Autofluoreszcencia, mint az öregedés és a fejlett glikációs végtermékek noninvazív biomarkereje a Caenorhabditis Elegans-ban

Az autofluoreszcencia mint a Caenorhabditis elegans öregedésének non-invazív biomarkereként való használhatóságának felmérése érdekében spektrofluorimetriával mértük az egyes fonálférgek autofluoreszcenciáját. Az egyes férgek fluoreszcenciája az életkorral nőtt. Az alacsonyabb fluoreszcencia intenzitású állatok hosszabb élettartamot mutattak. Amikor a férgekből kivont fehérjéket cukrokkal inkubáltuk, a fluoreszcencia intenzitása és a fejlett glikációs végtermékek (AGE) koncentrációja idővel nőtt. A ribóz nemcsak in vitro, hanem in vivo is fokozta ezeket a változásokat. A glikációt blokkoló rifampicin elnyomta a fluoreszcencia növekedését. A nagyfelbontású tömegspektrometria kimutatta, hogy a régi férgekben felhalmozódott vitellogeninek és a glikált vitellogeninek hatszor nagyobb fluoreszcenciát bocsátottak ki, mint a naiv vitellogeninek.A fluoreszcencia öregedéssel járó növekedése a glikált anyagokból származikés ezért hasznos, nem invazív biomarkereként szolgálhat az AGE-k számára.Cistancheúj modellként szolgálhat az anti-AGE faktorok felkutatásáravalamint az AGE-k és az öregedés közötti kapcsolat tanulmányozása.

Cistancő Herbs For Anti-AGE Factors

BEVEZETÉS

Az elmúlt fél évszázad során a fejlett országokban drámaian meghosszabbodott az emberek átlagos élettartama. Azonban,az öregedéssel járó progresszív károsodás káros hatással van a fiziológiai funkciókra, ismert, mintöregedés, ésöregedéssel összefüggő betegségekis növekednekaránya a hosszú élettartammal. Kiterjesztése a"egészségi időtartam" ma már inkább szükséges, mint az élettartam meghosszabbítása. Olyan beavatkozások kívánatosak, amelyek lassítják az öregedést és meghosszabbítják az egészségi állapotot. Brenner et al. bemutatottCaenorhabditis elegans, amely egy kicsi, szabadon élő talajban élő fonálféreg, amely baktériumokkal táplálkozik, felhasználásraa differenciálódás és fejlődés molekuláris genetikai vizsgálata.

Ezt követően a férget széles körben használták kísérleti rendszerként biológiai vizsgálatokhoz, beleértve az öregedéssel kapcsolatos kutatásokat is, ennek az állatnak köszönhetően.'s egyszerűség, átláthatóság, könnyű termesztés, rövid élettartam és genetikai elemzésre való alkalmasság2. A féregben az öregedés a mozgásképesség, a stressz-ellenállás, a kognitív képességek és a garat pumpálásának csillapításával, valamint a lipofuscin ún. age pigment felhalmozódásával vizsgálható.3–5 .

Különféle vegyszerek, köztük az antioxidánsok és számos gyógyszer alkalmasak az öregedés megelőzésére6,7. Továbbá, mivel beszámoltunk arról, hogy a fonálférgek egészségi állapota és élettartama meghosszabbítható a probiotikus baktériumokkal való táplálkozással8,9, a jótékony baktériumok hosszú élettartamú hatásait is számos laboratórium igazolta10–12. A hosszú élettartamra gyakorolt ​​hatásokat túlélési görbékkel vizsgálták, de a férgeken végzett ilyen vizsgálatok több mint 3 hétig tartanak, annak ellenére, hogy a férgek viszonylag rövid élettartamúak.C. elegans. Az öregedés elleni beavatkozások hatásának értékeléséhez kényelmes és nem invazív öregedési indikátorokra van szükség, amelyek nyomon követhetik az egyes férgek és (végső soron) az emberek, mint végső célpont hatását.

