Aptamer alkalmazások az idegtudományban 2. rész

Egy másik neurotranszmitter, a szerotonin szerepet játszik az alvást, az agressziót, az étvágyat és a szexuális aktivitást befolyásoló neuromodulációs tevékenységekben. Különböző testrészekben termelődik, például az agyban, a gerincvelőben, a vérlemezkékben és a belekben [81–84].

A szerotonin egy neurotranszmitter, amely fontos szerepet játszik az emberi testi és lelki egészségben. Az emberi szervezetben a szerotonin szabályozza a hangulatot, szabályozza az étvágyat és az alvást, valamint elősegíti a fizikai élvezet és a jólét érzését. A szerotonin azonban fontos szerepet játszik a memória befolyásolásában is.

Kutatások kimutatták, hogy a szerotonin elősegítheti a memória javítását azáltal, hogy szabályozza a neuronok közötti jelátvitelt. Ha az embereket pozitívan stimulálják, a szervezet szerotonint szabadít fel, ami segít megerősíteni a neuronok közötti kapcsolatokat és javítja a memória hatékonyságát. A szerotonin kreatívabbá teheti az embereket, javítja a mentális mozgékonyságot, és elősegítheti az emberek gyorsabb tanulását és gondolkodását.

Ezenkívül a szerotonin segíthet csökkenteni a szorongás és a depresszió tüneteit, a hangulati problémákat, amelyek negatívan befolyásolhatják az emberek koncentrációját és memóriáját. A vidám hangulat és mentális állapot gyakran elősegítheti az emberek felismerését és új tanulási képességét.

Összefoglalva, a szerotonin nélkülözhetetlen szerepet játszik testi és lelki egészségünk tanulásában és memóriájában. Növelhetjük a szerotonin felszabadulását és [javíthatjuk a memóriát] étkezési szokásaink, mozgásmennyiségünk, tanulási módszereink, stb. változtatásával, pozitív és egészséges mentalitás ápolásával, és állandó kihívásokkal, hogy folyamatosan segítsük elő a memória fejlesztését. Látható, hogy javítanunk kell a memórián, a Cistanche deserticola pedig jelentősen javíthatja a memóriát, mivel a Cistanche deserticola antioxidáns, gyulladáscsökkentő és öregedésgátló hatással bír, ami segíthet csökkenteni az oxidációt és a gyulladásos reakciókat az agyban, ezáltal védi a az idegrendszer egészsége. Ezenkívül a Cistanche deserticola az idegsejtek növekedését és helyreállítását is elősegítheti, ezáltal javítva a neurális hálózatok összekapcsolhatóságát és működését. Ezek a hatások segíthetnek javítani a memóriát, a tanulást és a gondolkodási sebességet, valamint megakadályozhatják a kognitív diszfunkciók és a neurodegeneratív betegségek kialakulását.

Kattintson a Tudnivaló kiegészítőkre a memória javításához

A perifériás szerotoninszint egyensúlyhiánya számos betegséghez kapcsolódik, beleértve a magas vérnyomást, a vesebetegséget és a depressziót. Így a szerotonin felhasználása a betegség állapotának előrejelzésére és a megfelelő kezelés megkezdésére klinikai jelentőséggel bír.

A szerotonin plazmonikus vizsgálatát aptamer-AuNP konjugátummal fejlesztették ki, amelynek aggregációja megváltozik a szerotonin jelenlétében. A részecskeaggregáció változása az abszorpció csúcs hullámhosszának eltolódásaként mérhető.

A vizsgálat specifikus választ mutatott a szerotoninra, és nem adott statisztikailag szignifikáns jelet a metabolitjaival, a 5-hidroxi-indol-ecetsavval (5-HIAA), az adrenalinnal vagy a noradrenalinnal, amikor mindegyiket 1 µM-on tesztelték.

A magzati szarvasmarha-szérum, mint a humán szérum utánzója, szintén nem indított jelet [85]. A közelmúltban beültethető aptamer-field-effect tranzisztor (FET) neuroszondákat fejlesztettek ki az agyszövet szerotoninszintjének monitorozására. A nanoméretű FET-ek ultravékony In2O3 felületeit aptamerekkel módosították, és ezek a neuropróbák lehetővé tették az fM szerotonin kimutatási határokat in vivo minimális bioszennyeződés mellett [86].

