Aptamer alkalmazások az idegtudományban 1. rész
May 27, 2024
Absztrakt:
Mivel a fogyatékosság fő oka, a neurológiai betegségek nagy figyelmet kaptak a globális egészségügyi közösségtől.
Az idegrendszer az emberi test fontos része. Felelős az emberi észlelésért, gondolkodásért, mozgásért, pszichológiáért és érzelmekért. Néhány embernek azonban neurológiai problémái lehetnek, amelyek befolyásolják a memóriájukat. Az idegrendszeri betegségek a központi idegrendszer és a perifériás idegrendszer kóros elváltozásaira utalnak, mint pl. a stroke, a Parkinson-kór, az Alzheimer-kór stb. Ezek a betegségek befolyásolják a memóriát, de aktív módszerekkel mindannyian legyőzhetjük őket. Javítsd.
Az első a stroke. A statisztikák szerint évente több millió embert érint a stroke, és az egyik leggyakoribb tünet a memóriavesztés. A szélütés nagyon káros a szervezetre, mert az agy oxigén- és vérellátását biztosító részeit érinti. A stroke-ot azonban megelőzhetjük mozgással és étkezési szokásaink megváltoztatásával. Például a megfelelő testmozgás, a normál testsúly fenntartása és az egészséges táplálkozás hatékonyan csökkentheti a stroke kockázatát, és ezáltal jobb memóriát tarthat fenn.
A következő a Parkinson-kór. Ez egy mozgászavaros betegség, amelyet az idegsejtek halála okoz. A mozgás mellett a Parkinson-kór a memóriát is befolyásolhatja. A vizsgálatok azt mutatják, hogy a legtöbb betegnél kognitív zavarok lépnek fel, beleértve a memóriavesztést is. A betegek azonban különféle intézkedéseket tehetnek a betegség progressziójának késleltetésére, például rendszeres szakmai kezelésben és rehabilitációs képzésben részesülhetnek. Az olyan hobbik, mint a zenehallgatás, az olvasás és az új készségek elsajátítása, szintén hasznosak lehetnek az agy ellazításában és a memória helyreállításában.
Végül ott van az Alzheimer-kór. Ez egy kognitív károsodást okozó betegség, melynek egyik legnyilvánvalóbb és leggyakoribb tünete a memóriavesztés. Azonban az Alzheimer-kór is olyan betegség, amely remittálható. A kutatások azt mutatják, hogy a testmozgás, az egészséges táplálkozás, az új készségek elsajátítása és az önkéntesség lassíthatja a betegség progresszióját és javíthatja a memóriát.
Mindig meg kell őriznünk a pozitív hozzáállást, és aktív módszereket kell alkalmaznunk a neurológiai betegségek megelőzésére és kezelésére, hogy javítsuk a memóriánkat. Még ha érintettek is vagyunk, különféle intézkedéseket tehetünk, hogy javítsuk ellenállóképességünket és a betegséggel szembeni leküzdési képességünket. Amíg kitartunk, jobb, egészségesebb utat találunk a memóriavesztés megelőzésére és kezelésére. Látható, hogy javítanunk kell a memórián, a Cistanche deserticola pedig jelentősen javíthatja a memóriát, mert a Cistanche deserticola egy hagyományos kínai gyógyászati anyag, amelynek számos egyedi hatása van, amelyek közül az egyik a memória javítása. A Cistanche deserticola hatékonysága a benne található számos hatóanyagnak köszönhető, beleértve a csersavat, poliszacharidokat, flavonoid glikozidokat stb. Ezek az összetevők számos úton elősegíthetik az agy egészségét.
Kattintson a Tudás gombra a rövid távú memória javításához
Több mint egymilliárd ember szenved a következő neurológiai betegségek valamelyikében: demencia, epilepszia, szélütés, migrén, agyhártyagyulladás, Alzheimer-kór, Parkinson-kór, szklerózis multiplex, amiotrófiás laterális szklerózis, Huntington-kór, prionkór vagy agydaganatok. A diagnózis és a kezelés lehetőségei sok ilyen betegség esetében korlátozottak.
