 hétig, amelyek részleteit az S1 kiegészítő táblázat ismerteti. Az élelem és a víz szabadon elérhető volt a nem stresszes kontroll patkányok számára, amelyek zavartalanul maradtak egy másik szobában, kivéve az egyes szacharóztesztek előtti 14 órás megvonási időszakot. Egy patkány elpusztult a CUS eljárás során. A kényszerúszó tesztet (FST) ezután végezték el

4 nap akut beadás után és 28 nap stressz után szacharózpreferencia tesztet (SPT) (29. nap), nyílt terepen végzett tesztet (OFT) (31. nap) és újdonság-elnyomott takarmányozási tesztet (NSFT) (33. nap) végeztünk. A CUS és a viselkedési tesztek tervének vázlata az S2 kiegészítő ábrán látható.

Kényszerúszó tesztet végeztek a korábban leírtak szerint (Porsolt et al., 1978). Az eljárás előtesztből és tesztsorozatból állt, ugyanazt a berendezést és körülményeket használva (átmérő 20 cm, magasság 45 cm, 25 cm víztartalommal, 26 fokos hőmérsékleten). Az előzetes teszt során a patkányokat 15 percig úszásra kényszerítették; 24 órával később a patkányokat ugyanabba a készülékbe helyeztük 5 perces úszási tesztre. Az úszás viselkedése belül

5 percig videokamerával figyeltük meg, és mértük és elemeztük a mozdulatlanság időtartamát.

Az SPT esetében a patkányokat először 1 százalékos (v/v) szacharózoldat fogyasztására tanítottuk 72 órával az SPT előtt. A szacharóz alapvonal tesztet a CUS eljárás előtt és az SPT-t a CUS végén a korábban leírtak szerint végeztük (Xue et al., 2013).

A nyílt terepen végzett tesztet a CUS eljárás végén végeztük, a berendezés és a módszer megegyezett a korábban részletezettekkel (Xue et al., 2013). Videókövető rendszert (Shanghai Mobile Datum Information Technology Co., Ltd.) használtak a teljes megtett távolság rögzítésére.

Az újdonság-elnyomott táplálkozási tesztet a korábban leírtak szerint értékeltük (Xue és mtsai, 2013), és feljegyeztük és elemeztük az 5 percen belüli étkezés megkezdésének késleltetését.

Neurotranszmitterek és neurotróf faktorok mérése

Viselkedési tesztek után minden patkányból legalább négy székletpelletet vettünk, steril kúpos csövekbe helyeztük, és azonnal lefagyasztottuk -80 °C-on a mikrobiális közösség és az SCFA-k elemzéséhez. Ezt követően a patkányokat feláldozták; a hippocampust és a vastagbelet izoláltuk, és azonnal lemértük. A szövetmintákat fiziológiás sóoldattal mostuk, folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, és -80°C-on tároltuk. A -20 °C és 4 °C közötti egymást követő felolvasztás után a szövetmintákat sóoldatban homogenizáltuk, és 25 percig centrifugáltuk 2500 rpm/4 °C-on. A kapott felülúszót összegyűjtöttük, és felhasználásig 4 °C-on tároltuk. A 5-HT-szintet a hippocampusban és a vastagbélben, a NE-szintet a hippocampusban és a BDNF-szintet a hippocampusban kereskedelmi forgalomban kapható ELISA-készletekkel határozták meg a gyártó protokollja szerint (Hou et al., 2017).

