Az apikális nyírófeszültség fokozott szerves kationtranszportja az emberi OCT2/MATE-ben1-A Madin-Darby kutya vesesejtek transzfektált sejtjei ciliáris érzékelést tartalmaznak

További információért:emily.li@wecistanche.com

Aishwarya Jayagopal, Paul R. Brakeman, Peter Soler, Nicholas Ferrell, William Fissell, Deanna L. Kroetz és Shuvo Roy

Biomérnöki és Terápiás Tudományok (AJ, PS, DLK, SR) és Gyermekgyógyászati ​​(PRB) osztályok,

University of California San Francisco (UCSF), San Francisco, California;

és Orvostudományi Tanszék, Nephrológiai Osztály, Vanderbilt Egyetemi Orvosi Központ, Nashville, Tennessee (NF, WF)

ABSZTRAKT

Aktív szállításvese-A proximális tubulusok jelentős szerepet játszanak a gyógyszereloszlásban. A gyógyszerfejlesztés során becslések szerintvese-kiválasztás elengedhetetlen a dózis meghatározásához. A vese bioreaktorai, amelyek a vese fiziológiás rokonait, például az áramlás okozta nyírófeszültséget reprodukálják, jobban megjósolhatják a gyógyszer in vivo viselkedését, mint a jelenlegi in vitro modellek. Ebben a tanulmányban a nyírófeszültség szerepét vizsgáltuk a 4-(4-(dimetilamino)-sztiril)-N-metil-piridinium-jodid (ASP plusz) aktív transzportjában Madin-Darby kutya által.vesesejteketexogén expressziója a humán szerves kation transzporterek szerves kation transzporter 2 (OCT2) és multidrug és toxin extrudálási fehérje 1 (MATE1). A párhuzamos lemezen, folyamatos tápközeg-perfúzió mellett tenyésztett sejtek szoros egyrétegű réteget alkottak, amely nagy gátat szab az inulinnak. A növekvő nyírófeszültségre (0.2-2 din/cm) válaszul a sejtek ennek megfelelő növekedést mutattak az ASP plus transzportjában, ami 2-nél a maximális 4.2--szeres növekedést érte el. dynes/cm² a statikus körülmények között tenyésztett sejtekhez képest. Ezt a transzportot imipraminnal gátoltuk, ami azt jelzi, hogy nyírófeszültség esetén aktív transzport jelen volt. A 2 dyn/cm² nyírófeszültségnek kitett sejtek RNS-expressziójának növekedését is mutatták mind a transzfektált emberben, mind az endogén OCT2-ben (3.{12}} és 2.{14}}szeres). A csillók ammónium-szulfáttal történő eltávolítása kiküszöbölte a nyírás hatását az ASP-re és a transzportra 0,5 dyn/cm²-nél, de nem volt hatással az ASP-re és a transzportra statikus körülmények között. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a nyírófeszültség befolyásolja a szerves kationok aktív transzportjátvese-cső alakúhámsejtek csillóktól függő módon.

A Cistanche jót tesz a veseműködésnek

Bevezetés

Az optimális gyógyszerjelöltek kiválasztásának preklinikai módszereiben elért jelentős előrelépés ellenére a gyógyszerfejlesztés továbbra is hosszú és költséges folyamat, amely nagyon alacsony hozamot eredményez a forgalomba hozott új molekuláris entitások tekintetében (Watkins, 2011). A preklinikai modellek egyik fő hiányossága az, hogy nem tudják előre jelezni a kiürülést és a toxicitást emberekben. A preklinikai vizsgálatokban sikeres gyógyszerek körülbelül 30 százaléka kudarcot vall az emberben a váratlan clearance-értékek vagy toxicitások következtében (Kola és Landis, 2004).

A vese különösen fontos célpontja az in vitro sejtkultúra modellezésnek, mivel ez felelős az összes gyógyszer és a legtöbb metabolit több mint egyharmadának eliminációjáért (Morrissey et al., 2013). Azvese-A proximális tubulus fontos a gyógyszertesztelés során a fejlesztés során, mivel ez végzi a gyógyszerjelöltek aktív transzportjának nagy részét, és különösen érzékeny a toxikus sérülésekre (Giacominiet al., 2010). Azvese-csatornaa hámsejtek egyrétegű rétege, amelynek szűrlete az apikális felületen keresztül áramlik. A tubuláris epitélium alatt alapmembrán található, és a szomszédos peritubuláris kapillárisok lehetővé teszik a víz és a köszönés visszaszívódását. A proximális tubulusok mikrokörnyezete, különösen a folyékony nyírófeszültség és az apikobazális onkotikus gradiensek, nem teljesen reprodukálható a hagyományos sejttenyésztési technikákkal. A kiemelkedő in vivo fiziológiát rögzítő hámsejt-bioreaktorok javíthatják az in vitro vizsgálatokból származó clearance- és toxicitás-előrejelzések pontosságát (Pfaller és Gstraunthaler, 1998; Astashkina et al., 2012).

