A béta-glükán fokozott immunválaszt a Newcastle-betegség elleni vakcinára és megváltoztatta a lép MRNS expresszióját csirkékben

ABSZTRAKT

Jelen vizsgálatot az élesztőgomba sejtfalából nyert termék, a b-glükán (G70) szájon át történő beadásának a Newcastle-betegség vírus (NDV) specifikus hemagglutinációs gátlás (HI) titerére, a limfocita proliferációra és a limfocita proliferációra gyakorolt ​​hatásának vizsgálatára végeztük. a T-limfocita-szubpopulációk szerepe élő NDV-vakcinával kezelt csirkékben. Ezen túlmenően, a b-glükán hatását a lép génexpressziójára transzkriptom szekvenálással vizsgáltuk. Az eredmények azt mutatták, hogy a b-glükán kiegészítése megnövelte a szérum NDV HI titerét, növelte a limfociták NDV stimulációs indexét a perifériás vérben és a bélrendszerben, és elősegítette a T-limfociták CD4+ T-sejtekké történő differenciálódását. Az RNS-szekvenálás (RNS-seq) analízis kimutatta, hogy a G70 növelte a G-protein-kapcsolt receptorhoz és az MHC I. osztályú polipeptidhez kapcsolódó mRNS-expressziót, és csökkentette a katelicidinnel és a betadefenzinnel kapcsolatos mRNS-expressziót. A G70 immunmoduláló hatása a mitogén által aktivált protein kináz jelátviteli útvonalon keresztül működhet. Összefoglalva, a G70 fokozhatja az élő NDV-vakcina immunológiai hatékonyságát csirkékben, és potenciális adjuváns jelöltként alkalmazható a baromfiiparban.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

Kulcsszavak: Newcastle betegség elleni vakcina, béta-glükán, adjuváns, feketecsontú csirke, RNS-seq

BEVEZETÉS

Az élesztősejtfal poliszacharidjai közvetlenül a Saccharomyces cerevisiae sejtfalából származnak, és széles körben használják növekedésserkentőként, antimikrobiális szerekként vagy immunmodulátorként baromfiban a termelés és az egészség javítása érdekében (Schiavone és mtsai, 2017; Hasted és mtsai, 2021). Korábban az élesztő sejtfal poliszacharidjait tartalmazó PW220 nevű termékről kimutatták, hogy orális adagolással fokozza a Newcastle-betegség vírusa (NDV) által kiváltott immunválaszt, és megváltoztatja a csirkék vakbélének mikrobiális közösségét (Bi et al., 2020). ). Az élesztősejtfal poliszacharidjai elsősorban b-glükánból és mannán-oligoszacharidokból állnak (Wang et al., 2018). Ebben a vizsgálatban a b-glükánt vizsgálták csirkékben az NDV-vakcinára adott immunválaszra gyakorolt ​​hatását illetően. A lép az immunválasz elindításának kulcsszerve. Egy közelmúltbeli tanulmány kimutatta, hogy a PW220, amely egy élesztő sejtfal terméke, fokozta a TGF-b, IL-6, TLR5, GATA-3 és T-bet mRNS expresszióját a csirkék lépében ( Bi et al., 2022). A konkrét mechanizmust azonban tisztázni kell. Az RNS-szekvenálás (RNA-seq) az egyik olyan nagy teljesítményű technológia, amely kvantitatív génexpresszió vizsgálatára alkalmazható, és különböző expressziós profilok elemzését biztosítja a teljes transzkriptom szintjén (Zhao et al., 2018). A nagy érzékenység és az alacsony költség előnyei miatt az RNA-seq-et széles körben alkalmazzák az állattenyésztéssel és a baromfival kapcsolatos vizsgálatokban (Teixeira és mtsai, 2019; Yuan és mtsai, 2020). Így ebben a vizsgálatban a b-glükán beadásának az NDV-specifikus hemagglutináció-gátló (HI) titerekre, a limfociták proliferációjára és a T-limfocita szubpopulációkra gyakorolt ​​hatását értékelték NDV-vakcinával orálisan beoltott csirkékben. Ezenkívül transzkriptomanalízist alkalmaztunk a b-glükán génexpresszióra és a mögöttes jelátviteli útvonalakra gyakorolt ​​hatásának értékelésére a csirkék lépében.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

Kattintson ide a Cistanche Enhance Immunity termékek megtekintéséhez

【Kérjen többet】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Állatok

Az egynapos kereskedelmi feketecsontú csirkéket (hím) a Guizhou Yushun Poultry Co., Ltd.-től (Anshun, Kína) szerezték be. A csirkéket drótketrecekre osztották, így szabad hozzáférést biztosítottak a takarmányhoz és a vízhez. Az első 7 napban a szobahőmérsékletet 33°C és 35°C között tartottuk, majd fokozatosan 2 naponként 1°C-kal csökkentették 27°C-ig. Minden csirkét a Southwest University Animal Care és az Animal Care által megállapított szabványok szerint dolgoztak fel. Használati bizottság (Etikai tanúsítvány száma: IAC-2021-0057). A vizsgálat végén minden kísérleti madarat CO2-vel elaltattak.

A cistanche előnyei a férfiak számára – erősítik az immunrendszert

Vakcina

Az NDV (La Sota törzs) élő vakcináját a Qingdao YEBIO Bioengineering Co., Ltd. (Qingdao, Kína) biztosította.