A lipofuscint, az úgynevezett öregségi pigmentet széles körben használják az öregedés indikátoraként. Az autofluoreszcencia, az öregedés és a féreg élettartama közötti pontos kapcsolat azonban tisztázatlan maradt. Gerstbrein et al. arról számoltak be, hogy az öregedési pigmentek a fonálférgek egészségi állapotának érvényes tudósítói13, míg Coburn et al. beszámolt arról, hogy a kék fluoreszcencia (a gerjesztési/emissziós hullámhosszak 340/430 nm-en vannak középpontjában) haláljelzőként szolgál a halál előtt és után több óráraC. elegans14. Feltételezték, hogy a kék autofluoreszcencia időbeli növekedését az öregedő populációkban figyelték megC. elegansnem a népesség öregedési ütemét vagy egészségi állapotát tükrözi önmagában, hanem a mintában lévő elhullott vagy majdnem elhalt egyedek hányadát15.

A fejlett glikációs végtermékek (AGE-k) felkeltették a tudományos figyelmet16 mert cukorbetegségben, de a fiziológiás öregedés során is nagy mennyiségben képződnek, és oxidatív stresszhez vezetnek. Az AGE-k komplex vegyületek, amelyeket nem enzimatikus reakciók hoznak létre a fehérjékben, lipidekben vagy nukleinsavakban lévő redukáló cukrok és aminocsoportok között; A Schiff-bázisok és az Amadori-termékek ezután Maillard-reakciókkal képződnek, és AGE-ket eredményeznek. Az AGE-tartalom magas cukorbetegeknél, rheumatoid arthritisben, Alzheimer-kórban szenvedő betegeknél's betegség, és más betegségek17–19. Cukorbetegeknél az AGE felhalmozódása jól korrelál a mikrovaszkuláris betegség súlyosságával, és az életkorral növekszik. Azt azonban még tisztázni kell, hogy az AGE-k a patogenezis okai-e, vagy csak másodlagos termékek. Az AGE-ket szintén az öregedés lehetséges okaiként tartják számon20,21, amint azt az aC. elegansa cukortoxicitás modellje22,23.

Egy szisztematikus enzimhez kötött immunszorbens vizsgálati (ELISA) módszert fejlesztettek ki számos AGE vegyületre specifikus antitestek felhasználásával.24–26. Azonban nem invazív módszerekre is szükség van az AGE szintek durva becsléséhez. Mivel több AGE állítólagfluoreszcens és a hozzájuk kapcsolódóflaz uoreszcencia intenzitása jelet mutatfifinem mutat korrelációt az ELISA-val mért szintekkel27, megvizsgáltuk, hogy ezflAz uoreszcencia alternatív markerként használható az AGE-k állapotának és az öregedésnek a nyomon követéséreC. elegansmodell.

Annak ellenőrzésére, hogy a megfigyeltfluoreszcenciacsak a halált tükrözifluoreszcenciaCoburn és munkatársai számoltak be, a férgeket a nyomkövetéssel vizsgáltákflaz egyes férgek uorescenciája, mígaz adott állatok pusztulásának időzítése. Továbbá aAz AGE képződést gátló szerek hatása afluoreszcenciaés az AGE felhalmozódást is vizsgálták, hogy validálják a hasznosságátC. elegansmintaállatként az AGE kutatásokhoz.

EREDMÉNYEK

Kivont fehérjék autofluoreszcenciája, mint az öregedés és az AGE-k biomarkere a férgekben

Az extrahált fehérjék fluoreszcencia spektrofotometriája azt mutatta, hogy a gerjesztés 325 °C-on történik–365 nm-en 17-napos férgek készültekfluoresce a legmagasabb kibocsátással a 400-ban–430 nm (csúcs 420 nm) intervallum (ábra.1a) A kékflaz uoreszcencia fiatal felnőttkorban (3-napostól 5-naposig) viszonylag alacsonyabb volt, de idővel nőtt (7-napos állatoknál) (2. ábra).1b). A lipofuscin, az úgynevezett öregedési pigment vörös színt bocsát kifluoreszcencia (gerjesztés 530-nál–560 nm, emisszió 585-nél–645 nm)15; korábbi vizsgálatunkban ezt a markert késői életű (több mint 13-napos) férgeknél észleltük9. 