A bélmikrobióta összetételi profiljának elemzése

A székletmintákból származó bélmikrobióta teljes DNS-ét a korábban leírtak szerint extraháltuk (Wei et al., 20{{20}}4). Minden székletmintát (0,2 g) 1 ml PBS-ben elegyítettünk, kétszer teljesen homogenizáltunk, majd 200 g-vel 6 percig centrifugáltuk. A felülúszóhoz 20±20% PVP-t adtunk, és 300 g-vel centrifugáltuk 6 percig. A kapott felülúszót ezután 12,{11}} g-vel centrifugáltuk 6 percig, és a sejtpelleteket összegyűjtöttük. A sejtpelleteket PBS-sel mostuk, majd 300 I. lizátumban (150 mM NaCl, 100 mM EDTA・Na2・2H2, pH 8,0) újraszuszpendáltuk. A szuszpenziót összekevertük 100 μl lizozim oldattal (100 mg/ml) és 20 μl 1% RNázzal, 37 °C-on, 30 percig melegen fürdőzve, majd hozzáadtunk 300 µl II lizátumot (100 mM NaCl, 500 mM trisz bázis, pH 8). . A sejtszuszpenziót óvatosan összekevertük 50±20% SDS-sel, és jeges fürdőben 5 percig fürdőztük. A DNS-t ezután 1%-os PVP-vel, Tris-kiegyensúlyozott fenollal és kloroform-izoamil-alkohollal (3,125:25:24:1) és kloroform-izoamil-alkohollal (24 térfogatarány) szekvenciális extrakcióval tisztítottuk. :1), majd -20 °C-on 2 órán át 2 térfogat etanollal és 50 [l 3 M NaAc-vel végzett kicsapás. A DNS-t centrifugálással összegyűjtöttük, levegőn szárítottuk, és 100 ul steril ionmentes vízben oldottuk. A nukleinsav tisztaságát NanoDrop 2000c spektrofotométerrel (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Egyesült Államok) vizsgáltuk. A teljes genomiális DNS-t ezután PCR-amplifikációnak vetettük alá a 16S rRNS gén V3-V4 régióira specifikus primerek segítségével: előre 338F primer (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') és reverz 806R primer (5). "-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3"). A PCR amplikonokat Agencourt AMPure gyöngyökkel (Beckman Coulter, Indianapolis, IN, Egyesült Államok) tisztítottuk, és mennyiségileg meghatároztuk a PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, Egyesült Államok) segítségével. Az egyedi mennyiségi meghatározási lépés után az amplikonokat egyenlő mennyiségben egyesítettük, és a párvégi 2 x 300 bp-os szekvenálást az Illumina MiSeq platform és a MiSeq Reagent Kit v3 használatával végeztük a Shanghai Personal Biotechnology Co., Ltd.-nél (Sanghaj, Kína). A páros végű leolvasásokat FLASH szoftverrel (1.2.7-es verzió) állítottuk össze, a nyers szekvencia-leolvasásokat a QIIME szoftverrel (1.8.0-s verzió) minőségileg levágtuk, hogy eltávolítsuk az össze nem illő vonalkódokat és a hosszküszöb alatti szekvenciákat. Ezt követően a szűrt szekvenciákat 97 százalékos szekvenciahasonlósági küszöbértékkel operatív taxonómiai egységekbe (OTU-k) csoportosították QIIME és UCLUST használatával. A béta diverzitást QIIME-n végeztük a súlyozott UniFrac főkoordináta-analízishez (PCoA). Végül a Meta stats szoftvert használtuk a bélmikrobiális taxonómiai összetétel különbségeinek összehasonlítására a különböző csoportok között.

SCFA-k koncentráció elemzése

Az SCFA-k (beleértve az acetátot, propionátot, butirátot, izobutirátot, valeriánsavat, izovaleriánsavat és hexánsavat) koncentrációját patkány székletmintákban GC{{0}} gázkromatográfiával (Shimadzu, Japán) határoztuk meg. DB-FFAP oszloppal (30 mx 0,25 mm x {{10}},25 cm, Agilent, Egyesült Államok). Az acetát, propionát, butirát, izobutirát, valeriánsav, izovaleriánsav és hexánsav standard oldatait 1, 0.4, 0.2, 0.1, {{ 21}}.05, 0,01 és 0,005 mg/ml éterrel (beleértve a 2- metil-valeriánsavat 0,1 mg/ml belső standardként). Minden székletmintát (0,2 g) 0,8 ml ionmentesített vízben kevertünk vortexeléssel és centrifugálással 5, 000 fordulat/perc sebességgel 20 percig 4°C-on, majd 450 µl felülúszót adtunk hozzá 50 µl 50%-os H2SO4-tel és 500 µl belső standarddal. 1 percig vortexeljük és 12, 000 fordulatszámmal 10 percig centrifugáljuk, majd a keveréket 30 percre 4°C-ra helyezzük. A felülúszót GC analízishez vettük. Az SCFA-k elemzését a korábban leírtak szerint végeztük (Wang et al., 2016).