Reagensek 

Az élesztősejtfal-terméket (YP) G70 élesztősejt (Saccharomyces cerevisiae) falából nyertük, amely b-glükánt tartalmaz (nagyobb vagy egyenlő 70%) (AngelG70, QB/T4572, Angel Yeast, Yichang, Kína). Az NDV-specifikus HI-titerek mérésére szolgáló antigén- és pozitív kontrollszérumokat a Qingdao Regen Diagnostics Development Center-től (Qingdao, Kína) vásároltuk. Anti-Csirke CD3-APC (C2818-T9580), CD4-FITC (D0117-WA78E) és CD8- PE (L{{14) }}TH49T) patkányokban a Nanjing Zeweil Biological Technology Co., Ltd. (Nanjing, Kína) ajánlotta fel.

Kísérleti terv

Negyvennyolc, 5 napos feketecsontú csirkét véletlenszerűen 3 csoportba osztottak (1. táblázat), és vagy az alaptakarmányt (2. táblázat), vagy a 0,1% G7{{10} alaptakarmányt kapták. } (b-glükán, 0,7 g/kg) kiegészítés a jelen kutatás idejére. A H csoportot (G70 + vakcina) és C csoportot (vakcina) orálisan immunizáltuk NDV vakcinával 14, illetve 28 napon. Az S csoportot (Sailne) azonos térfogatú sóoldattal kezeltük. A HI-titer tesztelésére vérmintákat vettünk szárnyvénapunkcióval 5, 7, 14, 21, 28, 35 és 42 napos korban. Hét nappal az emlékeztető oltás után minden oszlopban 8 csirkét véletlenszerűen kiválasztottunk, és CO2-t használó fulladással leöltük. A limfocitákat mind a perifériás vérből, mind a jejunumból elkülönítettük, hogy elvégezzük a limfocita proliferációt és az áramlási citometriás elemzést. Jejunális mintavételnél a duodenum felfüggesztő szalagja volt a jejunum kiindulópontja, és a jejunum kezdőpontjából 5 cm hosszú szakaszt vettünk. A lépet gyorsan lefagyasztottuk folyékony nitrogénben, majd -80 fokon tároltuk az RT-qPCR és a szekvenciaprofil elkészítéséhez.

1. táblázat. Kísérleti terv

2. 1. táblázat Kísérleti brojler alaptakarmányok összetétele és tápanyagtartalma.

HI Tanulmány

A szérum NDV-specifikus HI-titereinek vizsgálatát az előző leírás szerint végeztük (Ball et al., 2019). Röviden, a szérumot foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) hígítottuk 1:2-ről 1:1024-re az V-alsó 96-lyukú mikrotiterlemezen. Ezután lyukanként 25 ml NDV-hígítást adtunk, és 37 °C-on 30 percig inkubáltuk. Ezt követően 25 ml 1%-os kakas eritrocita szuszpenziót adtunk minden egyes lyukba, és 37 fokon 30 percig inkubáltuk. Minden mintát kétszer teszteltünk, és mindegyik lemezre mind pozitív, mind negatív kontrollokat helyeztünk. A HI-titerek a legnagyobb hígításon alapultak, amely a hemagglutináció teljes gátlását eredményezte. Az átlagos HI-titert és a standard hibát (SE) csoportonként mértük.

Limfociták izolálása perifériás vérből

A limfocitákat a perifériás vér limfocitáiból izoláltuk és összegyűjtöttük a Lymphocyte Separation Medium Kit (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd., Tianjin, Kína) segítségével. Ezután a limfocitákat szuszpenzióban tároltuk RPMI 1640 tápközeggel (Solarbio, Peking, Kína), amely 5% magzati borjúszérumot és 25 mM HEPES-t (pH 7,0) tartalmazott.

Limfociták izolálása a jejunumból

A hozzárendelési folyamat az előző leírásnak megfelelően, kis módosításokkal történt (Yuan et al., 2020). Röviden: használjon 70 mm-es sejtszűrőt, hogy a beleket 4 ml hideg PBS-re hasítsa fel. Ezt követően a mintasejtek szuszpenzióját 4500 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 12 percig, a felülúszó eltávolításával. Ezután szuszpendálja újra a bélsejteket egy teljes táptalajra (Solarbio Co., Peking, Kína), amely 5% borjúmagzati szérumot (FBS) tartalmaz RPMI 1640-ben (Sijiqing Co., Hangzhou, Kína). A végén a csirke limfocita izolációs készlet (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.) a limfociták elkülönítésére. a bélszövetet 4 ml hideg PBS-re hasítottuk 70 mm-es sejtszűrő segítségével. Ezután a mintasejtek szuszpenzióját 4500 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 12 percig, és a felülúszót elöntöttük. Ezt követően a bélsejteket 5% FBS-t (Sijiqing Co.) tartalmazó RPMI 1640-ben (Solarbio Co.) szuszpendáltuk. Végül a limfocitákat elválasztottuk a csirke limfocita izolációs készlettel (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.).

A limfociták proliferációja 

A sejteket 96-lyukú lemezekre oltottuk (5£105 lyukanként), és az inaktivált NDV antigénjével 4 hemagglutinációs egységig vagy azonos térfogatú sóoldatig stimuláltuk. Minden mintát 3 ismétlésben teszteltünk. A sejteket és az antigént 44 órán át inkubáltuk 37 °C-on 5%-os CO2-atmoszférában, majd 50 ml metil-tiazolil-tetrazoliumot (MTT) (2 mg/ml) adtunk minden egyes lyukhoz, és további 4 órán át inkubáltuk. A mintákat 1200 £ g-vel 8 percig centrifugáltuk beltéri hőmérsékleten. Ezt követően a felülúszót óvatosan eltávolítottuk, és 100 ml DMSO-t adtunk mindegyik lyukba. A lemezeket 8 percig ráztuk, hogy a kristályok teljesen feloldódjanak. Végül az átlagos optikai sűrűséget (OD) 570 nm-en vettük fel. A stimulációs indexet (SI) a következő egyenlettel kaptuk meg: stimulált lyukak OD értékei/stimulálatlan kutak OD értékei (Cui et al., 2020).