Az autó ótafla jelen tanulmányban talált uorescencia egy korábbi szakaszban jelent meg, és idővel növekedett, kék autoflAz uorescencia várhatóan jobb biomarker lesz az öregedés nyomon követésére. Mivel számos AGE vegyületről ismert, hogy autofluoreszcens27, megvizsgáltuk az AGE-tartalom és a kék közötti összefüggést.fluoreszcencia Western blottal, amelyben egy N elleni antitestε- (karboximetil)-lizint (CML), egy reprezentatív AGE-t alkalmaztunk. A blottolás azt mutatta, hogy az idő múlásával egy kiemelkedő sáv erősödött fel (2.1c és kiegészítő 1. ábra). Valójában a régió számszerűsítése megnövekedett AGE-t jelez (ábra.1d), bár a CML nem automatikusfluoreszcens.

Annak megállapítására, hogy az autofluoreszcencia közvetve jelezte ana Maillard-reakció által képződött AGE-k növekedése, fehérjékA féreghomogenizátumokból extrahált anyagot aszeptikus körülmények között legfeljebb 4 hétig inkubáltuk redukáló cukrokkal, például glükózzal, ribózzal és fruktózzal. Afla fehérjék fluoreszcenciája idővel nőtt cukrok jelenlétében, miközben nem volt jelentős növekedésflfluoreszcencia a cukrok nélkül végrehajtott reakciókban (ábra).2a) Féregfehérjék lettekflglikáció révén uoreszcens, még in vitro is. A három cukor mindegyikével végzett reakciók közül a ribózzal végzett reakciók produkálták a legmagasabb értéketfluoreszcencia, majd a másik két cukor. EzfiA felfedezést Bunn és Higgins jelentése magyarázza, amelyben az egyes monoszacharidok aminocsoportokkal való reakciókészsége Schiff-bázis kötések kialakításához attól függ, hogy milyen mértékben vannak jelen a nyitott (karbonil) szerkezetben, nem pedig egy gyűrűben. hemiacetális vagy hemiketális szerkezetű, és a reaktivitás mértéke a ribóz (10.0), a fruktóz (4,5) és a glükóz (0,6) (×10) sorrendjében nőtt−3 mM−1 h−1 ), ill28.

1. ábra Fluoreszcencia spektrofotometria és a féregfehérje minták AGE-i. anGerjesztési emissziós mátrix (EEM) diagramok a lizált férgek autofluoreszcenciájáról 3-napos és 17-naposok esetén. Aflaz emissziós hullámhosszon lévő uoreszcencia szintek az EEM diagramokon színes hőtérképként jelennek meg. Száz férget (vad típusú N2) a 3-naposok és a 17-naposok közül egyenként lizáltunk 3 µl lízispufferben és 4 µl 15 százalékos SDS-ben. A fehérjéket fagyasztás-olvadás ciklusokkal szabadították fel, és a fotolumineszcens spektrumokat egyfluoreszcencia spektrofotométer (Hitachi FL-4500). A lizált fonálférgek fluoreszcens tulajdonságait EEM segítségével elemeztükfluoreszcencia spektroszkópia. Gerjesztés 325-nél–365 nm-en 17-napos férgek készültekfluoresce a legmagasabb kibocsátással a 400-ban–430 nm-es intervallum megfelelő pályák sorozatakéntflaz uoreszcencia intenzitása, míg a 3-napos fiatal férgek nemfluoresce. Többváltozós elemzés (egyhullámhosszú gerjesztés több hullámhosszú emisszióval és szinkron pásztázásfluorometria) egypásztázó gerjesztésből álló EEM diagramokat eredményezett.b Az automatika szintjeifluoreszcencia (ex 340/em 360–600) minden korcsoportba tartozó állatokból kinyert féregfehérje mintákkal (3–13 napos). A férgeket (vad típusú N2) csövekbe gyűjtöttük, megmostukötalkalommal, és minden csőben lizáltuk. A mintákat ezután Mini Cordless Grinder (Funakoshi, Tokió, Japán) segítségével őröltük a fehérje felszabadítására. A fehérjetartalmat a Módszerekben leírtak szerint kvantitatívan mértük. Aflaz uoreszcencia spektrumot minden 30-µl mintára meghatároztuk (amely 1,5 µl-t tartalmaz)μg összfehérje) egy SH-9000Lab (Corona Electric, Ibaraki, Japán) modell multimódusú rácsos mikrolemez-leolvasóval. Minden mérést háromszor végeztünk el.c Az AGE CML Western blot analízise különböző életkorú féreg (vad típusú N2) populációkból kivont mintákban. Három reprodukálható kísérlet reprezentatív fényképe látható. A blotokat ugyanannak a gélnek különböző részeiből származtattuk (az 1. kiegészítő ábrán látható), és párhuzamosan dolgoztuk fel.d SzámszerűsítésAGE-k Western-blotban denzitometriával. ábrán a téglalap alakú keretekkel körülvett sávok.1c számszerűsítettük, és három reprodukálható kísérlet adatait átlag ± SE-ként mutatjuk be.

illetőleg.