További neuroszondákkal lehetővé válik az idegi aktivitás spatiotemporális rögzítése, így az agyműködések sokkal mélyebb szinten érthetők meg. Az epinefrin egy katekolamin neurotranszmitter, amely számos fiziológiai funkcióval rendelkezik, amelyek abnormális szintje egészségügyi problémákat, például aritmiát, szívinfarktust, vérzést okozhat. nyomásemelkedés és tüdőödéma.

Fontos a keringő epinefrin mennyiségi meghatározása, hogy megfigyeljük ezeket a kapcsolódó betegségeket. Ennek érdekében kolorimetriás detektálási módszert dolgoztak ki, amely az epinefrin és az aptamer funkcionalizált Au-NP kölcsönhatásán alapul. A rendszer olcsóbb és specifikusabb, mint az adrenalin mennyiségi meghatározására szolgáló egyéb technikák, például folyadékkromatográfia és spektrofotometria.

Ezenkívül UV-látható spektroszkópiával 0,9 nM-os kimutatási határt határoztak meg, amely a legalacsonyabb kimutatási határ az epinefrinre bármely kolorimetriás módszerrel. Az epinefrin, a 3,4-dihidroxi-fenil-ecetsav (DOPAC), a triptofán, az aszkorbinsav, a dopamin, a tirozin és a homovanillinsav analógjai nagyon csekély választ mutattak, vagy egyáltalán nem mutattak választ, ami az aptaszenzor magas specificitására utal [87].

Egyetlen neurotranszmitter szintjének változása számos betegség bármelyikét jelezheti, ami miatt nagyon valószínűtlen, hogy egyetlen neurotranszmitter mérése alapján betegségdiagnózist lehet felállítani. Ezért a legtöbb aptaszenzor multiplex platformba integrálható képessége olyan diagnosztikai eszközöket eredményez, amelyek jobban megfelelnek a klinikáknak, és lehetővé teszik a betegség pontosabb azonosítását.

2.3. Biomarker kimutatás
A biomarker minden olyan anyag, struktúra vagy folyamat a szervezetben, amely egy adott betegség kimenetelét vagy jelenlétét jelzi. Számos biomarker olyan biofluidokban mérhető anyag, mint a vér, a nyál és a vizelet.

A neurológiai betegségek biomarker-jellemzésének fő problémája a vér-agy gát (BBB), amelyen számos molekula, köztük sok fehérje nem tud átjutni. Bár bizonyos betegségek domináns biomarkerei a fehérjék, a kisméretű peptidek, például a neuropeptid Y vagy a fehérjék fragmensei nagyobb valószínűséggel átjutnak a BBB-n, és kimutathatók a keringésben.

A metabolitok a neurológiai rendellenességek biomarkereinek másik fontos csoportját alkotják. A NeoVentures Biotechnology Inc. kifejlesztett egy FRELEX nevű aptamer szelekciós megközelítést, amely lehetővé teszi az aptamerek kiválasztását a felülethez kapcsolódó rövidoligonukleotidok és a célpont közötti versengés alapján. A sejt-SELEX-hez és a szerkezetváltó SELEX más formáihoz hasonlóan ez a protokoll is végrehajtható olyan mintával, amely komponensek keverékét tartalmazza anélkül, hogy előzetesen ismernénk azokat a célpontokat, amelyekre az aptamereket kiválasztjuk.

A SELEX ezen formáinál számláló szelekciót hajtanak végre a komponensek meghatározott részhalmazaival, hogy elősegítsék a kívánt specifitásnak megfelelő aptamerek kiválasztását. A FRELEX alkalmazásával aptamereket szelektáltunk a humán tau fehérjét túltermelő transzgenikus egerek szérumával szemben.

