Beta Vulgaris Rubra L. (cékla) héj metanol kivonat csökkenti az oxidatív stresszt és serkenti a sejtszaporodást a H2O2 által kiváltott oxidatív stresszt okozó humán köldökvéna endothel sejtjeiben a VEGF expresszió fokozása révén

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtöbbet tudni

Laila Naif Al-Harbi 1,*, Subash-Babu Pandurangan 1, Alhanouf Mohammed Al-Dossari 1, Ghalia Shamlan 1, Ahmad Mohammad Salamatullah 1, Ali A Alshatwi 1 és Amna Abdullah Alotiby 2

Absztrakt:A polifenolok antioxidáns képessége ésflavonoidokAz étrendi anyagokban jelenlévő segít megállítani a reaktív oxigénfajták (ROS) kialakulását, és megvédi az endoteliális simaizomsejteket az oxidatív stressztől/indukált nekrózistól. A cékla (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) egy gyakran fogyasztott zöldség, amely gazdag forrásaantioxidánsok. A céklahéj bioaktív vegyületeit és szerepüket a humán köldökvénás endothel sejtekben (HUVEC) még mindig nem kutatják. Jelen tanulmányban céklahéj metanolos kivonatot (BPME) állítottunk elő, és ennek hatása a bio-hatékonyságra, a nukleáris integritásra, a mitokondriális membránpotenciálra, a vaszkuláris sejtnövekedésre és az immunregulációhoz kapcsolódó génexpressziós szintre indukált HUVEC-ekben.oxidatívstresszt elemezték. A gázkromatográfiás-tömegspektroszkópiai (GC-MS) eredmények megerősítették, hogy a BPME 5-hidroxi-metil-furfurált (32,6 százalék), metil-piruvátot (15,13 százalék), furfurált (9,98 százalék) és 2,3-dihidro{{11}-ot tartalmaz. },5-dihidroxi-6-metil-4H-pirán-4-on (12,4 százalék). A BPM-kivonat hatékonyan fokozta a sejtproliferációt, és MTT-vizsgálattal igazolták; a nukleáris integritást propidium-jodidos (PI) festési vizsgálattal igazoltuk; a mitokondriális membránpotenciált (∆ψm) JC-1festési teszttel igazoltuk. Az Annexin V vizsgálat megerősítette, hogy a BPME-vel kezelt HUVEC-k 99 százaléka életképes sejteket mutatott, de csak 39,8 százalékos életképességet mutattak ki a csak H2O2-vel kezelt HUVEC-k. Ezenkívül a HUVEC-k 48 órás BPME-kezelése csökkentette a lipid-peroxid (LPO) mRNS expresszióját, és növelte a NOS-3, Nrf-2, GSK-3, GPX, endoteliális nitrogén-monoxid-szintáz (eNOS) szintjét. ) és a vaszkuláris sejtnövekedési faktor (VEGF) mRNS expressziós szintjét. Megállapítottuk, hogy a BPME-kezelés csökkentette a proinflammatorikus (nukleáris faktor-κ (F-κ ), szöveti nekrózis faktor (TNF- ), toll-like receptor-4 (TLR-4), interleukin{{37} } (IL-1 ))és vaszkulárisgyulladás(intracelluláris adhéziós molekula (ICAM), vascularis sejt adhéziós molekula (VCAM), EDN1, IL-1 )-hoz kapcsolódó mRNS expressziók. Összefoglalva, a céklahéj kezelés hatékonyan növelte a vaszkuláris sima sejtnövekedési faktorokat és a mikrotubulusok fejlődését, míg csökkentette a vaszkuláris gyulladásszabályozókat. A BPM hasznos lehet az érrendszeri sima sejtek regenerálódásához, a szövetek helyreállításához és az öregedésgátló potenciálhoz.