Az aptamerek, mivel kisméretű és nem immunogén nukleinsavmolekulák, amelyek könnyen kémiailag módosíthatók, potenciális diagnosztikai és terápiás alkalmazásokat kínálnak ezen igények kielégítésére.
Ez az áttekintés úttörő tanulmányokat ölel fel az aptamerek alkalmazásával kapcsolatban, amelyek ígéretet mutatnak az olyan neurológiai rendellenességek jövőbeli diagnosztikájában és kezelésében, amelyek világszerte egyre súlyosabb egészségügyi kihívásokat jelentenek.
Kulcsszavak: aptamer; idegtudomány; neurológiai betegségek; neurológiai rendellenességek; neurotoxinok; Rák.
1. Bevezetés
Az aptamerek egyszálú DNS-, RNS- vagy szintetikus XNS-molekulák, amelyek egyedi háromdimenziós (3D) struktúrákká képesek összehajtogatni, amelyek révén nagy specificitással és affinitással megkötik a célmolekuláikat [1,2].
Az aptamerek kiválasztását 1990-ben három különálló csoport dolgozta ki [3–5]. A módszert ma a ligandumok szisztematikus evolúciója exponenciális dúsítással (SELEX) néven ismerik. Azóta sok aptamert választottak ki az alaptudományok területén történő felhasználásra, és egyre több aptamer van még fejletlen a terápiában, diagnosztikában és képalkotásban [6–10].
A SELEX módszer a darwini evolúciót szimulálja in vitro. Ez több kiválasztási kört foglal magában, és minden kör után a "legrátermettebb" oligonukleotidok (oligok) exponenciális amplifikációját hajtják végre.
A hagyományos SELEX egy köre három lépésből áll, sorrendben (1) a kívánt célmolekula inkubálása egy olyan oligókészlettel, amelynek központi 20–60 nukleotidos, randomizált szekvenciájú régiója van körülvéve állandó szekvencia terminális régióival, amelyek későbbi polimeráz láncreakciók (PCR-ek) templátai lesznek. ), (2) befogják a csoportban lévő oligókat, amelyek sikeresen kötik a célpontot, és (3) amplifikálják a befogott oligokat PCR-rel vagy reverz transzkripciós PCR-rel (rt-PCR), az oligo, DNS vagy RNS típusától függően.
A kontraszelekciós körök is ide tartoznak, amelyek során a nukleinsavkészletet egy üres hordozó mátrixon vezetik át, a kívánt célpont nélkül, vagy a hordozó mátrixon egy vagy több más molekulával, amelyek szerkezetileg rokonok lehetnek a célmolekulával.
A kontraszelekció során azokat az oligókat, amelyek nem kötik meg a hordozó mátrixot vagy a szerkezetileg rokon molekulákat, befogják, és a SELEX több körén keresztül folytatják.
Az ellenszelekciót számos célból hajtják végre, például olyan oligók eltávolítására, amelyek kölcsönhatásba lépnek (1) a hordozó mátrixszal, (2) a célponttal szerkezetileg rokon analógokkal vagy molekulákkal, vagy (3) a biológiai mátrixban nagy koncentrációban jelen lévő molekulákkal (például szérummal). vagy szövetkivonat), amelyben a kiválasztott aptamer fog működni.
A kontraszelekció fő célja az aptamer specifitás növelése a kívánt célpontra a többi potenciális molekuláris versenytárshoz képest. A hagyományos SELEX mellett egyre népszerűbb a nemrégiben kifejlesztett szerkezetváltó SELEX [11–13].
Ebben a megközelítésben az oligoknak meg kell változtatniuk szerkezetüket, amikor kölcsönhatásba lépnek a célponttal, és disszociálnak egy komplementer befogási szekvenciától. Ez biztosítja, hogy a kiválasztott aptamerek szerkezete megváltozzon ligandumkötéskor. Más alternatív SELEX-módszereket is kifejlesztettek, beleértve a CE-SELEX-et, a Cell-SELEX-et és az in vivo SELEX-et, az 1. táblázatban foglaltak szerint.