Az egyre növekvő bizonyítékok azt mutatják, hogy a proximális tubulussejtek morfológiája és funkcionalitása a növekedési környezettől függően változhat, például a növekedési felület porozitásától, mindkét oldalon folyadéknak való kitettségtől és/vagy a folyadék nyírófeszültségétől függően. Essig és Friedlander (2003), valamint laboratóriumunk (Ferrell és mtsai, 2010) korábbi munkái kimutatták, hogy a tubuláris folyadékáramlás indukálta átrendeződést a proximális tubulussejtek apikális aktin citoszkeletonjában (Ferrell et al., 2010). . Ezt követően számos tanulmány kimutatta, hogy a nyírófeszültség befolyásolja a többszörös felvételek és efflux transzporterek expressziós szintjét és lokalizációját, beleértve a nátrium-hidrogén antiporter 3-at. Na/K-ATPáz, glükóz transzporterek, epiteliális nátriumcsatorna, valamint az endocitózis receptorok, a megalin és a tubulin (Duan et al., 2010; Raghavan et al., 2014; Jansen és mtsai., 2016; Ernandez és mtsai, 2018). Más munkák kimutatták, hogy a nyírási áramlás egy cső alakú bioreaktorrendszerben orientálódik és megnyúlikvese-cső alakúsejteket az áramlási útvonal mentén (Venzac et al. 2018). Az in vitro bizonyítékok azt mutatják, hogy a citoszkeletális szerkezetben és a transzportfunkcióban bekövetkezett változások valószínűleg a csillók mechanoszenzoros funkciójával állnak összefüggésben (Overgaard és mtsai. 2009; Raghavan et al.. 2014); azonban kevés tanulmány foglalkozott a nyírófeszültség hatásával a vesesejtek gyógyszertranszportereire. Ezenkívül keveset tudunk a különböző nyírási sebességeknek a sejtek működésére gyakorolt ​​hatásáról, különösen a nyírófeszültségnek való tartós kitettségről. A legtöbb tanulmány egyetlen nyírófeszültség-sebességet vett figyelembe, és csak rövid távú kísérleteket (1-6 óra) végeztek, ami megnehezíti a nyírás valódi hatásai és a mikrokörnyezet hirtelen változásaira adott celluláris stresszválasz közötti különbségtételt (Duan et al.2010; Jang et al.2013: Maggiorani et al.2015).

Itt egy mikrofluidikus bioreaktort használtak a fokozatos nyírófeszültség hatásának vizsgálatára avese-proximális tubulussejt gyógyszertranszporterek szerves kation transzporter 2 (OCT2) és multidrug és toxin extrudáló fehérje 1 (MATE1). Kimutattuk, hogy a növekvő apikális nyírófeszültség a szerves kationtranszport és a transzporter expresszió növekedéséhez vezet, és hogy a csillók részt vesznek ebben a nyírófeszültségre adott sejtválaszban.

Anyagok és metódusok

Készülék gyártás és összeszerelés. Korábban közzétettük egy párhuzamos lemezes bioreaktor tervünket, amely állítható magasságú folyadékáramlási útvonalat biztosít a sejtek apikális oldalán, és statikus tartályt a bazális oldalon (Brakeman et al., 2016). Az itt bemutatott munkához adaptáltuk korábbi tervünket, hogy létrehozzunk egy multiplexelt eszközt négy különálló áramlási útvonallal, amely lehetővé teszi négy biológiai feltétel egyidejű tesztelését (1. ábra). Mindegyik eszköz három rétegből áll: egy alapból 5-ml apikális tartályból, egy középső lemezből, amely a Snapwell betétet tartja (Costar, Corning, Corning, NY), 1,12 cm²-es cellával, valamint egy felső lemezből, amely tartalmazza egy 1-–2- ml bazolaterális tartály. A tányérok

poliszulfonból készültek, hogy lehetővé tegyék az autoklávozással történő sterilizálást. Lézerrel vágott, 500- és 1000- um magasságú szilikon tömítések kerültek az egyes lemezkészletek közé a folyadékrekeszek tömítésére, az apikális oldalra pedig a csatorna magasságának meghatározására. A bioreaktort csavarokkal szerelték össze. A közegtartály és a buborékcsapda beépített oszlop volt. A bemenetek és kimenetek szöges csatlakozókkal csatlakoztak a Masterflex LS14 szilikon csőhöz, amelynek belső átmérője 16- mm (Cole Parmer Lab Supplies, Vernon Hills, IL). A folyadékáramlást és így az apikális nyírófeszültséget perisztaltikus pumpával (Cole Parmer) állítottuk be és szabályoztuk.

Sejtkultúra és -áramlás. Az üres vektorral vagy egy pár felvétel és kiáramlás transzporterrel (hOCT2/hMATE1) transzfektált MDCK sejteket (Konig et al.2011) Dr. Martin Fromm (Erlangen, Németország) biztosította és minimális esszenciális tápközeg Earle kiegyensúlyozott sóoldattal (UCSF Cell Culture Facility), 10% magzati szarvasmarha szérummal (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) és 1% penicillin-sztreptomicinnel (UCSF Cell Culture Facility). Ötszáz mikrogramm/ml higromicint (UCSF Cell Culture Facility) és 100 mg/h ml geneticint (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) adtunk a táptalajhoz a kétszeresen transzfektált sejtekhez. Az áramlási kísérletekhez hOCT2/hMATE1 MDCK sejt 300,{11}} sejt/lyuk (250,000 sejt/cm") sűrűséggel Snapwell inszertek (Corning) aljára szélesztettük, statikus körülmények között növesztettük összefolyásig. Az apikális táptalaj áramlását 7 nap alatt 0,1-ről 1-6mlmin-re növeltük, amíg el nem érték a kívánt nyírófeszültséget, majd 72 órán keresztül stabilan hagytuk a kísérlet előtt. A sejteket statikus körülmények között ugyanannyi ideig növesztettük, mint a kontrollokat .