Az aptamer szelekció humán tau irányába történő irányítása és a tau túlzott expressziójának következményei érdekében a kontraszelekcióban vad típusú egerekből származó szérumot használtunk. A csoport NGS segítségével azonosította a feldúsított aptamer szekvenciákat, és jellemezte a késői stádiumú transzgenikus egerek és a vad típusú egerek bizonyos aptamerjeit relatív abundanciájuk összehasonlításával.

Feltételezték, hogy az abundancia különbsége az epitópok adott koncentrációját tükrözi (a tau túlzott expressziójára válaszul megnövekedett), amellyel az aptamerek kölcsönhatásba léphetnek [29].

3. Diagnosztikai és terápiás alkalmazások

A neurodegeneratív betegségek (ND-k) az agy neuronjainak degenerációját jelentik, ami a központi idegrendszer struktúráinak és funkcióinak elvesztéséhez vezet. Az ND-t öregedés, genetikai és környezeti tényezők okozhatják.

A demencia az egyik leggyakoribb életkorral összefüggő ND, csakúgy, mint az Alzheimer-kór (AD). A Parkinson-kór (PD) oka lehet genetikai mutációk és/vagy környezeti toxinok. Az amiotrófiás laterális szklerózis (ALS), a szklerózis multiplex (MS), a Huntington-kór (HD) és a prionbetegségek további gyakori, genetikai kapcsolatokkal rendelkező ND-k.

Sajnos ezekre a betegségekre sem hatékony gyógymódok, sem korai felismerési stratégiák nem állnak rendelkezésre. A széles körben használt antitestekhez hasonlóan az aptamerek is vonzó szerekké váltak új bioszenzorok kifejlesztésében az ND-k korai diagnosztizálására és e betegségek gyógyítására [88].

3.1. Alzheimer-kór

Mint az életkorral összefüggő progresszív agyi rendellenesség, amely mentális hiányosságokat eredményez, az AD a demencia leggyakoribb formája. Patológiáját az amiloid prekurzor fehérjéből (APP) származó amiloid (A) aggregációja jellemzi, amely a hippocampus agyi régiójában indul be.

Bár a tudósok azt feltételezték, hogy az A-indukált neurotoxicitás összefüggésben áll az oldhatatlan A plakkokkal (AP) és a fibrillákkal (AF), a legújabb bizonyítékok azt mutatják, hogy az oldható A oligomerek (AO) is összefüggésbe hozhatók az AD kialakulásával.
Ezért az AO-t vonzó biomarkerként azonosították az AD korai diagnosztizálásában, és az A és a tau jelentős terápiás célpontnak számítanak az AD kezelésében [89].

3.1.1. AD diagnosztika

A korábban leírt AO elleni aptamerek alacsony affinitással és specificitással rendelkeztek, de a későbbi vizsgálatok sikeresebbek voltak az aptamerek azonosításában, amelyek szelektíven felismerték az A (A 40) 40-maradék formájának fibrillumait, az A 40 polimereket azonban nem [90].

Az aptamerek azonban nem rendelkeznek magas specifitással az A 40 fibrillákra, mint számos más, tesztelt amiloidogén fehérje fibrillumai. Egy olyan DNS-aptamer, amelyet úgy választottak ki, hogy kölcsönhatásba lépjen a -synuclein (-syn) oligomerrel, 68-nM affinitással, szintén kimutatták, hogy 25-nM affinitással köti az AO-t [91]. 2019-ben a Tsukakoshi és munkatársai által beszerzett aptamerek felhasználásával egy címkementes elektrokémiai aptaszenzort fejlesztettek ki az AO specifikusabb felismerésére [92].

Az aptamer tiol (-S) kölcsönhatás révén önszereli az aranyrúd elektródákat, és a rendszer érzékelési határa 30 ppm, amelyet EIS határoz meg. Ez volt az első aptaszenzor, amelyet sikeresen alkalmaztak az EIS-en alapuló A fehérjeaggregáció monitorozására, ami az aptamer nagy szelektivitása miatt volt lehetséges az A fajok között. Könnyű előállítása és hatékony regenerációja révén ez az aptaszenzor ígéretes diagnosztikai eszköz lehet az AD korai kimutatására és az A fehérje felhalmozódás kimutatására [92].