Nagyon lehetséges a különböző SELEX eljárások kombinálása még összetettebb technikák kifejlesztésére. Miután a SELEX kiválasztotta az aptamereket, azokat tovább módosítják, hogy javítsák specifitásukat és affinitásukat számos megközelítéssel, amelyeket összességében érlelésnek nevezhetünk.
Az aptamerek kiválasztásánál és érlelésében számos szempontot figyelembe kell venni. Először is, az aptamerek szerkezetét és az aptamer-cél kölcsönhatásokat befolyásolja a hőmérséklet és a pufferkomponensek, beleértve az ionokat, az ionerősséget és a pH-t.
Így a SELEX tervezésének egyik legfontosabb pontja a környezet (biológiai mátrix vagy só/puffer összetétel) utánzása a szelekció során, amelyben megtalálható az aptamer molekuláris célpontja, és létrejön az aptamer és a cél közötti kölcsönhatás.
A megfelelő pufferkészítmények és inkubációs hőmérsékletek kiválasztása biztosítja a kiválasztott aptamerek optimális teljesítményét az alkalmazási körülmények között [4,30–32].
Másodszor, az aptamer stabilitását javítani kell, mivel a DNS- és RNS-aptamerek potenciális célpontjai a nukleáztámadásoknak. Ez különösen igaz az RNS-re, a 20OH csoport miatt, amelyet a ribonukleázok használnak a nukleinsavváz foszfátjának elektrofil támadásában a hidrolízishez.
Így az RNS labilisabb a magas hőmérsékletre és pH-ra, mint a DNS. Az aptamerek utólagos szelekciós kémiai módosításokkal érlelhetők, hogy ezt az érzékenységet leküzdjék. Az ilyen módosítások azonban azt eredményezhetik, hogy az aptamer elveszti specifitását és/vagy affinitását.
Ezért általában jobb, ha módosított nukleotidokat alkalmazunk a SELEX során. Számos lehetséges aptamer módosítást sorol fel a 2. táblázat.
Kiválaszthatók olyan aptamerek, amelyek szelektíven megkötik a legtöbb vírust, sejtet, baktériumot, fehérjét, toxint és nagy affinitással rendelkező peptidet [45–48]. Többször használhatók a tevékenység észrevehető megzavarása nélkül. Más szóval, további felhasználás céljából elválaszthatók a célpontjuktól.
Ezzel szemben az antitestek csak néhány alkalommal használhatók fel, mielőtt elveszítenék funkciójukat. A nukleinsav-aptamerek is érlelhetők stabilabbá, mint az antitestek és enzimek, különösen magasabb hőmérsékleten [2].
Ezen túlmenően, ha egy aptamernek ez a szekvenciája ismert, kémiai szintézise és homogenitásig történő tisztítása nagyon reprodukálható és olcsó. Ezek a tulajdonságok lehetővé teszik az aptamerek számára, hogy antitesteket helyettesítsenek az érzékelő egységek komponenseiként [49].
Az aptamerek struktúráinak rugalmassága és az a képességük, hogy egy aptamer szekvencia régióit komplementerioligókkal „lefedjék” olyan jelátviteli lehetőségeket biztosítanak, amelyek lehetővé teszik aptamerek beépülését számos szenzorplatformba, amelyek nem könnyen adaptálhatók az antitestekhez. Ezek a tulajdonságok motiválják az aptamer alapú bioszenzorok fejlesztését [50–52].
Az új diagnosztikai eszközök kifejlesztése a bioszenzoros terület egyik legkiemelkedőbb területe, sok kutató könnyű, hatékony és olcsóbb módszerek kidolgozására törekszik a korai diagnózis és a precíziós orvoslás elérése érdekében.
Az aptamerek bioszenzorokba (az úgynevezett "aptaszenzorok") való bevonása az 1990-es években gyökerezik.
Az aptamerek mint biofelismerő elemek korai példája egy optikai bioszenzor, amely fluoreszcensen jelölt aptamereket használt humán neutrofil elasztáz ellen egy homogén vizsgálatban [53].
Azóta sokféle aptaszenzor-kialakításról számoltak be, legtöbbjük szilárd hordozón lévő aptamerekkel, valamint elektrokémiai, optikai, mechanikai és akusztikus jelekkel [45,54–56]. Néhány példát a cikk későbbi részében tárgyalunk.