A cistanche előnyei a férfiak számára – erősítik az immunrendszert

T-limfocita alpopulációk áramlási citometriai elemzése

A limfoid sejtszuszpenziókat izoláltuk, és kétszer mostuk PBS-sel. A sejtkoncentrációt 106 ng/ml-re módosítottuk, majd jégen tartottuk. Minden mintát 2 ml patkány anti-csirke CD3-APC, CD4- FITC és patkány csirke elleni CD8-PE-vel festettünk fényálló körülmények között 30 percig, majd 2 PBS-es mosással. A sejteket áramlási citometriás analízissel vizsgáltuk Flow citométeren (BD Bioscience, San Jose, CA).

RT-qPCR elemzés

A teljes RNS-t a lépből TRIzol reagenssel (Takara, Shiga, Japán) származtattuk a gyártó útmutatásai szerint, majd PrimeScript RT Master Mix (Takara, Dalian, Kína) segítségével cDNS-vé alakítottuk T100-as termikus cikluson (Bio-Rad, Hercules, CA). A csirke béta-aktint belső kontrollgénként alkalmaztuk. A kiválasztott gének RT-qPCR-jét Multiple Real-Time PCR System-en (AB, Carlsbad, CA) SYBR Premix Ex Taq II-vel (Tli RNaseH Plus) (Takara) végeztük. A mennyiségi eltérések értékelésére a relatív kvantitatív módszert (244CT) alkalmaztuk (Bi et al., 2022). A primer szekvenciákat a 3. táblázat tartalmazza.

RNS kivonás

A H csoportból (G70 +vakcina) és a C csoportból (vakcina) származó 3 lépminta mindegyikét használtuk az RNS-seq-hez TRIzol reagenssel (Takara). Ezt követően az RNS-t 1%-os agaróz géllel vizsgáltuk szennyeződésre és lebomlásra, majd az RNS tisztaságát NanoPhotometer spektrofotométerrel (IMPLEN, Westlake Village, CA) elemeztük. Az RNS koncentrációját a Qubit RNA Assay Kit segítségével határoztuk meg a Qubit 2-ben.{5}} Fluorometer (Life Technologies, Carlsbad, CA). Az RNS integritását a Bioanalyzer 2100 rendszer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) RNA Nano 6000 Assay Kit segítségével mértük. Az eredmények azt mutatták, hogy az RNS teljes volt, és nem volt DNS-szennyezett.

Átiratelemzés

A transzkriptom szekvenálást, a szekvencia összeállítást és az adatok elemzését a Novogene Bioinformatics Technology Co. Ltd. (Peking, Kína) biztosította. A transzkriptom fő eljárásait a következőképpen soroltuk fel: 1) Az mRNS tisztítását a teljes RNS-ből poli-T oligohoz kapcsolt mágneses gyöngyök alkalmazásával végeztük. A fragmentálást kétértékű kationokkal NEB Next First Strand Synthesis Reaction Pufferben (5X) hajtottuk végre magas hőmérsékleten. 2) Az első szál cDNS-t véletlenszerű hexamer primer és Moloney rágcsáló leukémia vírus (M-MuLV) Reverse alkalmazásával szintetizáltuk. A második szál cDNS-szintézisét ezután DNS-polimeráz I és RNáz H alkalmazásával szintetizáltuk. 3) A fennmaradó túlnyúlásokat az exonukleáz/polimeráz aktivitások révén tompa végekké alakítottuk. Ezután egy hajtű hurokszerkezetű NEB Next Adaptert ligáltunk, hogy a DNS-fragmensek 3'-végének adenilezése után a hibridizációt előkészítsük. 4) Körülbelül 250-300 bp cDNS-fragmenst nyertünk, és a könyvtárat Beckman Coulter AMPure XP rendszerével (Beckman Coulter, Beverly, MA) tisztítottuk. Ezután 3 ml NEBU SER enzimet (Thermo Fisher, Hillsboro, OR) alkalmaztunk méret szerint kiválasztott, adapterrel ligált cDNS-sel 37 °C-on 15 percig, majd 5 percig 95 °C-on. A PCR amplifikációt Phusion High-Fidelity DNS polimerázzal végeztük. Végül a PCR-termékeket megtisztították (AMPure XP rendszer), és a könyvtár minőségét az Agilent Bioanalyzer 2100 rendszerrel becsülték meg. Az indexkódolt minták klaszterezését TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS (Illumina, San Diego, CA) segítségével végeztük. Ezután a szekvenálást Illumina Novaseq platformon végeztük, és 150 bp-os páros végű leolvasásokat generáltunk. A referencia genom- és génmodell-annotációs fájlokat a genom webhelyéről töltöttük le (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release- 98/fasta/gallus_gallus/ és ftp://ftp. ensembl.org/pub/re-lease-98/gtf/gallus_gallus/). A referencia genom indexét HISAT2 (v2.0.5) segítségével hoztuk létre, és a páros végű tiszta leolvasásokat a referenciagenomhoz igazítottuk. Az egyes génekhez leképezett leolvasások számát és az egyes géneknél a Fragments Per Kilobase per Million (FPKM) értéket a gén hossza alapján, valamint a génhez leképezett leolvasások számát a Feature Counts v1.5 segítségével számítottuk ki.{38} }p3. A H csoport (G70 + vakcina) és a C csoport (vakcina) közötti differenciált expressziót a DESeq2 R csomag (1.16.1) segítségével határoztuk meg. Gének P < 0,05 és |log2 (szeres változás)| > 1-et differenciális expressziós génként (DEG) határoztunk meg.

3. táblázat. Az RT-qPCR primerek szekvenciái.