Az A oligomerek kimutatására szolgáló aptaszenzort a -syn DNS aptamer [91] felhasználásával metilénkékkel (MB) komplexben, és nanopórusos anodicalu-minhoz kapcsolva fejlesztettek ki. Az MB fehér fény magas abszorpciós együtthatója a visszavert fehér fény alacsony intenzitását eredményezte.

A oligomerek jelenlétében az aptamer/MB komplex disszociált, és a visszavert fény növekedését interferometriás reflektanciaspektroszkópiával (IRS) detektáltuk [93]. Az aptaszenzor kimutatási határa 8 pM volt, és jó választ adott az A oligomerekre, a 0,5 és 50 nM közötti koncentrációtartományban. A neurofibrilláris gubancok (NFT-k) az AD kóros jellemzői.

Az NFT-k képződése a hippocampusban indul be, és az NFT-képződés mértéke az AD-ban előforduló demencia súlyosságával függ össze. A mikrotubulusokhoz kapcsolódó fehérje, a tau hiperfoszforilációja elősegíti annak képességét, hogy a normál tau-t filamentumokká toborozza és szervezze, amelyek NFT-vé válnak. Így a tau hiperfoszforilációja az AD egyik fő oka.

A mikrotubulusok összeépülését elősegítő és az összeállt mikrotubulusok stabilizálásában betöltött normál szerepe mellett a tau-t nem egyensúlyi kapilláriselektroforézissel (CE) figyelték meg, hogy három véletlenszerűen kiválasztott ssDNS oligonukleotidot kötött, amelyek közül az egyik, az ssDNS1, nagy affinitással kötődik a tau381-hez (Kd {{). 3}} nM) [94].

Az ssDNS1 felhasználásával aptamer/antitest-szendvics assayt fejlesztettek ki a femtomoláris femtomoláris tau-fehérje koncentrációk kimutatására a humán plazmában felszíni plazmonrezonancia (SPR) segítségével [95].

Egy másik vizsgálatban a DNS-aptamereket a 441 aminosavból álló tau-fehérje (tau441) ellen szelektálták egy gyors szelekciós technikával, amely kapilláris elektroforézises felosztáson alapult, egyetlen napon belül három szelekciós körrel. A nagy áteresztőképességű szekvenálási eredmények közül öt aptamert az SPR értékelt tau felismerési képességük szempontjából.

A nagyobb affinitással rendelkező aptamer analitikai potenciálját homogén fázisfluoreszcens anizotrópia vizsgálattal mutattuk ki. Ez a nagy affinitású aptamer megkötötte a tau441 fehérjét és a rövidebb izoformákat, a tau352-t, tau381-et és tau383-at 28 nM, 6,3 nM, 3,2 nM, illetve 22 nM kimutatási határokkal ebben a vizsgálatban [96].

3.1.2. AD Terápiák

A lehetséges terápiák egyikeként az RNS-aptamereket választottuk ki, hogy gátolják az A 40 aggregációt. A szelekció során egy A oligomert konjugáltak arany nanorészecskékhez (A -AuNP), és két aptamert azonosítottak aptamer jelöltként a SELEX után.

A 10-20 nM gyerekei. Ezek az aptamerek gátolták az A plakk és fibrillumok képződését, amint azt transzmissziós elektronmikroszkóppal és A 40 enzimhez kötött immunszorbens vizsgálattal (ELISA) kimutatták [97].

Az alkohol dehidrogenáz (ABAD) csali peptidje (DP), amely kölcsönhatásba lép az A-val, antagonizálja az A peptid citotoxicitását. Az ABAD-DP szekvenciát két tiol közé illesztettük, amelyek diszulfidkötést képeznek a tioredoxinban (TRX), hogy létrehozzák a TRX1-ABAD-DP-TRX2 peptid aptamert. Stabil expresszióját NIH 3T3 sejtekben adeno-asszociált vírusok alkalmazásával immunfluoreszcens festéssel igazoltuk.

