A galluszsavval konjugált peptidkészítmény (Gal2–Pep) antioxidáns és öregedésgátló hatása Ⅱ
May 04, 2023
3. Eredmények és megbeszélés
3.1. Galluszsav szintézise és konjugálása peptiddel
A szintetizált TPPTTP, galloil-TPPTTP (Gal-Pep) és Gal2-Pep peptideket félpreparatív RP-vel nyertük és tisztítottuk.HPLC. Az 1a. ábra és az 1. séma a galluszsav KTPPTTP-vel való konjugációs stratégiáját mutatja Gal2–Pep formájában. Az SPPS-módszerben a peptidszintézis során keletkező szennyeződések általában oldalreagált peptideket, aminosav-védőcsoportokat, valamint a szintézishez és tisztításhoz használt oldószereket tartalmaznak. A peptidszintézisben használt HOBt-ról ismert, hogy gátolja a racemizációt és javítja a peptidszintézis hatékonyságát.17–19 A szintézishez használt aminosavvédő csoportok és oldószerek eltávolítása érdekében többszöri mosást végeztünk oldószerekkel, mint például DMF és DCM. a peptid szintézis folyamata. Még az utolsó mosási lépés után is nyomokban jelen vannak a szennyeződések, beleértve az aminosav-védőcsoportokat. Annak érdekében, hogy a több kutató által közölt több mint 90 százalékos peptidtisztaság megfeleljen, 20–22-es félpreparatív HPLC-t végeztünk polírozási lépésként, hogy a HPLC analízis eredményeként 99,2 százalékos tisztaságú végső peptidet kapjunk (lásd 1. S1†). A tisztított peptidterméket Q-TOF segítségével elemeztük, hogy megerősítsük a sikeres szintézist (1b–d. ábra).
Kattintson ide, ha többet szeretne megtudni a Cistanche Treat Anti-Aging termékről
3.2. Sejtéletképességi vizsgálatok
3.3. A szintetizált peptidek antioxidáns hatása
A TPPTTP-nek semmilyen koncentrációban nem volt gyökfogó aktivitása, míg a GA, a Gal–Pep és a Gal2–Pep nagyobb gyökfogó aktivitást mutatott koncentrációfüggő módon.
Ban benkülönösen, Gal2–Pep mutatta be a leghatékonyabbatantioxidánstevékenység; 10-es koncentrációbanmM, GA, Gal–Pep és Gal2–Elevenség13,6 százalékos, 24,23 százalékos és 26.{5}} százalékos gyökfogó aktivitással rendelkezett,illetőleg. Ez azt jelzi, hogy a TPPTTP kötődik a GA-hoznem gátolják a gyökfogó aktivitást. 3b. ábra coNFIrms aa minták stabilitása konFirmed azok radikális értékeléséveltisztító tevékenység szobahőmérsékleten tárolva. GA megtartottagyökfogó aktivitása legfeljebb egy hétig, de, aFtkét hét, ez az aktivitás több mint 60 százalékkal csökkent . A másikonkéz, Gal–Pep és Gal2–Pep megőrizte ürítési tevékenységéttöbb mint két hétig. Különösen Gal2–Pepnek radikális scav volt50 százalékos aktivitást mutatott már a negyedik héten is. Ezek az eredményekazt sugallják, hogy a GA kötődése a TPPTTP-hez stabilizálja annak gyökfogásáttevékenység. Egyes tanulmányok kimutatták, hogy az aszkorbinsav stabilizálódikpeptidekkel való megkötésével.12,25 Úgy gondoljuk, hogy a GA stabil lehetazonos módon peptiddel való megkötésével lizáltuk.
Aa peptidek antioxidáns hatásaH2O2 által kiváltott intracelluláris oxidatív stressz jelenlétében is teszteltük DCF DA assay segítségével (4. ábra). A sejteken lévő minták 100 mM koncentrációban történő kezelése után 24 óra elteltével DCF-DA-t töltöttünk a sejtekre, majd a sejteket 30 percig H2O2-vel kezeltük, és a DCF fluoreszcencia intenzitását gerjesztésnél figyeltük meg. 485 nm hullámhossz és 535 nm emissziós hullámhossz. Az oxidatív stressznek kitett sejtek 1 mM H2O2-val több mint háromszor nagyobb fluoreszcencia intenzitást mutattak, mint a negatív kontrollé; a Gal2–Pep kezelés azonban csak 67 százalékát produkált a csak H2O2-val kezelt sejtek által termelt fluoreszcenciának. TPPTTP jelenlétében, amely nem mutatott gyökfogó aktivitást (3a. ábra), a H2O2 által okozott ROS stressz körülbelül 20 százalékkal csökkent, ami alátámasztja a korábbi kutatásokat, amelyek szerint a TPPTTP csökkenti a ROS szintjét a sejtekben.24 Amikor a sejtek csak GA-val kezelték, a ROS-szintekben nem volt jelentős változás. Összességében ezek az eredmények azt sugallják, hogy a Gal2–Pep, amely két GA-molekulát kombinál egy peptiddel, stabil és hatékony antioxidáns.