Az aptamereket a terápiában is alkalmazták. Azok a módosítások, amelyek megnövekedett felezési időt és jobb farmakokinetikát eredményeznek, néhány aptamer jó lehetőséget kínál a klinikai alkalmazásra. Az antitestekhez képest az aptamerek sokkal kevésbé immunogének, és hatásukat reverz komplementer oligonukleotidok gátolhatják (Munzar et al., 2019).
Ezek a fontos jellemzők az aptamereket javasolják terápiás szerekként történő fejlesztésre. A Macugen (pegaptanib-nátrium), amely szelektíven ismeri fel a vaszkuláris endoteliális növekedési faktort (VEGF), volt az első aptamer, amelyet terápiás szerként hagytak jóvá (Tobin, 2006).
Azóta számos aptamer eljutott a klinikai vizsgálatok különböző szakaszaiba, amelyek során olyan egészségügyi állapotok kezelésére tesztelik őket, mint a kissejtes tüdőrák, a von Willebrandfaktorral összefüggő rendellenesség, angiomák és vesesejtes karcinómák [51,57–60].
Az aptamerek másik lehetséges terápiás alkalmazása a bejuttató rendszerek [61,62]. Ahhoz, hogy ezekben a rendszerekben hatékony eredményeket érjenek el, az aptamereknek fel kell ismerniük a sejtfelszíni fehérjéket natív formájukban.
A Cell-SELEX-et olyan sejtfelszíni fehérjék elleni szelekcióra fejlesztették ki, amelyek natív formájukban gyakran nehezen tisztíthatók [63]. Egy aptamer, amely felismeri a sejtfelszíni fehérjét, képes együttműködni a receptorral, hogy internalizálja az aptamerhez kapcsolódó rakományt. Ezzel a módszerrel kiválasztható az aptamer olyan receptorokhoz, amelyek elsősorban egyetlen sejttípuson expresszálódnak, és amelyek in vivo célba vehetők [57].
Például anti-PSMA (prosztata-specifikus membránantigén) aptamereket fejlesztettek ki siRNS-ek eljuttatására egerekben vagy tenyésztett sejtekben [62,64–66].
Az idegtudományban az aptamerek felhasználása ez idáig korlátozott volt, jóllehet nagyon széles körben alkalmazhatók. Az aptamerekről beszámoltak a központi idegrendszer (CNS) szerkezetének és működésének elvesztését eredményező neurodegeneratív betegségek lehetséges kezelési lehetőségeiről, beleértve az Alzheimer-kórt (AD), a Parkinson-kórt (PD), a Creutzfeldt–Jakob-kórt, a motoros neuronbetegségeket és a Huntington-kórt. betegség(HD) (1. ábra). Jelenleg a világon körülbelül 50 millió ember küzd demenciával, amelynek globális egészségügyi költségei megközelítik az évi ezermilliárd dollárt.
Emiatt a demenciák társadalmunk egyik legnagyobb egészségügyi és gazdasági problémája [67]. Emellett az Egyesült Nemzetek Szervezete és az Egészségügyi Világszervezet szerint a világ 65 év feletti népessége 2050-re megduplázódik.
Ezért az életkorfüggő neurodegeneratív betegségek egyre nagyobb ráfordításokat tesznek szükségessé a diagnózis és a kezelés terén [67].
A korai diagnosztizálást és az új terápiás alkalmazásokat elősegítő módszerek iránti e kritikus igényeket az aptamerek kielégíthetik, amelyek megoldást jelenthetnek néhány mögöttes szövődményre is [68,69].
Aptamereket fejlesztenek az agyi képalkotó technológiákban (MRI, PET stb.), a neurotranszmitterek vizualizálásában, diagnosztizálásában, valamint az agydaganatok és más agyvel kapcsolatos betegségek terápiájában. Sok ilyen megközelítésben az aptamereket radioaktív nyomjelzőkkel, például fluornal-18 jelölték a PET-képalkotáshoz [70]. Ebben az áttekintésben megvitatjuk az aptamerek agyi képalkotásban és idegrendszeri betegségekben való alkalmazásának eredményeit és kihívásait.