Immunfluoreszcencia. A sejteket 4 százalékos paraformaldehiddel (Thermo Fisher Scientific) fixáltuk, 0,1 százalékos Triton-Xin PBS-sel (Sigma-Aldrich) permeabilizáltuk, és szarvasmarha-szérumalbuminnal (Sigma-Aldrich) blokkoltuk. Ezt követően 1:50 hígítású Alexa 488-mal jelölt zonula occludens-1 egér monoklonális antitesttel (Life Technologies, Carlsbad, CA) vagy elsődleges acetilált -tubulin egér monoklonális antitesttel (Life Technologies) inkubáltuk őket 60 percig. Az a-tubulin antitesttel kezelt sejteket ezután egy másodlagos 561 egér kecske elleni antitesttel (Life Technologies) és falloidinnel (Thermo Fisher Scientific) inkubáltuk az F-aktin festéshez. A képalkotást Nikon (Tokió, Japán) spektrális konfokális mikroszkóppal végeztük 40-szeres olajobjektívvel.

Barrier Performance. Az inulin, egy 5000 Da polimer, a glomeruláris filtrációs sebesség jól ismert markere, és a proximális tubulusok szivárgásának markere in vivo (Sohtell és mtsai, 1983):

FITC-vel jelölt inulint (Sigma-Aldrich) adtunk az apikális táptalajhoz, és hagytuk átfolyni az eszközökön. A mintákat 24 óránként gyűjtöttük az alaptartályból, és Genios Pro fluoreszcens lemezleolvasóval (Tecan, Mannedorf, Svájc) analizáltuk az inulintartalmat. A sejt egyrétegű gát funkcióját az apikális és bazális kompartmentekben mért inulinszintekből számítottuk ki az 1. egyenlet szerint. Itt a Capital az inulin koncentrációja az apikális kompartmentben, és a C Mal a bazális kompartmentben lévő koncentráció. Az inulinszivárgást úgy számítottuk ki, hogy a bazális (donor) kompartment koncentrációját osztották a sejtterülettel 24 óra elteltével.

ASP plusz szállítás. A transzdukált transzporter géneket 10 mM Na-butiráttal (Sigma-Aldrich) indukáltuk 24 órával a transzportkísérlet előtt, a korábban leírtak szerint (Konig et al, 2011). Adott esetben a sejteket egy inhibitorral (500 μM imipramin vagy 1 mM cimetidin (Sigma-Aldrich)) inkubáltuk a bazális oldalon 30 percig, majd 25 μM 4-(4-dimetil-amino)-t adtunk hozzá. sztiril-N-metil-piridinium (ASP plusz) (Life Technologies) és 1 órán át tartó inkubálás. A mintákat az apikális és a bazális táptalajból gyűjtöttük. A sejteket ezután háromszor öblítettük jéghideg foszfáttal pufferolt sóoldattal, és lizáltuk az ASP, valamint az akkumuláció és a transzport mérésére. A transzport kísérleteket egyidejűleg végeztük nyírófeszültség alatt álló sejteken és statikus körülmények között tenyésztettük. Az ASP plusz koncentrációt Genios Pro fluoreszcens lemezolvasóval (Tecan) határoztuk meg 485 nm gerjesztési hullámhosszon és 590 nm emissziós hullámhosszon.

Fehérje mennyiségi meghatározása. A sejteket 1% SDS-10 M NaOH lízispufferrel lizáltuk, miközben egy éjszakán át rázattuk. A fehérjetartalmat standard Pierce BCA protein assay kit (Thermo Fisher) segítségével mértük. Adott esetben a fehérjetartalmat a sejtnövekedési területre normalizáltuk.

RNS expresszió. Az RNS-t a sejtekből RNeasy RNA Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Németország) segítségével extraháltuk, a cDNS-t pedig egy script kit (Bio-Rad, Hercules, CA) segítségével állítottuk elő. A cDNS-t emberi és kutya OCT2 és MATE1 kimutatására használtuk. kutya P-glikoproteint (P-GP) kvantitatív reverz transzkriptáz-polimeráz láncreakcióval, Tagman-teszt és próbák (Applied Biosystems) alkalmazásával a Fast Realtime PCR készüléken (Applied Biosystems). Az S18 riboszómális proteint (RS-18) háztartási kontrollként használtuk. A nyírófeszültség hatását a transzporter expresszióra a 4ACt módszerrel elemeztük az RS-18-hez viszonyított transzporterszintek felhasználásával (Peters et al. 2007; Schmittgen és Livak, 2008). A P-GP-t a nyírófeszültség transzporter expresszióra gyakorolt ​​globális hatásának mérésére használták.

Deciliáció. A sejteket összefolyásig növesztjük, majd 30 mM ammónium-szulfát (Fluka AG) nélkül vagy jelenlétében 24 órán át inkubáljuk az ASP plusz transzport mérése előtt (Oxergard et al 2009). A csillók jelenlétét az a-tubulin leképezésével határoztuk meg, amint azt már leírtuk.