Valós idejű kvantitatív PCR validálás 

A H csoport (G70 + vakcina) és a C csoport (vakcina) összehasonlításában két felfelé és 4 lefelé szabályozott DEG-et választottunk a transzkripciós szekvenálás eredményeinek RT-qPCR-rel történő megerősítésére. Az RNS-t PrimeScript RT Master Mix (Takara) alkalmazásával cDNS-vé alakítottuk át T100 termikus cikluson (Bio-Rad). A primer szekvenciákat a 3. táblázat tartalmazza. Belső kontrollgénként csirke b-aktint használtunk. A kiválasztott gének RT-qPCR-jét Multiple real-time PCR System-en (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) SYBR Premix Ex Taq II-vel (Tli RNaseH Plus) (Takara) végeztük. Egy relatív kvantitatív módszert (244CT) alkalmaztunk a számszerűsítés eltéréseinek értékelésére. Minden mintát három párhuzamosban vettünk az elemzéshez.

Statisztikai analízis

A Duncan post hoc teszttel végzett egyutas ANOVA-t használtuk a csoportok többszöri összehasonlítására SPSS szoftverrel (21.0, SPSS Inc., Chicago, IL). Az adatokat az SE § átlagában fejezzük ki. A P < 0,05 értéket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak.

EREDMÉNYEK A b-glükán hatása a szérum antitest-titerekre

Amint az 1. ábrán látható, az NDV-specifikus HI-titerek minden csoportban csökkentek a vakcinázás előtt, és emelkedtek a H (G70+vakcina) és C (vakcina) csoportokban az immunizálás után. Érdekes módon magasabb HI-titereket figyeltek meg a H csoportban (G70+Vakcina) 21 (P > 0.05), 28 (P < 0.{{ 14}}5), 35 (P > 0,05) és 42 (P > 0,05) d éves, mint a C csoportban (Vakcina).

A b-glükán hatása a limfocita proliferációra

A G70 hatását a perifériás vér limfocitáinak proliferációjára a 2A. ábra mutatja be. Az SI a vér limfocitáiban a G70 (G70 + vakcinával) kiegészített madarakban az emlékeztető immunizálás 7. napján (P < 0,05) fokozódott, összehasonlítva a vakcina csoporttal. Ezenkívül a jejunális limfocitákban az SI szignifikánsan megemelkedett az emlékeztető immunizálást követő 7. napon (P < 0,05), összehasonlítva a vakcina csoporttal (2B. ábra).

A b-glükán hatása a CD4 +/CD8 + T-sejt arányára a perifériás vérben 

A 3A. és 3B. ábra a limfociták és CD3 + sejtek kapuzását mutatja, a 3C–3E. ábra pedig a CD4 + /CD8 + T-sejtek arányát mutatja a G70-ban, vakcina, illetve sóoldat csoportok. A 3F. ábrán látható, hogy az emlékeztető immunizálást követően nem volt jelentős különbség a vakcina és a sóoldattal kezelt csoport között (P > 0,05), míg a CD4 + /CD{{12} } A T-sejt nyilvánvalóan magasabb volt a G70 (G70 + vakcina) csoportban, mint a vakcina csoportban (P < 0,05).

1. ábra: B-glükán orális adagolásának hatása az NDV-vakcina szérum antitest-titereire. Az adatok az átlag SE §-ban vannak kifejezve.

Kapcsolódó génexpresszió

A 4. ábrán látható módon szignifikánsan megnövekedett a TGF-b mRNS expressziója (P < 0.05), IL-6 (P < 0.{{13} }5), és TLR5 (P < 0.05) volt kimutatható a G70-nel (G70 + vakcina) kezelt csirkék lépében, összehasonlítva a vakcina csoporttal. Nem találtunk szignifikáns különbséget az IFN-g (P > 0,05), TLR4 (P > 0,05) és TLR3 (P > 0,05) mRNS expressziójában a lépben a G70 (G70 + vakcina) és a vakcina között csoportok.

RNS szekvenálási adatok elemzése 

A 8 lépkönyvtárból származó RNS szekvenálása 24,1 g nyers adatot eredményezett, amint azt a kiegészítő anyag S1 táblázata mutatja. A CN csoportos vakcinát, a HN pedig G70 + csoportos vakcinát jelent. A C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3 és H4 könyvtár a következőkből áll: 45,591,492, 47,424,782, 46,193,492, 54,403,376, 47,118,476, 47,118,476, 47,118,476, 47,118,476, 47,118,476, 47,118,476, 47,118,476, 45,8,4,5,4,5,8,4,8 438 eredeti olvasmány. Az aptamert követően a kétértelmű szekvenciákat és a gyenge minőségű szekvenciákat eltávolítottuk, így 44,050,198, 45,449,884, 44,261,112, 52,097,846, 45,542,404, 44,566,290, 44,566,290, 44,40,290, 34,40,210, 64,298, 45,49,884, 44,261,112, 52,097,846. A tiszta leolvasások több mint 96%-a az eredeti leolvasások között volt, és 8 könyvtárat egyeztettek HISAT2-vel az olvasások szekvenálása céljából a Gallus genomot tartalmazó referenciaadatbázishoz. Ezenkívül a tiszta leolvasásokat az esetek több mint 95%-ában ehhez az adatbázishoz rendelték hozzá. A C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3 és H4 könyvtárakra jellemző értékek: 40 921 384 (92,9%), 41 302 100 (90,87%), 40 771 075 (92,11%), 46,4,4 (92,11%), 46,4, 4, 4, 4, 2, 4, 4, 4, 4, 4, 7, 4, 4, 7, 4, 7, 4, 4, 7. 2 %), 40 213 444 (90,23%), 40 922 895 (92,77%), illetve 40 971 972 (93,06%) olvasást rendeltek egyedileg a referenciaadatbázishoz.