Statisztikai analízis

Az összes adatot átlag 土 SEM-ként mutattuk be. A statisztikai elemzést az SPSS 21.{1}} szoftverrel (SPSS Inc., Chicago, IL, Egyesült Államok) végeztük egyutas ANOVA-val, amelyet Dunnett-teszt vagy Student-teszt követett. Az adatokat kizártuk az elemzésből, ha az átlagtól két standard eltérésnél nagyobb volt. A p < 0,05="" értékeket="" tekintettük="" statisztikailag="" szignifikánsnak.="" pearson="" korrelációs="" elemzését="" alkalmazták="" a="" bélmikrobióta,="" az="" scfa-k,="" a="" hippocampus="" 5-ht,="" ne="" és="" bdnf="" szintjei,="" valamint="" a="" vastagbél="" 5-ht="" relatív="" bősége="" közötti="" összefüggés="">

EREDMÉNYEK

A CTE kémiai összetételének elemzése

A CTE kémiai összetételét először átfogóan elemezték. Amint az 1. táblázatban látható, a PhG-k voltak a CTE fő összetevője, relatív tartalommal 48,6%, az iridoidok és iridoid glikozidok 6,9%, az összes szacharid pedig 20,0% volt. Ezek

A CTE komponenseit ezután UPLC-Q-TOF-MS segítségével jellemeztük. Összesen 27 összetevőt mutattak ki és azonosítottak, köztük 20 PhG-összetevőt, öt iridoidot és iridoid glikozidot, valamint két oligoszacharidot. A részletes információkat, beleértve a retenciós időt, a pontos MS-t és az MS/MS-fragmensionokat, a támogató információk (S2 kiegészítő táblázat) sorolják fel. A CTE UPLC-Q-TOF-MS teljes ionkromatogramja (TIC) az S3 kiegészítő ábrán látható.

A CTE javította a CUS-patkányok depressziós viselkedését

CUS-patkányokban a teljes mozdulatlanság ideje az FST-ben és az étkezési várakozási idő NSFT-ben szignifikánsan csökkent a CTE-kezelés hatására, valamint a szacharóz preferencia SPT-ben és az OFT-ben megtett teljes távolság megnőtt.

Az 1A. ábra szemlélteti a CTE akut hatásait a mozdulatlanság idejére FST-ben CUS-patkányokban. A CUS modellcsoporttal összehasonlítva a CTE 3- napos akut orális adagolása szignifikánsan csökkentette a teljes immobilitási időt FST-ben [egyutas ANOVA, F(3,26)=4.983, p {{7} }.007]. A további posthoc elemzés feltárta, hogy az adminisztráció

1. TÁBLÁZAT|kémiai összetételeC. tubulosaA CTE kivonata a nagy dózisú csoporttal (Dunnett-teszt, p < {0}},05) és az alacsony dózisú csoporttal (Dunnett-teszt, p < 0,05) jelentős csökkenést mutatott a teljes mozdulatlanság idején az FST-ben .

A CTE hatása a szacharózpreferenciára SPT-ben CUS-patkányokban az 1B. ábrán látható. A huszonnyolc napos stresszeljárás szignifikáns csökkenést okozott a szacharózpreferenciában a CUS modellcsoportban a nem stresszes kontroll patkányokhoz képest [egyutas ANOVA, F(4,34)=3.993, p {{8 }}.{{10}}09; Dunnett-teszt, p < 0,05],="" ami="" azt="" jelzi,="" hogy="" a="" cus-modellt="" sikeresen="" fejlesztették="" ki.="" pozitív="" kontrollként="" az="" flx="" csoport="" szignifikánsan="" növelte="" a="" szacharóz="" preferenciáját="" cus="" patkányokban="" [egyutas="" anova,="" f(4,34)="3.993," p="0.009;" dunnett-teszt,="" p="">< 0,05],="" amely="" a="" cus="" modell="" prediktív="" érvényességét="" demonstrálja.="" a="" cte="" krónikus="" orális="" adagolása="" nagy="" dózisú="" csoportban="" kulcsfontosságú="" hatást="" mutatott="" a="" szacharózpreferenciára="" [egyutas="" anova,="" f(4,34)="3.993,p=0.009;" dunnett="" teszt,="" p="">< 0,01],="" amely="" visszaállította="" a="" normál="" szintet="" cus="" patkányokban.="" az="" alacsony="" dózisú="" csoportnál="" a="" cte="" növekvő="" tendenciát="" mutatott,="" de="" a="" hatás="" statisztikailag="" nem="" volt="" szignifikáns="" (dunnett-teszt,="" p="">