Statisztika. Minden kísérletet három párhuzamosban végeztünk, minden kísérletben legalább két technikai ismétléssel. Az adatokat átlag ± SD-ben fejezzük ki, és grafikonon box- és whisker-grafikonokkal ábrázoljuk. A statisztikai elemzéseket párosítatlan egy- vagy kétirányú varianciaanalízissel végeztük, és a P-érték<0.05 was="" considered="" significant.="" data="" were="" analyzed="" using="" prism="" version="" 6.0="" (graphpad,="" san="" diego,="">

Eredmények

Sejtmorfológia és gátfunkció. Az Immunofluo által a közelmúltban aláfolyt sejteken végzett elemzése egyenletes egyrétegű képződést mutatott ki a szoros kapcsolódású fehérjével, a zonula occludens-szel-1, amely a sejtek közötti szoros kapcsolatokra lokalizálódik mind statikus, mind áramlási körülmények között (2. ábra, A–C). A teljes fehérjetartalom mennyiségi meghatározása az egyrétegű réteg négyzetcentiméterenkénti fehérjetartalmának akár 16-szeres növekedését is kimutatta nyírófeszültség hatására (2D. ábra). Ezután megmértük az inulin permeabilitását, amely a proximális tubulusok szivárgása markere az egyrétegű rétegben. Az eszközök 97,9%-os 6 1,42%-os gátteljesítményt tartottak fenn 7 napos tenyésztés során, legfeljebb 2 dyn/cm2 nyírófeszültség mellett (2E. ábra), ami a végső inulinszivárgási arányt a következő 6. napján {15}},13–0,69 mg/cm2 naponta.

A nyírófeszültség hatása a szerves kationtranszportra. Az OCT2 és MATE1 autofluoreszcens szubsztrátja, az ASP plus transzportját 1 órán keresztül mértük különböző nyírófeszültségi szinteknél (0.2-2 dynes/cm²). A hOCT2-t és a hMATE1-et exogén expresszáló MDCK-sejtek 4-szeres növekedést mutattak az ASP plusz transzportban a 2 dyn/cm² nyírófeszültség hatására, ami mind a sejtakkumulációban (3A. ábra), mind a transzcelluláris transzportban (3. ábra) tükröződik. 3B). A nyírófeszültség hatása az ASP-re plusz akkumulációra vagy transzcelluláris transzportra hasonló volt 0,5 és 2 dyn/cm² nyírófeszültség mellett. Annak megállapítására, hogy az aktív ASP plusz transzport megnövekedett-e, megmértük az ASP plus transzportját a 0,2 dyn/cm nyírófeszültségnek kitett sejtek által 500 uM imipraminnal, egy OCT{20} előkezeléssel vagy anélkül. } és MATE{21}}specifikus inhibitor. Az ASP plusz transzportot az imipramin 60,3%-kal ± 15,8%-kal gátolta nyírófeszültség mellett, míg statikus körülmények között 47,6%-kal ±19,7%-kal (3C. ábra).

A megfigyelés további megértése érdekében a nyírófeszültség hatását a humán OCT2 (transzfektált), a kutya OCT2 (endogén) és a kutya P-GP (endogén) expressziójára mértük olyan sejtekben, amelyek különböző szintű nyírásnak voltak kitéve 72 órán keresztül, a nyírás lassú felfutása 7 napon keresztül (4. ábra). A statikus körülmények között tenyésztett sejtekkel összehasonlítva a nyírásnak kitett MDCK-sejtek a transzfektált humán és endogén OCT2 fokozott expresszióját mutatták (legfeljebb 3{9}}-szeresére, illetve 20--szeresére), szignifikáns hatás nélkül. a transzfektált MATE1 vagy endogén P-GP expressziójára.

Cilia szerepe a nyírásra adott válaszban. A képalkotás azt mutatta, hogy a kétszeresen transzfektált MDCK sejtek csillókat expresszálnak statikus és áramlási körülmények között is (5. ábra, A és E). Ha a sejteket 24 órán keresztül 30 mM ammónium-szulfát hatásának tették ki, a csillók teljes elvesztését okozta (5. ábra, C és G). Fontos, hogy a deciliációnak nem volt durva hatása a sejt-membrán kapcsolatokra, ahogy azt az F-aktin leképezésével mértük, amely a hámsejtek sejt-membrán csatlakozásainál rögzíti a szorosan összekapcsolódó fehérjéket (5.D és HD ábra (Stevenson és Begg. 1994). Bár ezeken a képeken az F-aktin festődése némileg megvastagodott, ez nem volt konzisztens megállapítás, ezért nem határoztuk meg ezt a hatást. A deciliáció nem volt hatással a statikus körülmények között tenyésztett sejtek transzportjára. kiküszöbölte a nyírófeszültség hatását az ASP-re és a transzportra 0,5 dyn/cm² nyírásnak kitett sejtekben (6. ábra).

Vita

A vese központi szerepet játszik a gyógyszerek emberi szervezetből történő eltávolításában. Fontos, hogy pontosan utánozzuk a vese fiziológiájának összetettségét az in vitro gyógyszerteszteknél, különösen a folyadékáramlás tekintetében. A folyadékáramlás okozta nyírófeszültségről kimutatták, hogy in vitro befolyásolja a sejtmorfológiát és az iontranszportereket, de keveset tudunk a gyógyszertranszporterekre gyakorolt ​​hatásokról (Duan és mtsai, 2010; Ferrell és mtsai, 2012; Jansen és mtsai, 2016). . Ezenkívül a legtöbb korábbi tanulmány csak a rövid távú nyírás (1-6 óra) hatását mérte, ami nem valószínű, hogy teljesen elkülöníti a nyírási feszültség hatásait más celluláris stresszreakcióktól (Duan et al., 2010; Jang et al. 2013; Maggiorani et al.. 2015). Ezekben a vizsgálatokban a folyadékáramlásból származó tartós (7 napos) nyírófeszültség hatásaira összpontosítottunk a gyógyszerszállításra, hogy jobban utánozzuk a nyírófeszültséget, amelyetvese-cső alakúsejtek in vivo.

Annak megértése, hogy a gyógyszertranszporterek hogyan reagálnak a tartós nyírófeszültségre, javíthatja a vesék általi in vivo gyógyszerkezelés in vitro előrejelzéseit. A vese pontosan megtervezett in vitro modelljei szabványosíthatják a preklinikai vizsgálatokat és csökkenthetik a gyógyszerelégtelenség arányát.