Különbözően kifejezett gének

Amint az 5A. ábrán látható, összesen 198 eltérően expresszálódó gént azonosítottak, köztük 47 felfelé és 151 lefelé szabályozott gént. A DEG-ket részletesen az S2 táblázatban ismertettük. Az 5B. ábra azt mutatja, hogy a DEG-ek a kezelések jó reprodukálhatóságával rendelkeznek.

A génontológiai osztályozás és a kiotói gén- és genomok gazdagítási enciklopédiájának elemzése

Azokat a géneket, amelyek eltérően expresszálódnak, 3 fő funkcionális kategóriába sorolták a génontológia (GO) osztályozási rendszer alapján: biológiai folyamatok, sejtkomponensek és molekuláris funkciók. A 3 kategória legjobb 10 GO kifejezését a 6. ábra mutatja be. Túlsúlyban voltak azok a gének, amelyek részt vettek a "humorális immunválaszban", "kemokinválaszban", "antimikrobiális humorális válaszban", "a baktérium elleni védekező válaszban, ""Immunválasz az antimikrobiális humorra, amelyet antimikrobiális peptidek közvetítenek", "védelmi válasz Gram-negatív baktériumok ellen" és "védelmi válasz Gram-pozitív baktériumok ellen" a biológiai folyamatok kategóriájában. Ezenkívül a molekuláris funkció kategóriájában a gének figyelemreméltó aránya a "CC motívum kemokin receptor (CCR) kemokin receptor kötéshez", "kemokin receptor kötéshez" és "lipopoliszacharid kötéshez" kapcsolódott. Továbbá a „mitokondriális légzési lánc komplex I”, „NADH-dehidrogenáz komplex” és „légzési lánc” voltak a legdominánsabb gazdagított kifejezések a sejtkomponensek kategóriájában. A Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes útvonalelemzést is elvégezték a differenciálisan expresszált géneken. Az eredmények azt sugallták, hogy a géneket főként 7 útvonalba csoportosították, beleértve a "Neuroaktív ligandum-receptor interakciót", "Gap junction", "mitogen-aktivált protein kináz (MAPK) jelátviteli útvonalat", "ABC transzportereket", "aminosavak bioszintézisét" "Droganyagcsere" és "Fehérjeexport".

2. ábra: B-glükán orális adagolásának hatása a limfocita stimuláló indexre (SI). (A) Perifériás vér limfociták; (B) bél limfociták. Az adatok az átlag SE §-ban vannak kifejezve.

3. ábra: A b-glükán orális adagolásának hatása a perifériás vér CD4+/CD8+ sejtarányára. (A) Kapu a limfocitákon; (B) kapu a CD3+ T-sejteken; (C) a CD3+ CD4 + CD8 + T-sejtek gyakorisága a G70+ vakcinacsoportban; (D) a CD3+ CD4 + CD8 + T-sejtek gyakorisága a vakcinacsoportban; (E) CD3+ CD4 + CD8 + T-sejtek gyakorisága a sóoldat csoportban; (F) a CD4+/CD8+ arányt jelző vonaldiagram. Az adatok az átlag SE §-ban vannak kifejezve.

4. ábra: B-glükán orális adagolásának hatása az mRNS expressziójára csirke lépben. Az adatok az átlag SE §-ban vannak kifejezve.

5. ábra. Az RNA-Seq adatok összefoglalása. (A) A differenciálisan expresszált gének listája, (B) a DEG-k klaszterezési térképe.

A differenciálisan expresszált gének ellenőrzése RT-qPCR-rel

A felfelé vagy lefelé szabályozott 6 DEG-et valós idejű kvantitatív PCR-rel igazoltuk. Az eredmény arra utal, hogy az RT-qPCR adatok általában összhangban vannak az RNS-seq adatokkal általában, ami megbízható szekvenálási eredményt jelez (7. ábra). A MAPK útvonalhoz kapcsolódó gének mRNS-ének expressziója Amint a 8. ábrán látható, a FAS (P < 0.05) és a CACNA2 (P < 0,05) mRNS expressziója szignifikánsan csökkent. a G70 csoportba tartozó csirkék lépében (G70 + vakcina) a vakcina csoporttal összehasonlítva. Ezenkívül a DUSP5 és DUSP4 numerikusan megnövekedett mRNS-expresszióját, valamint a p38, JNK és ERK mRNS-expressziójának numerikus csökkenését mutatták ki a G70 csoportban (G70 + vakcina), összehasonlítva a vakcina csoporttal (P > 0,05). .