Amint az 1C. ábrán látható, az OFT-ben megtett teljes távolságot is felhasználtuk a CTE CUS-patkányokra gyakorolt ​​hatásának értékelésére. A nem stresszes patkányokhoz képest a CUS modellcsoport sokkal rövidebb teljes távolságot mutatott [egyirányú ANOVA, F(4,34)=7.845, p=0.0{{ 19}}01; A Dunnett-teszt, p < 0,001]="" 4-hetes="" cus-expozíció="" után,="" és="" a="" pozitív="" kontroll="" flx-kezelés="" növelte="" a="" teljes="" távolságot="" cus-patkányokban="" [egyirányú="" anova,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001;" dunnett-teszt,="" p="">< 0,05].="" a="" cte="" napi="" orális="" adagolása="" nagy="" és="" alacsony="" dózissal="" nyilvánvaló="" hatást="" mutatott="" a="" teljes="" távolságra="" cus-patkányokban="" [egyirányú="" anova,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001" ;="" dunnett-teszt,="" p="">< 0,01="" a="" nagy="" dózisú="" csoportban,="" p="">< 0,001="" az="" alacsony="" dózisú="" csoportban].="" az="" s4="" kiegészítő="" ábra="" az="" aktivitási="" nyomvonal="" térképét="" mutatja="" az="">

Az 1D. ábra a CTE hatásait mutatja az evési késleltetésre az NSFT-ben CUS-patkányokban. A huszonnyolc napos stresszeljárás szignifikánsan megnövelte az evés megkezdésének latenciáját a CUS modellcsoportban a nem stresszes kontroll patkányokhoz képest [egyirányú ANOVA, F(4,33)=3.434, p { {8}}.{10}}19; Dunnett-teszt, p < 0,05],="" ami="" azt="" jelzi,="" hogy="" a="" cus-modellt="" sikeresen="" fejlesztették="" ki.="" a="" cte="" hosszú="" távú,="" nagy="" dózisú="" orális="" alkalmazása="" nyilvánvaló="" hatást="" mutatott="" az="" evés="" megkezdésének="" késleltetésére="" a="" cus-csoporthoz="" képest="" (student-t-teszt,="" t="2.759," p="">< 0,05),="" míg="" az="" alacsony="" dózisú="" cte="" nincs="">

A CTE visszaállította a neurotranszmitterek és a neurotróf faktorok szintjét CUS-patkányokban

A CTE hatásait a {{{{10}}}}HT- és NE-szintekre CUS-patkányok hippocampusában a 2A, B ábrák mutatják. Négy hetes stresszeljárás szignifikánsan csökkentette a 5-HT [egyirányú ANOVA, F(4,34)=17.13, p=0.0{{39 }}01; Dunnett-teszt, p < 0.001]="" és="" ne="" [egyirányú="" anova,="" f(4,34)="6.376,p=0.0006;" dunnett-teszt,="" p="">< 0,001]="" koncentráció="" cus-patkányok="" hippocampusában="" a="" kontrollcsoporthoz="" képest,="" és="" az="" antidepresszáns="" flx="" szignifikánsan="" helyreállította="" a="" 5-ht-szintet="" a="" hippocampusban="" [egyirányú="" anova,="" f(4,34)="" {="" {25}}.13,="" p="0.0001;" dunnett-teszt,="" p="">< 0,001].="" cte="" orális="" adagolása="" után="" a="" nagy="" dózisú="" csoportban="" a="" 5-ht-szint="" szignifikáns="" növekedését="" figyelték="" meg="" [egyirányú="" anova,="" f(4,34)="17.13," p="0.0001" ;="" dunnett="" teszt,="" p="">< 0,001],="" míg="" az="" ne="" koncentrációk="" nem="" változtak.="" hasonlóképpen,="" a="" bdnf="" expressziója="" szignifikánsan="" csökkent="" a="" cus="" modellcsoportban="" a="" nem="" stresszes="" patkányokhoz="" képest="" (student="" t-teszt,="" t="4.171," p="">< 0,01)="" (2c.="" ábra).="" cte="" hosszú="" távú="" orális="" adagolása="" nagy="" dózissal="" (student="" t-teszt,="" t="2.548," p="">< 0,05),="" és="" flx="" (student="" t-teszt,="" t="2.263," p="">< 0,05)="" )="" növelte="" a="" bdnf="" expressziót="" a="" cus="" modellcsoporthoz="" képest.="" az="" alacsony="" dózisú="" cte="" nem="" mutatott="" szignifikáns="" hatást="" a="" bdnf="">