Kulcsszavak:cékla; oxidatív stressz; mitokondriumok; angiogenezis; gyulladás

További információért kattintson ide

1. Bemutatkozás

Az angiogenezis a szervezet meglévő érrendszeréből történő vasculogenezis fiziológiás folyamata [1]. Nemcsak az embrionális fejlődéshez és szaporodáshoz, hanem a sejtciklushoz és a szövetek helyreállításához is elengedhetetlen [2,3]. Mindazonáltal összefüggésbe hozható különféle betegségek patogenezisével, mint például a tumornövekedés, a reumás ízületi gyulladás, valamint különféle ischaemiás és gyulladásos betegségek [3–5]. A vaszkuláris endotélium fontos szerepet játszik a vaszkuláris vérzéscsillapítás fenntartásában az erek tónusának, valamint az immun- és gyulladásos reakciók szabályozásával [6,7]. Az endoteliális sejtek (EC-k) vékony egysejtű rétegek, amelyek az erek minden belső felületén sorakoznak, és számos olyan molekulát termelnek, amelyek lokálisan vagy távoli helyeken hatnak [7]. Az endotélium alapvető fontosságú a test homeosztázisában, és az endotélsejtek válaszában bekövetkező bármilyen változás a gyulladásos és érrendszeri betegségek elsődleges eseményeihez vezet, mint például az ateroszklerózis és a magas vérnyomás [6, 8, 9]. Ezek a betegségek oxidatív stresszt okoznak, ami megváltoztatja az EK szerkezetét és működési integritását, és endothel diszfunkcióhoz vezet [9]. A humán köldökvénás EC-ket (HUVEC) széles körben használják modellként a humán vaszkuláris endotéliummal kapcsolatos vizsgálatokhoz. Ezenkívül hasznos modellt jelentenek az endothel működésében szerepet játszó fő biológiai útvonalak tanulmányozására [10]. Bioaktív vegyületek és fitokemikáliák bőségesen megtalálhatók gyümölcsökben, zöldségekben, zöldfűszerekben és sok növényben, amelyek számos egészségügyi előnnyel rendelkeznek, például gyulladásgátló, antioxidáns, antikarcinogén és angiogén tulajdonságokkal [11–13]. Ebből a szempontból a cékla (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) az Amaranthaceae családba tartozik, és a magas szintű antioxidánsok egyik legjobb forrása közé tartozik [14,15]. Pontosabban, több biológiailag aktív fitokemikált tartalmaz, beleértvebetalainok, flavonoidok,polifenolok, terápiás enzimek, aszkorbinsav, dehidroaszkorbinsav (DHAA) és szervetlen nitrát (NO3) [16–18]. Ezenkívül értékes esszenciális tápanyagokat is biztosít, mint például kálium, kalcium, magnézium, nátrium, vas, cink, foszfor, réz és mangán [19]. Számos tanulmány beszámolt arról, hogy a cékla kivonat (gyökér) számos jótékony hatással bír hipoglikémiás, lipidszint-csökkentő, gyulladáscsökkentő, vérnyomáscsökkentő és antiproliferatív tulajdonságai miatt [20–22]. Ezek a jótékony tulajdonságok mind a bioaktív vegyületek szabad gyökfogó képességéhez köthetők. Így a cékla fogyasztását számos táplálkozási és egészségügyi előnnyel hozták összefüggésbe. Tápértéke miatt funkcionális táplálékforrásként használható olyan krónikus anyagcsere-betegségeket kiváltó oxidatív stresszek ellen, mint a 2-es típusú cukorbetegség és a szív- és érrendszeri betegségek [23]. Az irodalmi áttekintés alapján a Beta vulgaris erős antioxidáns, immunszabályozó és angiogén tulajdonságokkal rendelkezik. Apigenint találtak a répalevélben; antiproliferatív hatást fejt ki a máj- és bélsejtekben, és az AMPK aktiválása révén javíthatja a magas zsírtartalmú étrend által kiváltott elhízás komorbiditást [24,25]. De Silva és munkatársai (2020) [26] megállapították, hogy a Beta vulgaris megvédi a vaszkuláris EC-ket a külsőleg kiváltott oxidatív stressztől, ami a növényben jelenlévő számos bioaktív vegyület együttes hatásának köszönhető. Eddig a Beta vulgaris gyökérhéj EC proliferációjára és angiogenezisére gyakorolt ​​mechanikai hatását nem kutatták eléggé. Ezért célul tűztük ki, hogy jelen tanulmányban megvizsgáljuk a Beta vulgaris gyökérhéjjal kapcsolatos vaszkuláris sejtproliferációt, mikrotubulusok fejlődését, oxidatív stresszét és angiogenezis kapacitását sejtmorfológiai és génexpressziós elemzés segítségével HUVEC-ben. Feltárják a céklahéj metanolos kivonatának angiogén hatásait, amelyek a nukleáris integritással, a mikrotubulusok fejlődésével, a mitokondriális hatékonysággal és a sejtciklus-stimulációval kapcsolatosak humán vaszkuláris EC-kben.