VITA

Az élő ND-vakcinát széles körben beoltják csirkefarmokban, de még mindig vannak Newcastle-betegség szórványos kitörései az immunizált baromfiállományokban (Zhang et al., 2022). Az optimális vakcinákat úgy határozták meg, hogy stimulálják a sejtes és nyálkahártya-immunitást, valamint a hatékony humorális immunitást (Shan et al., 2019). Ezért egyre nagyobb figyelmet fordítottak azokra az adjuvánsokra, amelyek nyálkahártyán, valamint sejtes immunválaszt válthatnak ki (Chen et al., 2014; Yu és mtsai, 2015). Az injekciós módhoz képest az orális adagolás könnyebb megközelítés, amely csökkenti a költségeket és kevesebb stresszt okoz a brojlercsirkék számára (Boyaka és mtsai, 2003; Zhang és mtsai, 2008). A tanulmány eredményei azt mutatták, hogy a b-glükánnal kiegészített étrend figyelemreméltóan növelte az NDV-specifikus HI-titerek szintjét a csirkék szérumában, ami összhangban van a korábbi jelentésekkel (Horst et al., 2019). Az NDV-specifikus antitest elengedhetetlen a humorális immunválasz kialakulásához, hogy megvédje a csirkéket az NDV-fertőzéstől (Martinez és mtsai, 2018; Li és mtsai, 2020). A B-limfociták antitesteket termelnek, a T-limfociták pedig a mitogén hatására szaporodnak (Bohacova et al., 2021). A jelen vizsgálatban a csirke perifériás vér limfocitáinak NDV-vel szembeni stimulációs indexe a G70 csoportban nyilvánvalóan magasabb volt, mint a vakcina csoporté, ami azt jelzi, hogy több T-limfocita aktiválódott. A T-limfociták domináns alpopulációi a CD4 + és CD8 + T-sejtek (Cui et al., 2020). A CD4 + T-sejtek főként citokineket termelnek és elősegítik a B-sejtek érését, míg a CD8 + T-sejtek a célsejtek elpusztításával járnak (Zhang et al., 2021b). Ebben a kutatásban a G70 csoportban kimutatott CD4 +/CD8 + T-sejtek aránya egyértelműen nőtt, ami arra utal, hogy a G70 több CD4 + T-sejtet képes aktiválni a perifériás vérből. Ezenkívül szignifikánsan magasabb intestinalis limfocita stimulációs indexet figyeltünk meg a G70 csoportban, mint a Vaccine csoportban, ami megerősítette, hogy a b-glükán stimulálhatja a bél limfocitákat is. Korábbi kísérleteink megerősítették, hogy a PW220 élesztősejtfal-kivonat szignifikánsan növelte a bélspecifikus sIgA és IgA + sejtek számát (Bi et al., 2020). Vagyis mind a b-glükán G70, mind a PW220 hatékonyan elősegíti a bélnyálkahártya immunitását.

A cistanche előnyei a férfiak számára – erősítik az immunrendszert

Korábban beszámoltak arról, hogy a b-glükán adásával javult az állatok immunitása. Guo et al. (2003) megerősítette, hogy a b-glükán adagolása javította a bursa és az NDV-specifikus antitestek indexét csirkékben. Levine et al. (2018) azt javasolták, hogy a b-glükán kiegészítés fokozhatja a bélrendszer MHC Ⅱ szintjét, és növelheti a CD45 + sejtek számát, hogy enyhítse a bélkárosodást.