Közvetlenül annak felmérésére, hogy nő-e aflA cukrok jelenlétében bekövetkező uoreszcencia az AGE képződésének köszönhető, ELISA-t alkalmaztunk a reprezentatív CML AGE vegyület kimutatására. A CML megnövekedett ezekben a reakciókban, és a ribózzal inkubált minták szintje közel hétszer magasabb volt, mint a cukor nélkül 4 hétig inkubált kontrollokban (2.2b). A ribózhoz képest a glükózzal vagy fruktózzal termelt CML mennyisége alacsony volt, hasonlóan a kontroll CML-hez; ezleletösszhangban van egy korábbi jelentéssel29.

Az autofluoreszcencia mint az öregedés és az AGE-k biomarkere in vivo

Ezután teszteltük, hogy afluoreszcenciát nemcsak a kivont fehérjékből, hanem élő férgekből is lehetett kimutatni. Amikor az egyes férgek autofluoreszcenciáját leolvasták a 384-lyuklemezekre kifeszített műanyag fólián egy többmódusú rácsos mikrolemez-leolvasóval, a spektrofotometriás eredmények hasonlóak voltak az extrahált fehérjék eredményeihez (1. ábra).3a) A kék egyéni intenzitásafla fluoreszcencia idővel nőtt (ábra).3b és Kiegészítő 2. ábra), míg nincs pirosfluoreszcenciát mutattunk ki ezzel a módszerrel. A kék ótaflAz uoreszcenciáról (340/430 vagy 350/460 nm) korábban beszámoltak, hogy összefüggésbe hozható a halállal14,15, az elemzést úgy végeztük el, hogy kizártuk az állat vizsgálatát megelőző 2 napon belül szerzett adatokat's halálát. Azonban a kékfla férgek uorescenciája az idő múlásával még mindig nőtt: a növekedésflAz uorescenciának ezért részben függetlennek kell lennie a haláltólfluoreszcencia. Annak tesztelésére, hogy az autofluoreszcencia lehet-e az öregedés biomarkere, megvizsgáltuk, hogy a férgek hány napig képesek életben maradni, miután 13-napos férgeken megmérték az autofluoreszcenciát. Az egyes férgek várható élettartama fordítottan arányos volt az autofluoreszcencia intenzitásával (2.3c).

Aflaz uoreszcencia intenzitása szintén megemelkedett a ribózzal termesztett férgekben (2.4a) ezeknek a férgeknek az élettartama signi voltfifijóval rövidebb, mint a kontrollférgeké (ábra).4b). Ezzel szemben a rifampicint, egy AGE-blokkolót tartalmazó táptalajon növesztett férgek kevesebbet bocsátottak kifluoreszcencia a rifampicin nélkül termesztett kontrollférgekhez képest (3.4c); a rifampicin élettartam-meghosszabbító hatásáról korábban beszámoltak30. Továbbá,daf-2, egy reprezentatív pro-longevity mutáns, amely szintén kevésbé autofluoreszkált, mint a vad típusú (3.4d), míg afla vad típusú uoreszcencia intenzitása az öregedéssel nőtt.