A {0}}HT-szint a CUS-patkányok vastagbelében különbözött a hippocampusban mérttől, és a 4-hetes stresszeljárás nem volt hatással a vastagbél 5-HT-jára (2D ábra). ). Ezzel szemben a CTE orális adagolása nagy dózissal stimulálta a 5-HT-szintet a vastagbélben a CUS modellcsoporttal összehasonlítva (Student t-teszt, t=2.173, p < 0,05).="" az="" alacsony="" dózisú="" cte="" nem="" mutatott="" hatást="" a="" vastagbél="" 5-ht="">

A CTE szabályozta a CUS-patkányok bélmikrobiális összetételét

A CTE hatását a CUS patkányok bélmikrobiális összetételére a 16S rRNS génszekvenáláson alapuló módszerrel értékeltük. Azt találták, hogy a CTE 28 napos orális adagolása megváltoztatta a CUS-patkányok bélmikrobiális összetételét, és számos hatással volt

mikrobiális taxonómiai szintek a patkánycsoportok között (1. osztályszint, 1. rendi szint, 1. családszint, 8. nemzetségszint és 2. fajszint). Ez arra utal, hogy a bélmikrobiális közösség szerepet játszhat a CTE antidepresszáns hatásaiban. A különböző taxonómiai szinteken jelentősen megváltozott bélmikrobiális taxonok részletes információi a 2. táblázatban láthatók.

A MiSeq szekvenálás összesen 2 132 980 nyers leolvasást eredményezett, minőség-ellenőrzési, zajtalanítási és kiméraeltávolítási folyamatot követően. Ezután a leolvasásokat OTU-kba csoportosították, amelyeket a törzstől a fajig a taxonokhoz rendeltek. A béta diverzitáselemzés vizsgálatát az öt patkánycsoport baktériumközösségi mintáinak hasonlóságának feltárására végezték. A 3A ábrán látható a PCoA, amely a bélmikrobióta súlyozott UniFrac-távolságán alapul az öt vizsgálati patkánycsoportból. A PCoA-val végzett béta-diverzitás-analízis a mikrobiális közösség egyértelmű elkülönülését mutatta a kontrollcsoporttól és a CUS-modellcsoporttól, míg a nagy dózisú CTE-csoport közelebb került a kontrollcsoporthoz a CUS-csoporthoz képest.

Metastatic analysis was used to investigate the differences in gut microbial taxonomic composition among different groups. At the phylum level, the most dominant microbial taxa in the five rat groups were Firmicutes and Bacteroidetes (Figure 3B). Lactobacillus, Ruminococcus, Blautia, Bacteroides, and Prevotella were the most highly abundant microbial taxa at the genus level (Figure 3C). The two dominant phyla, Firmicutes and Bacteroidetes, accounted for a combined relative abundance of >90 százalék. Amint az S5A, B kiegészítő ábrákon látható, a 4 hetes stresszeljárás nem szignifikáns tendenciát okozott a Firmicutes szint növekedése és a Bacteroidetes nem szignifikáns csökkenése a CUS modellcsoportban a kontrollcsoporthoz képest. Napi CTE magas és alacsony dózisú beadása után a Firmicutes és Bacteroidetes relatív abundanciája visszatért a kontrollcsoporthoz hasonló szintre, bár statisztikailag nem szignifikánsan. És bár hasonló változásokat figyeltek meg a Firmicutes / Bacteroidetes arányban a patkánycsoportok között, nem mutattak ki statisztikai különbségeket (S5C kiegészítő ábra). Nem szignifikáns tendenciát találtunk a phyla Cyanobacteria csökkent szintje felé a CUS modellcsoportban a nem stresszes kontroll patkányokhoz képest; mivel a CTE nagy dózisú beadása a cianobaktériumok relatív abundanciájának jelentős növekedését eredményezte a CUS-csoporthoz képest (kiegészítő S5D ábra).