3.4. A szintetizált peptidek hatása a mitokondrium membránpotenciáljára
Ebben a vizsgálatban JC-1 festéket használtak a szintetizált peptidek MmP-re (DJm) gyakorolt hatásának vizsgálatára. Az MmP a mitokondriális működés fontos paramétereként működik, és ismert, hogy számos betegséggel, például Alzheimer-kórral és Huntington-kórral társul.26 A JC-1 festék vörösinget hoz létre a zöld emisszióból azáltal, hogy felhalmozódik a mitokondriumokban és J-aggregátumokat képez. A HaCaT és a fibroblaszt sejteket a szintetizált peptidekkel 24 órán keresztül kezeltük, majd a sejteket 10 percig JC-1 festékkel kezeltük, majd mikrolemez-leolvasóval (zöld lEx ¼ 475 nm és lEm) mértük a fluoreszcencia intenzitását. ¼ 530 nm, vörös lEx ¼ 475 nm és lEm ¼ 590 nm). A vörös-zöld fluoreszcencia arányát a negatív kontrollhoz viszonyított többszörös változásként fejeztük ki (5. ábra). A GA-val és a peptiddel egymástól függetlenül kezelt HaCaT sejtek nem mutattak szignifikáns változást a negatív kontrollcsoporthoz képest, míg a Gal2–Pep szignifikáns különbséget mutatott, 1.{15}}szeresére nőtt a kontrollhoz képest. A Gal2–Pep-pel kezelt fibroblaszt sejtek szintén szignifikánsan
4. ábra Intracelluláris antioxidáns aktivitási vizsgálatok DCF-DA alkalmazásával 100 mM galluszsav- és peptidkoncentrációnál. 24 órás kezelés után H2O2-t adtunk hozzá, és 3 0 percig inkubáltuk, majd megmértük a DCF fluoreszcencia intenzitását. A csillagok statisztikailag szignifikáns különbségeket jeleznek (*p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,001).
3.5. Elasztáz gátló aktivitás
3.6. Az I. típusú kollagén, MMP-1 és PGC-1a gének expressziója
7. ábra Génexpressziós elemzés dermális fibroblasztokban RT-qPCR segítségével: (a) I-es típusú kollagén, (b) MMP-1 és (c) PGC-1a.
A PGC-1a expressziója 8 óra elteltével volt a legmagasabb minden kezelésnél, a GA, TPPTTP, Gal–Pep és Gal2–Pep expressziós aránya 2.06-, 1.{{6} }, 1.07- és 2.05-hajtja. Azonban a többi kezeléstől eltérően a Gal2–Pep 24 óra elteltével 1.{14}}szeresére növelte a PGC{12}}expressziót. PGC-1aszabályozza a mitokondriumok szintézisét és antioxidáns hatásátés bejelentikcsökken az öregedéssel.29–32 Ezért a Gal2–Pep potenciálisan hatékony antioxidánsként használható, amely hatékonyan véd a ROS ellen.
Összességében a Gal2–Pep növelte a PGC-1a és a kollagén expresszióját a GA és a TPPTTP önmagában történő hatásához képest, míg aaz MMP{0}} expressziója csökkenni kezdett, ezzel illusztrálva annak felhasználási lehetőségeitöregedésgátló kozmetikumok.
4. Következtetés
Összeférhetetlenség
Nincsenek kijelentendő konfliktusok.
Köszönetnyilvánítás
Ezt a tanulmányt a Korea Industrial Complex Corp. (KICOX, NTIS No. 1415165722) és az Inha Egyetem kutatási ösztöndíja támogatta.
Hivatkozások
20 P. Song, W. Du, W. Li, L. Zhu, W. Zhang, X. Gao, Y. Tao és F. Ge, Nanomater. Nanotechnol., 2020, 10, 1–10.
21 M. De Zotti, B. Biondi, Y. Park, K.-S. Hahm, M. Crisma, C. Toniolo és F. Formaggio, Amino Acids, 2012, 43, 1761–1777.
22 Z. Zhai, K. Xu, L. Mei, C. Wu, J. Liu, Z. Liu, L. Wan és W. Zhong, So Matter, 2019, 15, 8603–{{4 }}.
23 DJ Tobin, J. Tissue Viability, 2017, 26, 37–46.