Az expresszált aptamer megkötheti az A peptidet és javíthatja a sejt életképességét. Ez a vizsgálat megerősítette, hogy a peptid aptamerek hatékonyan gátolják az A peptid citotoxikus hatását [98]. A Tau fehérjék általában a mikrotubulusokhoz kapcsolódnak és stabilizálják őket, de hiperfoszforilációjuk „tauopátiának” nevezett fehérjeaggregátumokat eredményezhet, ami toxikus.

A Tau{0}} DNS-aptamer, amelyet a humán tau441 ellen szelektáltak, gátolja a Tau1 oligomerizációját in vitro [99]. Ezt a gátlást HEK293 sejtekkel végzett sejttenyésztési vizsgálatokban is validálták [100]. A béta-szekretáz (BACE1) szerepet játszik az A termelésben, és a BACE1 expresszió gátlása halálos egerekben. Az AD kezelése magában foglalhatja a BACE1 modulációt.

Azonban nagy aktív helye miatt a BACE1 kihívást jelent a kis molekulájú inhibitorok számára. Ennek megkerülésére a nukleinsav-aptamerek új eszközök lehetnek a BACE1 aktivitás gátlására. Ennek az enzimnek van egy citoplazmatikus farka, a B1-CT, amely olyan fehérjék dokkolóhelyeként szolgál, mint például a réz-chaperon a szuperoxid-diszmutáz-1 (CCS) és az ADP ribozilációs faktor-kötő (GGA1) fehérje számára.

A B1-CT fiziológiai szerepe nagyrészt ismeretlen. A B1-CT-t irányító RNS megkötötte a BACE1 C-terminálisának membrán-proximális felét, megakadályozta a CCS-rekrutációt, miközben lehetővé tette a GGA1 kötődését a BACE1-hez, és szabályozta a BACE1 transzportját az újrahasznosító endoszómákba [101].

A BACE1 specifikus megcélzására a BI1 és BI2 DNS-aptamereket a BACE1 ellen hozták létre, amely gátolta a BACE1-et, de nem gátolta az alfa- vagy gamma-szekretázt. Egy stabilan transzfektált HEK293 sejtvonal segítségével expresszálták az amiloid fehérje prekurzort (APP), és egy in vitro fluoreszcens rezonancia energiatranszfer (FRET) vizsgálattal kimutatták, hogy az A szint csökkent, és a sejthiányt megmentették egy elsődleges tenyésztett neuronális sejtvonalban. [102]. Az aptamer hatékonyságát koleszteril-tetraetilénglikol (TEG) hozzáadásával tovább javították.

3.2. Parkinson-kór

A Parkinson-kór (PD) a második leggyakoribb neurodegeneratív betegség, amely körülbelül hétmillió embert érint világszerte. Noha progresszív betegségről van szó, amelyet motoros és nem motoros jellemzők jellemeznek, jelentős klinikai hatásai vannak a betegekre a mobilitás és az izomkontroll elvesztése miatt.

A striatális dopaminerg neuronok elvesztése és a nemdopaminerg területeken a neuronok elvesztése jellemzi a PD-t. A neuronok elvesztése általában a jellegzetes Lewy-test kialakulásához kapcsolódik. Így a -syn oligomereket tartalmazó Lewy-testek jelenléte az agyban a PD lehetséges terápiás és diagnosztikai célpontjának tekinthető.

3.2.1. PD diagnosztika

Az első aptamer, az "M5-15", amelyet a -syn ellen választottak ki, nem volt specifikus az oligomerekre, és a -syn monomerekhez is kötődhet [103]. Az ezután szelektált DNS-aptamerekről kimutatták, hogy kölcsönhatásba lépnek -syn oligomerekkel, és nem -syn monomerekkel, de megkötötték az A1-40 oligomereket.

A kutatók azt is feltárták az aptamer specifitását -syn oligomerekre, mint más fehérjékre, amelyek szerkezete túlnyomórészt -lapból áll, mint például a pirrolokinolin-kinin-glükóz-dehidrogenáz (PQQH) -lap propellerszerkezete, és kimutatták, hogy az aptamer nem kötődik [91]PQQA fajtához. Az aptaszenzorok közül számoltak be arról, hogy képesek a -synoligomerek mennyiségi meghatározására.