A nemzetség szintjén a Bacteroides és a Ruminococcus volt a két legnagyobb mennyiségben előforduló mikrobiális taxon, amelyek körülbelül 30 százalékos relatív abundanciát képviseltek mind az öt patkánycsoportban. A négyhetes stresszeljárás szignifikánsan csökkentette a Bacteroides relatív abundanciáját és a Ruminococcus szignifikáns növekedését a CUS modellcsoportban a nem stresszes kontroll patkányokhoz képest (4A, B ábra). A CTE hosszú távú alkalmazása a Bacteroides abundanciájának jelentős növekedését, valamint a Ruminococcus szignifikáns csökkenését eredményezte a CUS patkányokhoz képest. Ezenkívül a Parabacteroides, Butyricimonas, Deinococcus, Weissella, Trichococcus és Brachybacterium hat nemzetsége statisztikailag szignifikáns különbséget mutatott a CUS modellcsoport és a kontrollcsoport között (4C-H. ábra). 28 napos CTE kezelés után a fent említett hat nemzetség relatív abundanciája a kontrollcsoportéhoz hasonló szintre változott.

A Deinococcus alacsony abundanciája különböző taxonómiai szinteken, beleértve az osztályszintet (Deinococcusok), a rendi szintet (Deinococcales), a családot (Deinococcaceae) és a nemzetség szintjét (Deinococcus) a CUS patkánycsoportban, míg a kontrollban nem sikerült kimutatni. csoport és az adminisztrációs csoportok (5A-D. ábrák).

Fajszinten a Weissella beninensis sokkal alacsonyabb volt a CUS-csoportban, mint a kontrollcsoportban, és a relatív abundancia szignifikáns növekedését figyelték meg nagy dózisú CTE beadása után (5E. ábra). Ezzel szemben a CTE beadása megfordította a Brachybacterium konglomerátum relatív abundanciájának jelentős növekedését, amelyet a CUS patkányokban figyeltek meg (5F ábra).

CTE-modulált SCFA-k CUS-patkányokban

A patkány székletminták SCFA-koncentrációit (beleértve az acetátot, propionátot, butirátot, izobutirátot, valeriánsavat, izovaleriánsavat és hexánsavat) GC-vel elemeztük, és a 6. ábrán mutatjuk be. Az acetát szintjei [egyirányú ANOVA, F( 4,32)=2.721, p=0.0467; Dunnett-teszt, p < 0.05]="" és="" hexánsav="" [egyutas="" anova,="" f(4,30)="3.028," p="" {{15="" }}.0328;="" a="" dunnett-teszt,="" p="">< 0,05]="" szignifikánsan="" megemelkedett="" a="" cus-modell="" csoport="" patkányaiban="" a="" kontrollcsoporthoz="" képest.="" cte="" hosszú="" távú,="" nagy="" dózisú,="" acetáttal="" (student-teszt,="" t="2.182," p="">< 0,05)="" és="" hexánsavval="" [egyirányú="" anova,="" f(4,30)="3" .028,="" p="0.0328;" a="" dunnett-teszt,="" p="">< 0,05]="" koncentrációja="" túlnyomórészt="" csökkent="" a="" cus-csoporthoz="" képest,="" ami="" arra="" utal,="" hogy="" a="" cte="" a="" rendezetlen="" neuroaktív="" metabolit="" scfa-k="" modulációján="" keresztül="" fejtheti="" ki="" antidepresszáns="" hatását.="" a="" cte="" alkalmazása="" alacsony="" dózisú="" csoportban="" csökkenő="" tendenciát="" mutatott,="" de="" nem="" volt="" jelentős="" hatása="" az="" acetát="" és="" a="" hexánsav="">

A bél mikrobiota, a neurotranszmitterek és a neurotropinok a hippocampusban, a 5-HT a vastagbélben és az SCFA-k korrelációs elemzése