Ebben a munkában egy párhuzamos lemezes mikrofluidikus bioreaktort használtunk a tartós nyírófeszültség hatásának meghatározására az OCT2 és MATE1 szerves kationtranszportjára.vese-csatornasejtvonal. Számos sejtvonalat vettek figyelembe ezekben a vizsgálatokban, beleértve a humán sejtvonalakat, például a Hopfer-csoportba tartozó humán proximális tubulussejteket (Orosz és mtsai, 2004) és az RPTEC-eket (CRL-4031: American Type Culture Collection, Manassas, VA) ( Wieser et al., 2008), de a kétszeresen transzfektált hOCT2/hMATE1 MDCK sejteket tartották a legmegfelelőbb választásnak ehhez a vizsgálathoz több okból is. Először is, az MDCK sejtek következetesen erős kötődést mutatnak a transzwell betétekhez, ami lehetővé teszi számukra, hogy ellenálljanak a folyadékáramlás kezdeti stresszének. Másodszor, ezek a sejtek szűk egyrétegű rétegeket képeznek, ami megakadályozza a szivárgást, és elengedhetetlen a marker szubsztrátok transzcelluláris transzportjának vizsgálatához. Végül a transzporterek exogén expressziója lehetővé teszi az aktív transzport és a perturbációk hatásának jobb kimutatását.

Az alulfolyó sejtek konfluens egyrétegű réteget alkottak, és a sejt perifériáján egy szoros kapcsolódású fehérjét lokalizáltak. Az inulin permeabilitással mérve magas gát funkciót is megtartottak. A hámsejtek azon képessége, hogy monoréteget képezzenek, amely megakadályozza a folyadék- és fehérjeszivárgást, rendkívül fontos a tubulus megfelelő működéséhez. Itt az MDCK-sejteken keresztüli szivárgás minimális volt, kevesebb, mint 1 ug/cm²/nap, és lényegesen alacsonyabb, mint az emberi sejteken keresztül. Korábban kimutattuk, hogy a humán vesesejtes egyrétegű inulinszivárgás 10-20 ug/cm²/nap (Brakeman et al., 2016), ami alátámasztja azt a következtetést, hogy a hOCT2/hMATE1 MDCK sejtek robusztus egyrétegű réteget alkottak.

Az ASP plus transzportja szignifikánsan megnövekedett azokban a hOCT2/hMATE1 MDCK sejtekben, amelyek 72 órán keresztül változó szintű nyírófeszültségnek voltak kitéve, összehasonlítva a statikus kontrollokkal. Az ASP plust az OCT2 (SLC22A2) veszi fel, és a MATE1 (SLC47A1) bocsátja ki, két szerves kationtranszporter, amelyek összehangoltan működnek, hogy megkönnyítsék avese-gyakran használt gyógyszerek, például metformin és ciszplatin szekréciója (Biermann és mtsai. 2006; Wittwer és mtsai. 2013). A nyírófeszültség hasonló hatásairól számoltak be a proximális tubulus iontranszporterek esetében. Az albuminfelvétel, az ionreabszorpció, valamint a megalin és tubulin expressziójának és funkciójának növekedéséről számoltak be a megnövekedett nyírófeszültség hatására (Overgaard et al. 2009; Duan et al. 2010: Ferrell et al. 2012: Raghavan et al., 2014). Kitettségevese-A proximális tubulussejtek nyírófeszültsége csökkent apoptózissal és az akut ciszplatin toxicitásból való gyorsabb felépüléssel, valamint a szerves aniontranszport fokozott gátlásával is összefügg (Jang et al.2013). Mivel a folyadékáramlásból származó nyírófeszültség folyamatosan jelen van a proximális tubulusban, ezek az eredmények együttesen támogatják a fiziológiásabb in vitro modellrendszerek használatát a vese gyógyszereloszlásának és toxicitásának előrejelzésére. Figyelemre méltó, hogy nincs szignifikáns különbség a transzporter funkcióban a nyírófeszültség 0.5 és 2.0 dyne/cm² között. Essig és Friedlander (2003) korábbi tanulmányai azt találták, hogy a minimális nyírási szint 0,17 dynes/cm2 szükséges ahhoz, hogy megváltozzon a sejtmorfológia, és más tanulmányok is mértek hatást fiziológia 1 dyne/cm²-ig (Duan et al., 2010). Ez az első olyan tanulmány, amely feltárja egy sor magasabb és tartós nyírófeszültség hatását a vese gyógyszertranszportereinek működésére, és lehetséges, hogy a 0,5 és 2,0 dyn/cm² nyírófeszültség közötti biológiai különbség nagysága, amelyet Az értékelt érték nem volt elég nagy ahhoz, hogy a vizsgálataink során lehetővé tegye a nyírófeszültség ezen szintjei közötti különbségek azonosítását. Bár további vizsgálatokra van szükség, eredményeink rávilágítanak a fiziológiailag releváns modellekhez szükséges feltételekre és a betegség következtében megnövekedett nyírófeszültség-szintek vese gyógyszerkezelésre gyakorolt ​​hatásaira.