Egy része aflaz uoreszcencia várhatóan olyan vegyületekből származik, amelyek állati halállal összefüggésben keletkeznek. A kékflAz uoreszcencia lehet a haláljelző, amelyet Coburn et al. ben figyelték megC. eleganstöbb órával a halál előtt és után; a kék fény az antranilsavból származna, amely közvetlenül a férgek elpusztulása után keletkezik14. Állítólag halálflaz uoreszcenciát a kinurenin út által termelt antranilsav glikozilált formája bocsátja ki14. kyu-1A mutáns férgek, amelyekből hiányzik a kinurenináz, ennek megfelelően várhatóan nem bocsátanak ki haláltfluoreszcencia. Azonban még ennek a mutációnak a jelenlétében is úgy tűnt, hogy az idős férgek még mindig többet bocsátanak kifluoreszcenciamint a fiatalabb férgek (ábra.5a) és a ribózzal kiegészített fonálféreg-tenyésztő táptalajon (NGM) termesztett férgek jeleket mutattakfifijócskán magasabbanfluoreszcenciája, mint azok, amelyeket kiegészítő ribóz hiányában vagy a kontroll cukor-szorbittal termesztettek (4.5b). A ribózzal karbantartott férgek élettartama nyilvánvalóan rövidebb volt, mint a többieké.5c), ami az AGE-k öregedést elősegítő hatásait sugallja férgekben.

Az autofluoreszcens anyagok azonosításaOlyan anyagok azonosítására, amelyekflöregedő állatokban uoreszcált, az extrahált fehérjéken LC MALDI vizsgálatot végeztünk. Az egyes mintákban található hat legnagyobb mennyiségben előforduló fehérjét a táblázat tartalmazza1; nevezetesen a vitellogeninek és az elongációs faktorok a legjobbak közé kerültek-45fluorescáló fehérjék az idősebb férgekben. Továbbá a nagy felbontású MS és a Mascot számítási környezet segítségével olyan fehérjéket kerestünk, amelyek nagyobb mennyiségben fordultak elő a 15-naposférgekben, mint a 3-naposférgekben, és 180 fehérjét azonosítottunk (1. kiegészítő táblázatok).–3). Bár a vitellogeninek ismét feldúsultak (hatszor magasabb szinten vannak jelen az idősebb férgekben, mint a fiatal felnőttekben), az elongációs faktorok szintje hasonló volt a két csoportban (3. kiegészítő ábra). Annak ellenőrzésére, hogy ezek a fehérjék glikálhatók-e autofluoreszcens AGE-k kialakítására, tisztított elongációs faktort és vitellogenint inkubáltunk ribózzal in vitro. A glikált vitellogeninekből kibocsátott fluoreszcencia spektruma hasonló a 17-napos férgekből kinyert nyers kivonatokhoz (1. ábra).6a) Bár a riboflavin ismertfluoresce, azt találtuk, hogy a riboflavin emissziós hullámhossza eltér ahogy a féregkivonatok. A glikált vitellogenin és az elongációs faktor FL fluoreszcenciája hat-, illetve háromszorosa volt a nem glikált fehérjékének 23 napra in vitro (1.6b).

Az anti-CML antitestekkel végzett Western-blot-vizsgálattal kimutatott AGE-k idővel szintén növekedtek a 3-napos férgekről a 13-napos férgek in vivo (1. ábra).1c). Az anti-vitellogenin antitestekkel végzett egyidejű Western-blot-vizsgálattal azt találtuk, hogy az anti-CML jelek ugyanolyan méretű sávok voltak, mint a vitellogeninek (1.6c). Bár az YP170 és YP115 vitellogeninek felhalmozódtak az életkorral ebben az időszakban, az AGE jelek intenzitása nagyobb mértékben fokozódott, mint az YP170 vitellogenin mennyiségének növekedése.6d). A fluoreszcens mikroszkóppal kimutatták, hogy 13-napos férgek (ábra7d–f, 2. és 3. oszlop) kibocsátott jelekfifijóval intenzívebb kék fény, mint a 3-napos fiatal felnőtteknél (ábra.7a–c, 2. és 3. oszlop; Ábra.7g); az ivarmirigyek is világosabbnak tűntek (ábra.7d–f, 1. és 2. oszlop). A CML egy reprezentatív AGE, bár maga a CML nem ft fluoreszcens. A pentosidinről, egy másik AGE-ról ismert, hogy fluoreszkáló. Azonban sem az anti-CML, sem az anti-pentosidin antitestekkel végzett immunfestés nem mutatott szembetűnő különbségeket az idős és fiatal férgek között (az adatokat nem mutatjuk be). Az anti-CML azonban diffúz terjedést mutatott a szövetekben, míg az anti-pentosidin alig mutatott ilyet.