A megváltozott bélmikrobióta nemzetségszinten, a megváltozott neurotranszmitterek és neurotrofinok hippocampusban és vastagbélben, valamint az SCFA-k zavaró koncentrációjának funkcionális kapcsolatának feltárására Pearson-féle korrelációs együtthatókat dolgoztunk ki (Meng et al., 2017). A köztük lévő összefüggéseket (r > 0,4 vagy r < -0,4,="" p="">< 0,05)="" a="" 7.="" ábra="" mutatja.="" az="" együtthatók="" erős="" korrelációt="" jeleztek="" a="" nemzetség="" szintjén="" a="" megváltozott="" bélmikrobióta="" összetétel="" és="" a="" koncentráció="" között.="" hétféle="" scfa-t="" és="" depresszióval="" kapcsolatos="" monoamin="" neurotranszmittereket="" (5-ht="" és="" ne).="" a="" ruminococcus="" abundanciája="" szignifikáns="" negatív="" korrelációt="" mutatott="" a="" 5-ht-koncentrációval="" a="" hippocampusban,="" ami="" azt="" jelenti,="" hogy="" a="" cus-eljárás="" a="" ruminococcus="" relatív="" abundanciájának="" növekedéséhez="" és="" a="" 5-ht-koncentráció="" csökkenéséhez="" vezet.="" a="" cte-kezelés="" után="" a="" ruminococcus="" relatív="" abundanciája="" a="" kontrollcsoport="" szintjére="" csökkent,="" és="" a="" 5-ht-szintek="" javultak.="" ezenkívül="" a="" bacteroides="" relatív="" abundanciája="" pozitívan="" korrelált="" a="">

hippocampus, és negatívan kapcsolódik a butirát, izobutirát, valeriánsav, izovaleriánsav és hexánsav koncentrációjához; a Parabacteroides abundanciája szignifikáns pozitív korrelációt mutatott a 5-HT szinttel a hippocampusban és a propionát koncentrációban, míg negatív korrelációt mutatott az izobutirát és izovaleriánsav koncentrációkkal; szignifikáns pozitív összefüggést figyeltek meg a Butyricimonas relatív abundanciája és az NE szint között a hippocampusban, és a Deinococcus relatív abundanciája pozitívan korrelált az acetát koncentrációval. Ez bebizonyította, hogy a CTE a bél mikrobiota összetételének megváltoztatásával, a hippocampus neurotranszmitter szintjének megzavarásával és a neuroaktív metabolitok SCFA-k helyreállításával fejtheti ki antidepresszáns hatását. A korrelációs elemzés részletes adatait az S3 kiegészítő táblázat tartalmazza.

cistanchekezelni tudjacukorbetegség

VITA

A CTE depresszióellenes aktivitásának és klinikai előnyeinek azonosítása

Ez a tanulmány értékelte a CTE antidepresszáns aktivitását CUS patkányokban, megerősítette az in vivo modellek, például az FST, SPT, OFT és NSFT hatékonyságát, és megerősítette aC. tubulosaCUS patkányokban, amelyet gyakran használnak veseelégtelenség, impotencia és nőstény meddőség kezelésére TCM-ben. Jelenleg a leggyakrabban felírt antidepresszánsok a szerotonin és noradrenalin újrafelvételt gátló (SNRI) venlafaxin, ezt követi a szelektív szerotonin újrafelvételt gátló (SSRI) FLX (Thase et al., 2001; Mcintyre, 2017). Azonban kimutatták, hogy ezek az antidepresszánsok súlyos mellékhatásokkal rendelkeznek, beleértve a szívtoxicitást, a vérnyomást, a szexuális diszfunkciót és az alvászavarokat (Ferguson, 2001; Jin és mtsai, 2015). Az összes antidepresszáns osztály közül az SSRI és az SNRI korrelál a szexuális diszfunkció legmagasabb előfordulási gyakoriságával (Montejogonzalez és mtsai, 1997; Clayton és mtsai, 2014). Különösen figyelemre méltó a szexuális zavarok általános előfordulása, amely 59,1 százalék (604/1022), ha az összes antidepresszánst összességében tekintjük; és a betegek mintegy 40 százaléka alacsony toleranciát mutat a szexuális diszfunkcióval szemben, így a gyógyszerekkel való együttműködés súlyosan érintett (Clayton, 2001). Tekintettel a jelenlegi depressziókezelés hátrányaira, a Cistanches Herba nagy potenciállal rendelkezik a klinikai alkalmazásban, nemcsak erős antidepresszáns hatásának köszönhetően, hanem azért is, mertCistanches Herbahagyományosan az impotencia kezelésére használják, aminek legalább egy aggályát ki kell küszöbölnie az egyéb antidepresszánsok által okozott leggyakoribb mellékhatások közül (Fu et al., 2017). Ezenkívül a Cistanches Herba nem mutatja a toxicitás jeleit és a kezeléssel kapcsolatos változásokat