Kísérleti módszereink egyik korlátja, hogy csak az apikális és a bazális oldalon pH 7,4-es táptalajt használva csak a transzporttal foglalkoztunk 7,4 pH-n, utánozva a korábban a hOCT2/hMATE1 MDCK sejtekre leírt kísérleti módszereket (Konig et al.. 2011). Az apikálistól a bazálisig terjedő pH-gradiens befolyásolhatja az OCT2 és MATE1 működését, és fiziológiás körülmények között jellemzően pH-gradiens van (Muller et al., 2013). Módszereink ezért korlátozták azon képességünket, hogy értékeljük az apikális és a bazális pH-gradiens és az OCT2 és MATE1 funkcióra gyakorolt ​​nyírófeszültség közötti kölcsönhatást. Mivel minden kísérleti körülmény között konzisztens 7,4-es pH-értéket alkalmaztunk, a pH-gradiens hiánya valószínűleg nem befolyásolta eredményeinket, de potenciálisan korlátozza az eredményeink alkalmazhatóságát az OCT2 és MATE1 transzportra, apikálistól alapig terjedő pH-gradiens jelenlétében.

Meglepő módon a transzfektált humán és endogén OCT2 mRNS expressziója megnőtt azokban a sejtekben, amelyek minden szintű nyírófeszültségnek voltak kitéve, összehasonlítva a statikus kontrollokkal. A transzporter expressziójának ez a felszabályozása specifikus volt, és nem volt mérhető hatása az endogén P-GP expresszióra vagy a transzfektált MATE1-re. A transzporter expresszió felszabályozása betekintést enged a megnövekedett transzport mögött meghúzódó mechanizmusba, és lehet a fokozott mRNS stabilitás vagy a fokozott mRNS transzkripció eredménye. Érdekes megjegyezni, hogy mind a transzfektált, mind az endogén transzporterek felszabályozottak voltak, ami váratlan, mivel a transzfektált OCT2 citomegalovírus promoter alatt expresszálódott, és nem szabad endogén génexpressziós szabályozó mechanizmusoknak alávetni. Bár meglepő, ez a megfigyelés nem példa nélküli. Hasonló hatásról számoltak be a perfúziónak kitett OAT1-transzfektált proximális tubulussejtekre, de a megnövekedett expresszió mechanizmusa továbbra sem tisztázott (Jansen et al., 2016). Egy másik tanulmányban az Nrf2 jelátvitelről azt találták, hogy szerepet játszik az endogén MATE2-K expressziójának növelésében nyírófeszültségre adott válaszként (Fukuda et al., 2017). Ennek további tanulmányozása indokolt, és a jövőbeni vizsgálatok tárgya lesz.

Azt is megállapítottuk, hogy az apikális nyíróáramlás bevezetése növelte a sejtek négyzetcentiméterére eső fehérjetartalmat. Ez a hatás ugyanolyan nagyságú volt mind a 0.5, mind a 2dynes/cm² nyírás esetén, hasonlóan az mRNS-expresszió és az ASP plusz transzport esetében tapasztalt hatáshoz. Van néhány bizonyíték arra, hogy a nyírófeszültség magasabbra indukálvese-hámsejtek, ami nagyobb sejttérfogatot eredményezne négyzetcentiméterenként, és így valószínűsíthető a fehérje per négyzetcentiméter növekedése; ez a korábban publikált jelenség azonban csak kisebb megfigyelés volt egy nagyobb adathalmazban, és nem volt számszerűsítve (Long et al., 2017). Az apikális nyíróáramlás jelenlétében növesztett sejtekben az összfehérje növekedése az egészségesek normál fehérjetartalmát képviselhetivese-cső alakúhámsejtek, amelyek csak úgy érhetők el, hogy a sejteket apikális nyíróáramlásnak teszik ki. Ezért a statikus tenyészetben növesztett sejtek alacsonyabb fehérjetartalma abnormális sejtállapotot jelenthet, ami klinikailag előfordulhat alacsony apikális szűrlet áramlási helyzetekben, például akut vesekárosodás esetén. Ez a jelenség további tanulmányozást érdemel.

A csillókról ismert, hogy mechanoszenzoros szerepet töltenek be a proximális tubulusban (Raghavan és Weisz, 2016). Ezért annak megállapítására, hogy játszanak-e kritikus szerepet az itt közölt megnövekedett OCT2 és MATE{2}}közvetített transzportban, megmértük a csillók eltávolításának a transzporter funkcióra gyakorolt ​​hatását. Vizsgálataink során az ASP nyírástól függő növekedésének és a transzportnak a csillószálak eltávolításával történő teljes blokkolása hasonló ahhoz a hatáshoz, amelyet Raghavan és mtsai. (2014), akik az endocitózis csillóktól függő felszabályozását mutatták ki a folyadékáramlás hatására. Az ammónium-szulfátnak valószínűleg más, nem jellemző hatásai is vannak a sejtek viselkedésére és működésére, amelyek közvetetten befolyásolhatják az oldott anyag transzportját. A lehetséges célon kívüli hatások ellenére ez a tizedelési módszer teszteli a ciliáris érzékelés szerepét a szerves oldott anyagok transzporter által közvetített mozgásában. A csillókban lévő mechano-szenzoros fehérjék és a transzporter közötti jelátvitel mechanizmusa jelenleg nem ismert. Az egyik hipotézis az, hogy a szerves kationtranszporterek funkcióját megváltoztatja az iontranszport megváltozása. Ismeretes, hogy a csillók eltávolítása megváltoztatja az oldott anyag mozgékonyságát a proximális tubulussejtekben, különösen a Nat/K plusz csökkentésével. Az ATPáz membrán lokalizációja és a paracelluláris transzport módosítása (Overgaard et al., 2009). Lehetséges, hogy ez változásokat eredményez a MATE1 függvényben, amely a H gradienstől függő antiporter. Egy másik hipotézis az, hogy a nyírófeszültség érzékelése befolyásolja a szerves kationtranszporterek expresszióját. A nyírófeszültség a Nrf2 jelátvitel révén modulálja a MATE{11}}K funkciót (Fukuda et al., 2017). Más szerves kationtranszporterek hasonlóan reagálhatnak a nyírófeszültségre, amely a mechanoszenzoros csillók eltávolításával megszűnne. Ennek nagy része ismeretlen, és további tanulmányozást igényel. Érdekes módon a csillók eltávolítása nem volt szignifikáns hatással az ASP plusz transzportra a 0,2 dyn/cm² nyírófeszültségnek kitett sejtek által, de robusztus hatást figyeltek meg, ha a nyírófeszültséget 0,5 dyn/cm2-re növelték. Ez arra utal, hogy a csillók érzékelik a nyírófeszültség küszöbértékét; viszont a csillók a transzporter expressziójában és funkciójában bekövetkező változásokat jelzik, mielőtt a transzportra gyakorolt ​​mérhető hatások várhatók. Összességében a szerves kationtranszport függése a nyírófeszültség ciliáris érzékelésétől betekintést nyújt az érintett mechanoszenzoros jelátviteli útvonalba és a minimális feszültségszintbe, amely szükséges lehet a nyírásra adott robusztus válasz kiváltásához.