Li és mtsai. (2005) feltárta, hogy az étrendi b-glükán növelheti az IL-8 és a TGF-b mRNS expressziós szintjét a sertések bélrendszerében. A b-glükán immunmoduláló hatásának mechanizmusa nem tisztázott. Kim et al. (2010) kimutatták, hogy a b-glükán elősegítette a dendritikus sejtek érését a CD40, CD80 és CD expressziójának fokozásával{10}}. Ezenkívül Lee és Kim (2014), valamint Su et al. (2020) arról számoltak be, hogy a b-glükán aktiválja a mintázatfelismerő receptorokat, például a dektin-1 receptort, a Toll-szerű receptort és a CR3-at (Baert et al., 2015). A lép kritikus szerv az immunválasz megindításában, és alapvető szerepet játszik mind a veleszületett, mind a szerzett immunitásban (Bronte és Pittet, 2013). Mindazonáltal csak kevés kutatás áll rendelkezésre az mRNS expressziójának RNS-seq elemzésén alapuló élesztő poliszacharidok lépben történő orális adagolása után. A jelen tanulmányban a Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes útvonalelemzés azt sugallta, hogy ezeket a géneket elsősorban két útvonalra csoportosították, beleértve a "Neuroaktív ligandum-receptor interakciót" és a "MAPK jelátviteli útvonalat". A b-glükánt célzó mintázatfelismerési receptorok az immunsejtek felszínén gazdagodtak (Goodridge et al., 2009). A b-glükán felismerést követően a tirozin kinázt és a kappaB nukleáris faktort (NF-kappaB) stimulálták ezek a receptorok, ami a gyulladást elősegítő citokinszekréciót és az immunválaszok aktiválását eredményezte (Kankkunen et al., 2010; Masuda et al. ., 2012; Xu et al., 2016; Bode és mtsai, 2019). A MAPK, mint a szerin-treonin protein kinázok családja, döntő szerepet játszik a csirkék gyulladásában és citokintermelésében. Byun et al. (2016) kimutatták, hogy a b-glükán növelte az interferon-g és az interleukin-2 termelődését, és szignifikánsan nagyobb mértékű MAPK p38 foszforilációt váltott ki a peritoneális makrofágokban. Wang és mtsai. (2014) arról számoltak be, hogy a b-glükán gyengíti a gyulladásos válaszokat a THP-1 sejtekben a p38 MAPK aktiváció gátlásával. Ebben a vizsgálatban 13 DEG-et, köztük DUSP4-et, CACNA2D1-et, PDGFD-t, PTPRR-t, ENSGALG00000006351-et, FAS-t, MAP2K3-at, MYC-t, DUSP5-öt, MAX-ot, SRF-t, PRKCB-t és EGFR-t azonosítottak a MAPK jelátviteli útvonalon, ami arra utalhat, hogy a b-glukán szabályozott immunválasz. lépben a MAPK-n keresztül csirkékben. A MAPK a Ser/Thr kinázok egy konzervált osztálya a sejtekben, amelyek főként olyan sejtválaszokban vesznek részt, mint például az immunválasz, az apoptózis és a proliferáció. A MAPK család legalább 3 alcsaládot tartalmaz: c-Jun N-terminális kináz (JNK), p38 MAPK és extracelluláris szignál-szabályozott kináz (ERK) (Hong és mtsai, 2020; Zhang és mtsai, 2021a). A DUSP4 és DUSP5 kettős specifikus foszfatázok, amelyek specifikusan gátolják a MAPK családtagok, például a p38, JNK és ERK aktivitását, fontos szabályozó szerepet játszva a gyulladásos túlreakció megelőzésében és a gyulladás visszafejlődésének elősegítésében a szervezetben (Imasato et al. ., 2002; Talreja et al., 2021). Ezenkívül egy gga-miR-200a-3p nevű kisméretű, nem kódoló RNS-ről számoltak be, amely elnyomja a gyulladást elősegítő faktorok expresszióját, és így szabályozza a gazdaszervezet autoimmun válaszát azáltal, hogy negatívan szabályozza a MAPK útvonalat. és annak downstream jelátviteli molekulái (Pham et al., 2017). Jelen tanulmányban az RT-qPCR elemzés kimutatta, hogy a P38, JNK és ERK mRNS expressziója csökkent, és a DUSP4 és DUSP5 mRNS expressziója nőtt a b-glükánnal (G70) etetett csirkékben. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a b-glükán (G70) immunerősítő hatása a Newcastle-betegség elleni vakcinára összefüggésben állhat a MAPK-n keresztül közvetített pro-inflammatorikus faktorok negatív visszacsatolási szabályozásával. Ezenkívül a FAS egy esszenciális anyag, amely közvetíti az apoptózist, és létfontosságú az immunhomeosztázishoz (Krueger et al., 2003; Guegan és Legembre, 2018). Eközben a CACNA2 egy feszültségfüggő kalciumcsatorna alegység, amely elősegíti a sejtproliferációt, migrációt és inváziót (Sun et al., 2020). Ebben a vizsgálatban a FAS és a CACNA2 szignifikánsan csökkent a b-glükánnal (G70) kiegészített csirkékben, jelezve, hogy a b-glükán (G70) elsősorban az immunsejtek apoptózisának gátlása és az autoimmunitás kiegyensúlyozása révén fejt ki immunerősítő hatást. Ezek az eredmények elméleti referenciaként szolgálnak a b-glükán (G70) immunerősítőként történő alkalmazásához klinikai körülmények között. A b-glükán immunválaszt fokozó mechanizmusa azonban a MAPK útvonal negatív visszacsatolási hatására további bizonyításra szorul. Érdekes megjegyezni, hogy a CATH3-at, CATH1-et, CATH2-t tartalmazó katelicidint kódoló gének és a b-defenzint kódoló gének, beleértve az AvBD6-ot, AvBD7-et, AvBD1-et és AvBD4-et, jelentősen csökkentek a H összehasonlításban (G-csoport vakcina). kontra kontroll (csoportos vakcina). A gazdaszervezet védelmi peptidek (HDP) olyan effektormolekulák, amelyek döntő szerepet játszanak a veleszületett immunrendszerben (Cuperus et al., 2013). Ezeket a peptideket számos állatfajban fedezték fel, az emlősöktől a madarakig. A csirkékben 4 katelicidin található, ezek a CATH1, CATH2, CATH3 és CATHB1, amelyek hatékonyan pusztítják el a különféle baktériumokat (Hamad et al., 2017). A madarak béta-defenzinei (AvBD), más néven gallinacean, kis kationos peptidek, amelyek cisztein-maradékai között 3 cisztein-diszulfidkötés található, és fontos szerepet töltenek be a veleszületett immunrendszerben (Yoshimura, 2015). A katelicidinek és a béta-defenzin expressziójának csökkenését valószínűleg a visszacsatolás szabályozása magyarázta, ahol a bakteriális és parabakteriális populációkat csökkentették az élesztősejtfal poliszacharidjai (Bi et al., 2020). Hasonló eredményeket más tanulmányok is feltártak. Shao et al. (2016) kimutatták, hogy az élesztő b-glükán kiegészítése brojlercsirkében elnyomta a Salmonella fertőzést és csökkentette a HDP-k expresszióját kvantitatív valós idejű PCR elemzéssel. Ebben a vizsgálatban egy főként b-glükánból álló G70 termék növelte az NDV-specifikus antitestek szintjét a szérumban, növelte a perifériás vér limfocitáinak és a bél limfocitáinak NDV-stimulációs indexét, és elősegítette a perifériás vér T-limfocitáinak CD-vé történő differenciálódását. 123}} T-sejtek. Ezen túlmenően, az RNS-seq analízis azt mutatta, hogy a G70 fokozta a G-fehérjéhez kapcsolt szerotonin receptorhoz és MHC I. osztályú polipeptidhez kapcsolódó mRNS expressziót, és csökkentette a katelicidinnel és béta-defenzinnel kapcsolatos mRNS expressziót. Figyelembe véve a G70 fokozott hatását az ND vakcinára csirkékben, a G70 hatása más baromfivakcinákra, például a madárinfluenza elleni vakcinára tovább vizsgálható.

6. ábra: KEGG útvonal elemzés.

7. ábra: A kiválasztott DEG jelöltek RT-qPCR megerősítése. Az adatok az átlag SE §-ban vannak kifejezve.

8. ábra Relatív mRNS expresszió a lépben. A lépből a teljes RNS-t extraháltuk. A csirke b-aktint szolgáltuk belső kontrollgénként. Az adatok az átlag SE §-ban vannak kifejezve.

IRODALOM

Baert, K., E. Sonck, BM Goddeeris, B. Devriendt és E. Cox. 2015. Sejttípus-specifikus különbségek a b-glükán felismerésben és jelátvitelben sertés veleszületett immunsejtekben. Dev. Összeg. Immunol. 48:192–203.

Ball, C., A. Forrester, A. Herrmann, S. Lemiere és K. Ganapathy. 2019. A Newcastle-betegség vírusa vagy a madár metapneumovírusa elleni élő vakcinák által biztosított összehasonlító protektív immunitás a fertőző hörghurut vírus klasszikus és változatos törzseivel együtt adott napos brojlercsirkékben. Vakcina. 37:7566–7575.