2. Molekuláris kimutatás
2.1. Neurotoxin kimutatás
A neurotoxinok a farmakológiailag aktív vegyületek kémiailag változatos csoportját alkotják. Világos biológiai hatást fejtenek ki az élőlények idegrendszerére, de kémiai szerkezetükben és hatásmechanizmusukban különböznek.
Megváltoztatják az akciós potenciálokat, és zavarják az idegimpulzusok átvitelét. Az emberi egészségre és környezetre gyakorolt kockázatuk megfelelő felméréséhez elengedhetetlen kellően érzékeny technikák alkalmazása a pontos azonosításukhoz.
Nukleinsav-aptamereket alkalmaztak e toxinok vízben és biológiai mintákban való jelenlétének nagy érzékenységgel és szelektivitással történő validálására [71]. Olyan tanulmányokról számoltak be, amelyek bizonyítják a botulinum neurotoxinok (Botulinum A, E), a saxitoxin, a brevotoxin, a paraquat és a tetrodotoxin aptaszenzorok általi pontos azonosítását.
A botulinum neurotoxinok (BoNT-k) a leghalálosabb neurotoxinok közé tartoznak, és potenciálisan alkalmazhatók bioterror szerként. A BoNT-k szenzitív, hatékony és valós idejű detektáló rendszerére vonatkozó alapvető igény kielégítésére szol-gél alapú SELEX-et használtak az E típusú botulinum neurotoxin (BoNT-E) elleni DNS-aptamerek izolálására [47].
Az aptamer-jelölt szekvenciákat az ötödik kör után következő generációs szekvenálás (NGS) segítségével elemeztük, és jellemeztük a nagyfrekvenciás aptamereket. Ezekben az aptamer családokban az aptamerBT5.6 nagy, 53 nM Kd affinitást mutatott a BoNT-E iránt, és grafénoxid platformon rögzítették. Ez az érzékelő 0,83 nM észlelési határt (LoD) mutatott ki a BoNT-E esetében.
A brevotoxinok (BTX-k) és a saxitoxinok olyan tengeri neurotoxinok, amelyek neurológiai kagylómérgezést (NSP) okoznak. A BTX-eket nagy toxicitás és az NSP gyors megjelenése jellemzi. Az elemzésükkel kapcsolatos technikai nehézségek arra ösztönözték a kutatókat, hogy alternatív, hatékony és olcsó kimutatási módszereket keressenek ezekre az erős neurotoxinokra.
Ebből a célból egy elektrokémiai aptaszenzort fejlesztettek ki a BTX-2 kimutatására, amelyhez ezeket a kiválasztott DNS-aptamereket elektrokémiai impedanciaspektroszkópiával (EIS) és fluoreszcenciával jellemezték.
A BT10 aptamer, amelynek affinitása 42 nM a BTX-2 iránt, egy címkementes kompetitív impedimetriás bioszenzorba került, amely 95 pM BTX-2 kimutatási határt mutatott.
Ez az aptaszenzor képes volt kimutatni a BTX{0}}-t egy tüskés kagylóextraktumban, megbízható választ adva kagylómátrix jelenlétében [72]. A tengeri neurotoxinok második osztályaként a szaxitoxint közegészségügyi jelentőséggel jellemezték.
A jelenleg alkalmazott rendszerek technikai és etikai kérdései miatt megfelelő alternatívaként újszerű tanulmányokat kellett kidolgozni. Ennek az igénynek a kielégítésére egy címkementes optikai bioréteg interferometriás kompetitív aptaszenzort fejlesztettek ki. A bioszenzor kimutatási határa 1,66 nM a szaxitoxinra vonatkozóan, magas fokú szelektivitással és érzékenységgel, jó stabilitással és gyors kimutatási képességgel [73].
A tengeri toxinokhoz hasonlóan a kígyómaráskor felszabaduló neurotoxinok a legerősebb és leghalálosabb toxinok közé tartoznak. Sajnos a véralvadási vizsgálatokon és a klinikai tüneteken alapuló hagyományos kígyómarás-diagnosztika nem ad pontos diagnózist. Ezenkívül az antitestek teljesítményének tételfüggő variációi megnehezítik a diagnosztikában való alkalmazásukat.