Összefoglalva, ezek az adatok azt mutatják, hogy a folyadékáramlás okozta nyírófeszültség jelentős hatással van a szerves kationtranszporter funkcióra és expressziójára MDCK sejtekben. Ezenkívül a szerves kationtranszport felszabályozása a csillók jelenlététől függött. Azt javasoljuk, hogy az apikális nyírófeszültség minden in vitro modellezés fontos elemevese-cső alakúsejtekben, és valószínűleg fontos eleme a gyógyszerek renális szekréciós clearance-ének és nefrotoxicitásának modellezésének. Az a specifikus mechanizmus, amellyel a mechanikai stresszjelek növelik a transzporter aktivitását és expresszióját, még mindig nem világos, és további tanulmányozást igényel.

Hivatkozások

Astashkina A, Mann B és Grainger DW (2012): In vitro sejttenyésztési modellek kritikus értékelése nagy áteresztőképességű gyógyszerszűréshez és toxicitáshoz. Pharmacol Ther 134:82–106.

Biermann J, Lang D, Gorboulev V, Koepsell H, Sindic A, Schröter R, Zvirbliene A, Pavenstädt H, Schlatter E, and Ciarimboli G (2006) A humán szerves kationtranszporter szabályozási mechanizmusainak és állapotainak jellemzése 2. Am J Physiol Cell Physiol 290:C1521–C1531.

Brakeman P, Miao S, Cheng J, Lee CZ, Roy S, Fissell WH és Ferrell N (2016) Moduláris mikrofluidikus bioreaktor javított áteresztőképességgel a polarizált vese epiteliális sejtek értékeléséhez. Biomicrofluidics 10:064106.

Duan Y, Weinstein AM, Weinbaum S és Wang T (2010): Nyírási feszültség által kiváltott változások a membrán transzporter lokalizációjában és expressziójában egér proximális tubulussejtekben. Proc Natl Acad Sci USA 107:21860–21865.

Ernandez T, Udwan K, Chassot A, Martin PY és Feraille E (2018) Az Union nephrectomia és az apikális folyadék nyírófeszültsége csökkenti az ENaC abundanciáját a csatorna fősejtek összegyűjtésében. Am J Physiol Renal Physiol 314:F763–F772.

Essig M és Friedlander G (2003): Tubuláris nyírófeszültség és a vese proximális tubuláris sejtjeinek fenotípusa. J Am Soc Nephrol 14 (1. melléklet): S33–S35.

Ferrell N, Desai RR, Fleischman AJ, Roy S, Humes HD és Fissell WH (2010) Mikrofluidikus bioreaktor integrált transzepiteliális elektromos ellenállás (TEER) mérőelektródákkal a vese epiteliális sejtek értékeléséhez. Biotechnol Bioeng 107:707–716.

Ferrell N, Ricci KB, Groszek J, Marmerstein JT és Fissell WH (2012): Albumin kezelése vese tubuláris epiteliális sejtjei által mikrofluidikus bioreaktorban. Biotechnol Bioeng 109:797–803.

Ferrell N, Ricci KB, Desai RR, Groszek J, Marmerstein JT és Fissell WH (2012) Mikrofluidikus bioreaktor epiteliális sejtvizsgálatokhoz folyadék nyírófeszültség alatt. FASEB J 26:911.3.

Fukuda Y, Kaishima M, Ohnishi T, Tohyama K, Chisaki I, Nakayama Y, Ogasawara-Shimizu M és Kawamata Y (2017) A folyékony nyírófeszültség stimulálja a MATE2-K expressziót a Nrf2 útvonal aktiválásával. Biochem. Biophys. Res. Commun. 484:358–364.

Giacomini KM, Huang SM, Tweedie DJ, Benet LZ, Brouwer KLR, Chu X, Dahlin A, Evers R, Fischer V, Hillgren KM és társai; International Transporter Consortium (2010) Membrántranszporterek a gyógyszerfejlesztésben. Nat Rev Drug Discov 9: 215–236.

Jang KJ, Mehr AP, Hamilton GA, McPartlin LA, Chung S, Suh KY és Ingber DE (2013): Humán vese proximális tubulusa a chipen a gyógyszerszállításhoz és a nefrotoxicitás értékeléséhez. Integr Biol 5:1119–1129.