A -synoligomer ellen DNS-aptamert alkalmazó kolorimetriás aptaszenzort arany nanorészecskékhez (AuNP) adszorbeáltak, ami megakadályozta a nanorészecskék só által kiváltott aggregációját. A -syn oligomerhez való kötődése megakadályozza az aptamer felszívódását az AuNP-k felületére, ami lehetővé teszi az AuNP-k aggregációjának kiváltását magas sókoncentráció esetén, és színváltozást eredményez.

Ennek a rendszernek a LoD értéke 10 nM volt. A szérum azonban (még 2%-nál is) hozzájárult a vegyületek abszorbeálásához a színváltozás tartományában a vizsgálatban, és megzavarta az aptamer-Au-NP-k sófüggő aggregációját.

Az EIS-t és SPR-t használó aptaszenzorok érzékenyebbek voltak, 1 pM, illetve 8 pM LoD értékkel [104]. Egy EIS aptaszenzort nagyon specifikusnak találtak az oligomerekre, mint a monomerekre, és nem befolyásolta a szérum jelenléte [104]. Az -syn oligomer detektálására szolgáló elektrokémiai aptamer kidolgozott tervezése egy hibridet tartalmazott, amely egy -syn oligomer aptamer komplementer szekvenciájával képződik, amely tiolkötésen keresztül kapcsolódott az arany felületéhez, és terminális dezoxinukleotidil-transzferázt (TdT) és dTTP-t tartalmazott, hogy meghosszabbítsák az aptamer és annak 30 végét. kiegészítjük további polippal.

A kiterjesztett ssDNS megkötötte a metilénkéket, és elősegítette az arany felülettel való asszociációját, ezáltal aneelektrokémiai jelet hozott létre. Ezenkívül a rendszer exonukleáz I-et (Exo I) tartalmazott, amely specifikus az ssDNS-re. Amikor az aptamert a -syn oligomerhez kötődésével eltávolítottuk a bináris komplexből a komplementerével, a komplementer szálakat az Exo I emésztette, megakadályozva a metilénkék felhalmozódását az arany felületén, és így csökkentve az elektrokémiai jelet.

A kimutatási határ 10 PM (S/N=3) volt, és a jel visszanyerése 10% és alacsonyabb szérumkoncentrációk jelenlétében nagyon elfogadható 95,3–107% volt [105]. Azonban összetettsége és az enzimek beépülése miatt ez a rendszer kevésbé valószínű, hogy stabil tárolásra és terepen reprodukálható. A kapilláris elektroforézis-tömegspektrometria (CE-MS) és a szilárd fázisú extrakció (SPE) kombinációja a cél előkoncentrálására aptamerrel módosított mikropatronnal nagy mennyiségű befecskendezett mintában 100-szeresére csökkentette a kimutatási határt a CE-MS rendszerekhez képest.

Ebben az új rendszerben a mintát megtisztítják, és a térfogatot minimalizálják a jobb elemzés érdekében egy mikropatron használatával, amely szelektíven megtartja a célpontot. A patronban található aptamer affinitású (AA) szorbens kiváló alternatívája az antitesteknek. -alapú immunaffinitás (IA) szorbens, mivel a rendszer öblítéséhez szükséges háttér elektrolitok az antitesteket is denaturálják.

Az AA-SPE-CE-MS kifejlesztését a mikropatron M5-15 DNS-aptamerrel történő módosításával érték el. A rendszer 2,8 nM LoD-t mutatott, és lineáris detektálási tartománya 7 és 140 nM közötti -syn volt a vérmintában.

A szabad és N-acetilált -syn proteoformák azonosítása is lehetséges volt az MS rendkívül pontos tömegdetektálása és feloldóképessége eredményeként. Végül a mikropatront még savas BGE-vel is stabilnak találták, és körülbelül 20 elemzéshez lehetett használni, a célpont hibás számszerűsítésének kicsi az esélye [106].

For more information:1950477648nn@gmail.com