A -Tox-FL aptamer nagy affinitású csonka változata, amelyet eredetileg a Bungarus multicinctus (-Tox-T2) bungarotoxinja ellen szelektáltak, nagyobb affinitással (Kd=2,8 nM), mint a szülő -Tox-FL (18) nM) enzimhez kötött aptamer vizsgálati formátumban alkalmaztuk.
Ebben az összeállításban a -Tox-T2 aptamer már 2 ng nyers méregben is képes volt kimutatni a -toxint, ami megmutatta a Bungarus caeruleus méreg kimutatásának lehetőségét [74].
2.2. Neurotranszmitterek észlelése
Az agy funkcionális összetettségének feltárására a neurotranszmitteraktivitások és a jelátviteli útvonalak monitorozása használható. A neurotranszmitterek elengedhetetlenek a sejtek közötti információátvitelhez, és kulcsszerepet játszanak az olyan neurológiai rendellenességekben, mint az epilepszia, a Parkinson-kór (PD) és az Alzheimer-kór (AD).
Számos tanulmányban dopaminra, epinefrinre vagy szerotoninra specifikus aptamereket alkalmaztak aptamer alapú bioszenzorok kifejlesztésére neurotranszmitterek kimutatására in vivo és in vitro [75].
A katekolamin neurotranszmitter, a dopamin (DA) szabályozza az emberi anyagcserét, valamint a szív- és érrendszeri, valamint a veserendszer funkcióit. Számos neurodegeneratív betegség, különösen a PD, közvetlen összefüggést mutatott a DA kóros metabolizmusával [76].
Ezért a rendkívül érzékeny és szelektív bioszenzorok fejlesztése a DA meghatározásához fontos inbiológiai rendszerek. A DA elleni első RNS-aptamer, a dopa2, Kd=2,8 nM [77] affinitással kötötte meg a DA-t.
Ezzel az aptamerrel egy grafén-polianilin kompozit filmen alapuló, címkementes elektrokémiai aptaszenzor sikeresen detektálta a DA embertelen szérum jelenlétét 1,98 pM LoD-vel [78]. Egy újabb tanulmányban egy másik DA aptaszenzort fejlesztettek ki, amely egy DNS-aptamerből állt érzékelőként és egy amurbőr kollagén-grafén-oxid (GCSC-GO) kompozitból mint átalakítóból.
A kompozitot ultraszonikációval állítottuk elő, és infravörös (IR) és Raman spektroszkópiával, atomi erőmikroszkópiával és EIS-sel jellemeztük. Ez a rendszer magában foglalta az aptamer immobilizálását a kollagénhez, majd a differenciális pulzus voltammetriát.
Bár az aptaszenzor magasabb, 0,75 nM-os LoD-t mutatott, szemben a korábbi, 2 pM-os érzékelővel, nagy szelektivitást mutatott a DA túlzottan rokon vegyületekre, és pontosan mérte a DA-t 10% szérum jelenlétében [79].
Különböző szabad jelölésű, nagy érzékenységű és szelektivitású molekulák elemzésére a közelmúltban egy aptamerekkel ellátott mikrokonzolos sorérzékelőt jelentettek be. Az érzékelő 12 mikrokonzolból áll, amelyeket tiolált DA-aptamerekkel módosítottak, és aranynanorészecskéket (AuNP) használ, amelyek olyan DNS-szakasszal vannak konjugálva, amely komplementer a DAaptamerrel a mikrokonzol felületén.
A kezdetben a DA aptamerrel hibridizált AuNP-DNS konjugátumok akkor szabadulnak fel, amikor az aptamer megköti a DA-t, ami körülbelül 15-szörösére növeli a tömb felületi feszültségét és növeli az elhajlást.
A rendszer lineáris válaszreakciója a 0,5-4 µM DA tartományban van, 77 nM LoD-vel. Specifikusságát 12 szerkezeti és funkcionális analóggal igazolták, köztük az L-DOPA-val, amelyek egyike sem váltott ki elhajlást [80].
For more information:1950477648nn@gmail.com