Jansen J, Fedecostante M, Wilmer MJ, Peters JG, Kreuser UM, van den Broek PH, Mensink RA, Boltje TJ, Stamatialis D, Wetzels JF és mások. (2016) A biomérnöki úton előállított vesetubulusok hatékonyan választják ki az urémiás toxinokat. Sci Rep 6:26715.

Kola I és Landis J (2004) Csökkentheti-e a gyógyszeripar a lemorzsolódás mértékét? Nat Rev Drug Discov 3:711–715.

König J, Zolk O, Singer K, Hoffmann C és Fromm MF (2011) Kettős transzfektált MDCK sejtek, amelyek humán OCT1/MATE1-et vagy OCT2/MATE1-et expresszálnak: a szerves kationok felvételének és transzcelluláris transzlokációjának meghatározó tényezői. Br J. Pharmacol. 163:546–555.

Long KR, Shipman KE, Rbaibi Y, Menshikova EV, Ritov VB, Eshbach ML, Jiang Y, Jackson EK, Baty CJ és Weisz OA (2017) A proximális tubulus apikális endocitózisát folyadék nyírófeszültség modulálja egy mTOR-függő útvonalon keresztül. Mol Biol Cell 28:2508–2517.

Maggiorani D, Dissard R, Belloy M, Saulnier-Blache JS, Casemayou A, Ducasse L, Grès S, Bellière J, Caubet C, Bascands JL és mások. (2015) Az emberi vese tubuláris sejtjeinek nyírási stressz által kiváltott hámszervezetének megváltozása. PLoS One 10:e0131416.

Morrissey KM, Stocker SL, Wittwer MB, Xu L és Giacomini KM (2013): Vesetranszporterek a gyógyszerfejlesztésben. Annu Rev Pharmacol Toxicol 53:503–529.

Müller F, König J, Hoier E, Mandery K és Fromm MF (2013) Az OCT2 szerves kationtranszporter és a MATE1 és MATE{3}}K multidrug and toxinextrudion proteins szerepe az antivirális lamivudin transzport- és gyógyszerkölcsönhatásaiban. Biochem Pharmacol 86:808–815.

Orosz DE, Woost PG, Kolb RJ, Finesilver MB, Jin W, Frisa PS, Choo CK, Yau CF, Chan KW, Resnick MI stb. (2004) Normál felnőtt emberi proximális tubulussejtek növekedése, halhatatlanná válása és differenciálódási potenciálja. In Vitro Cell Dev Biol Anim 40:22–34.

Overgaard CE, Sanzone KM, Spiczka KS, Sheff DR, Sandra A és Yeaman C (2009) A deciliáció a hámsejt-csatlakozások és a felszíni domének drámai átalakulásával jár. Mol Biol Cell 20:102–113.

Peters IR, Peeters D, Helps CR és Day MJ (2007) Több belső referencia (házvezetőnő) génvizsgálat kidolgozása és alkalmazása a kutya génexpressziós vizsgálatok pontos normalizálására. Vet Immunol Immunopathol 117:55–66.

Pfaller W és Gstraunthaler G (1998): Nefrotoxicitás vizsgálata in vitro{1}}amit tudunk és amit tudnunk kell. Environ Health Perspect 106 (2. melléklet): 559–569.

Raghavan V, Rbaibi Y, Pastor-Soler NM, Carattino MD és Weisz OA (2014) Az apikális endocitózis nyírófeszültség-függő szabályozása primer csillók által közvetített vese proximális tubulussejtekben. Proc Natl Acad Sci USA 111:8506-8511.

Raghavan V és Weisz OA (2016) A mechanoszenzoros szerep felismerése a proximális tubulusok működésének szabályozásában. Am J Physiol Renal Physiol 310:F1–F5.

Schmittgen TD és Livak KJ (2008) Valós idejű PCR adatok elemzése összehasonlító C(T) módszerrel. Nat Protoc 3:1101–1108.

Sohtell M, Karlmark B és Ulfendahl H (1983) FITC-inulin mint vesetubulus marker patkányban. Acta Physiol Scand 119:313–316.

Stevenson BR és Begg DA (1994): A citokalazin D koncentrációtól függő hatásai a szoros kapcsolódási pontokra és az aktin filamentumokra MDCK epiteliális sejtekben. J Cell Sci 107, 367-375.

Venzac B, Madoun R, Benarab T, Monnier S, Cayrac F, Myram S, Leconte L, Amblard F, Viovy JL, Descroix S és mások. (2018) Változott átmérőjű kis csövek tervezése a vesesejtek szerveződésének tanulmányozására. Biomicrofluidics 12: 024114.

Watkins PB (2011): Kábítószerbiztonsági tudományok és a gyógyszerfejlesztés szűk keresztmetszete. Clin Pharmacol Ther 89:788–790.

Wieser M, Stadler G, Jennings P, Streubel B, Pfaller W, Ambros P, Riedl C, Katinger H, Grillari J és Grillari-Voglauer R (2008) A hTERT önmagában örökíti meg a vese proximális tubulusainak hámsejtjeit anélkül, hogy megváltoztatná funkcionális jellemzőit. Am J Physiol Renal Physiol 295:F1365–F1375.

Wittwer MB, Zur AA, Khuri N, Kido Y, Kosaka A, Zhang X, Morrissey KM, Sali A, Huang Y és Giacomini KM (2013) Hatékony, szelektív multidrug és toxinextrudion transzporter 1 (MATE1, SLC47A1) inhibitorok felfedezése vényköteles gyógyszerek profilalkotása és számítógépes modellezése révén. J Med Chem 56:781-795.