Bi, S., J. Zhang, Y. Qu, B. Zhou, X. He és J. Ni. 2020. Az élesztősejtfal-termék fokozta a bél IgA-válaszát és megváltoztatta a vakbél mikroflóra fajtáit csirkék orális vakcinázása után. Csibe. Sci. 99:6576–6585.

Bi, S., J. Zhang, L. Zhang, K. Huang, J. Li és L. Cao. 2022. Az élesztősejtfal fokozza a sejt által közvetített immunválaszt a Newcastle-betegség vírus elleni vakcinára. Csibe. Sci. 101:101712–101721.

Bode, K., F. Bujupi, C. Link, T. Hein, S. Zimmermann, D. Peiris, V. Jaquet, B. Lepenies, H. Weyd és PH Krammer. 2019. Az apoptotikus sejtek annexinjéhez kötődő dektin-1 perifériás immuntoleranciát vált ki a NADPH-oxidázon keresztül-2. Sejt. Rep. 29:4435–4446.

Bohacova, P., J. Kossl, M. Hajkova, B. Hermankova, V. Holan és E. Javorkova. 2021. A mitogén által stimulált B- és T-sejtek közötti különbség az R-fikoeritrin-konjugált antitestek nem specifikus kötődésében. J. Immunol. Mód. 493:113013–113023.

Boyaka, PN, A. Tafaro, R. Fischer, K. Fujihashi, E. Jirillo és JR McGhee. 2003. Az immunrendszer terápiás manipulációja: a veleszületett és adaptív nyálkahártya immunitás fokozása. Curr. Pharm. Tervezés. 9:1965–1972.

Bronte, V. és MJ Pittet. 2013. A lép az immunitás lokális és szisztémás szabályozásában. Immunitás. 39:806–818.

Byun, E., S. Park, B. Jang, N. Sung és E. Byun. 2016. A gamma-besugárzott b-glükán immunmodulációt és rákellenes aktivitást indukál a MAPK és NF-kB útvonalakon keresztül. J. Sci. Étel. Agr. 96:695–702.

Chen, X., X. Chen, S. Qiu, Y. Hu, C. Jiang, D. Wang, Q. Fan, C. Zhang, Y. Huang, Y. Yu, H. Yang, C. Liu, Z Gao, R. Hou és X. Li. 2014. Az epimedium poliszacharid-propolisz flavon orális folyadék hatása a nyálkahártya immunitására csirkékben. Int. J. Biol. Macromol. 64:6–10.

Cui, X., Y. Wang, R. Guan, M. Lu, L. Yuan, W. Xu és S. Hu. 2020. Növényi olajadjuvánsban emulgeált ragadós száj- és körömfájás vakcina szérumproteomikai analízisével megerősített immunválasz. Védőoltások. 8:180–197

Cuperus, T., M. Coorens, A. van Dijk és HP Haagsman. 2013. Avian host Defense peptides. Dev. Összeg. Immunol. 41:352–369.

Goodridge, HS, AJ Wolf és DM Underhill. 2009. Béta-glükán felismerése a veleszületett immunrendszer által. Immunol. Jel 230:38–50.

Guegan, J. és P. Legembre. 2018. A Fas/CD95 nem apoptotikus funkciói az immunválaszban. FEBS J 285:809–827.

Guo, Y., RA Ali és MA Qureshi. 2003. A béta-glükán hatása brojlercsibék immunválaszára. Immunopharm. Immunol. 25:461–472.

Hamad, SK, S. Kim, SW El-Kadi, EA Wong és RA Dalloul. 2017. Gazdavédelmi peptidek összehasonlító expressziója pulyka baromfiban. Csibe. Sci. 96:2083–2090.

Hasted, T., S. Sharif, P. Boerlin és MS Diarra. 2021. A gyümölcsök és azok kivonatainak immunstimuláló hatása baromfiban. Elülső. Immunol. 12:641696.

Hong, Y., J. Lee, TH Vu, S. Lee, HS Lillehoj és YH Hong. 2020. A csirke madár b-defenzin 8 modulálja az immunválaszt a mitogén által aktivált protein kináz jelátviteli útvonalakon keresztül egy csirke makrofág sejtvonalban. Csibe. Sci. 99:4174–4182.

Horst, G., R. Levine, R. Chick és C. Hofacre. 2019. A béta- 1,3-glükán (AletaTM) hatása a brojlercsirkék vakcinázási reakciójára. Csibe. Sci. 98:1643–1647.

Imasato, A., C. Desbois-Mouthon, J. Han, H. Kai, ACB Cato, S. Akira és J. Li. 2002. A p38 MAPK gátlása glükokortikoidokkal a MAPK foszfatáz-1 indukciója révén fokozza a nem tipizálható Haemophilus befolyás által kiváltott toll-like receptor expresszióját 2. J. Biol. Chem. 277:47444–47450.

Kankkunen, P., L. Teiril€a, J. Rintahaka, H. Alenius, H. Wolff és S. Matikainen. 2010. Az (1,3)-béta-glükánok aktiválják a dektin-1 és az NLRP3 gyulladásos folyamatát az emberi makrofágokban. J. Immunol. 184:6335–6342.

Kim, HS, JY Kim, HK Lee, MS Kim, SR Lee, JS Kang, HM Kim, K. Lee, JT Hong, Y. Kim és S. Han. 2010. Dendrites sejt aktiváció umbilicaria esculenta-ból izolált glükánnal. Immun. Netw. 10:188–197.

Krueger, A., SC Fas, S. Baumann és PH Krammer. 2003. A CD95 szerepe a perifériás T-sejt apoptózis szabályozásában. Immunol. Rev. 193:58–69.