2. Anyagok és módszerek

2.1. A cékla elkészítése(Beta vulgaris rubra L.) Metanol-kivonat A friss cékla (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr.) mintáit eredetileg a Rijád, Szaúd-Arábiai Királyság (KSA) zöldségboltjaiból szerezték be. A friss céklát desztillált vízzel mostuk, hogy eltávolítsuk a szárat és a szennyeződéseket. A külső bőrt meghámozták, hogy eltávolítsák, és apró darabokra vágják. A mintákat forró levegős kemencében 40 ◦-on szárítottuk, majd egy elektronikus turmixgép segítségével porrá őröltük. Ezután 5{{10}}0 g port extraháltunk 1 liter metanolt tartalmazó steril palackban (Sigma, St. Louis, MO, USA) 24 órán keresztül szobahőmérsékleten rázógépet és háromszor megismételjük. Ezt követően Whatmanfifiltert (Whatman, Clifton, NJ, USA) használtunk a kivonat szűrésére. Végül a nyomás csökkentésével az oldószert elválasztottuk az extraktumtól, majd a metanol lepárlása után az extraktumot szilárd, száraz anyagként összegyűjtöttük. A kivont mintát a további felhasználásig hűtőszekrényben 4 ◦C-on tároltuk. 2.2. Gázkromatográfia és tömegspektroszkópiai analízis A céklahéj metanolos kivonatát (BPME) szilícium-dioxid kapilláris oszlopba fecskendezték (30 m × {{60}},25 mm átmérőjű × 0). .25 µm filmvastagság) GC-MS műszer (Agilent 6890N/5973I, California, CA, USA) tömegszelektív detektorral a kémiai összetétel kimutatására. A műszer kezdeti hőmérsékletét 7{{90}} ◦C-ra állítottuk be, 2 perc tartás mellett 305 ◦C-ra 20 ◦C/perc sebességgel, majd 1 percig tartottuk. A teljes GC futási időt 45 percre állítottuk be héliumgázzal (99,999 százalék) vivőgázként (állandó 1,2 ml/perc sebesség), 250 ◦C-ra injektor hőmérsékletként és 230 ◦C-ra ionforrásként. hőfok. A GC-MS spektrum alapján kiszámítottuk a megfelelő komponens relatív százalékos arányát, és az ismeretlen komponens tömegspektrumát a National Institute of Standard and Technology-ban elérhető ismert 62,{29}} mintákkal összehasonlítva azonosítottuk. számítógépes könyvtár (NIST08). 2.3. Sejttenyésztő anyagok és vegyszerek A HUVEC-ket az American Type Culture Collection-től (ATCC, Manassas, VA, USA) vásároltuk. A sejttenyésztő anyagokat, mint például a Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), EDTA, tripszin és más anyagokat a Gibco-tól (Paisley, Egyesült Királyság) szereztük be. A penicillin-sztreptomicint (PS) és a magzati szarvasmarha-szérumot (FBS) a Hyclone Laboratories-tól (USA) vásároltuk. A molekuláris biológiai kísérletben használt vegyi anyagokat a Sigma-Aldrich cégtől szereztük be, különösen az MTT-t [3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazólium-bromid], PI és JC-1 festéssel. A SYBR Green PCR Master Mix és a cDNS szintézis kit a Qiagentől (Hilden, Németország) szereztük be. 2.4. HUVEC-ek A HUVEC-eket DMEM-ben tenyésztettük, és 1% PS és 10% FBS komplexszel egészítettük ki. A sejteket párásított atmoszférában 37 °C-on, 5 százalékos CO2-tartalom mellett inkubáltuk, és körülbelül 3 naponta továbbtenyésztettük. 2.5. Sejtéletképesség és sejtszaporodás MTT vizsgálattal HUVEC-eket (1 × 104 sejt/lyuk) fenntartó tápközeggel tenyésztettünk, és egy éjszakán át hagytuk tapadni egy 96-lyukú tenyésztőlemezen. Ezután a táptalajt egy új táptalajra cseréltük, amely növekvő koncentrációjú BPME-t (0, 0,05, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6 és 3,2 µg/ml) tartalmazott az MTT vizsgálati lemez térképének megfelelően, és 24 és 48 percig inkubáltuk. h; kezeletlen sejteket használtunk kontrollként. Az inkubációs periódus után a kísérleti sejteket üregenként 20 µl 5 mg/ml MTT-vel (3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2, 5-difenil-tetrazólium-bromid, amelyet dimetil-szulfoxidban (DMSO) oldottunk fel, és további 4 órán át 37 ◦C-on inkubáltuk. Ezután a tápközeget eldobjuk, és a képződött lila formazánt 100 µl 100%-os DMSO-ban oldjuk. Az oldat abszorbanciáját mikrolemez-leolvasóval (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) mértük 570 nm hullámhosszon. A sejtproliferáció százalékos arányát ( százalék ) a következő egyenlettel számítottuk ki: (a minta abszorbanciája/kontroll átlagos abszorbanciája) × 100. 2.6. Kísérleti terv A jelen sejtproliferációs vizsgálat szerint a vizsgált alacsonyabb BPME koncentrációk (0,1 és 0,2 µg/ml) proliferáló HUVEC-eket és mikrotubulusok morfológiáját mutatták toxicitás nélkül. 0,1 és 0,2 µg/ml dózisú BPME mennyiségeket választottunk ki, és normál HUVEC-ekkel és 10 mM H2O2--indukált oxidatív stresszhatású HUVEC-vel kezeltük 48 órán keresztül, hogy meghatározzuk a sejtproliferációt, gyulladásgátló, angiogén és apoptotikus potenciált. (1.ábra). A vivőanyag-kontroll mindkét csoportban 48 órán keresztül megmaradt. Mindkét kísérleti csoportban kvercetint (10 µM) használtunk referencia kontrollként. Inkubálás után a kezeletlen és kísérleti sejteket BDTM MitoScreen (JC{105}}) készlettel elemeztük sejt- és nukleáris morfológiára, valamint mitokondriális membránpotenciálra; Az apoptózist az Annexin V/apoptosis alapú sejtválogató módszerrel határoztuk meg társcitometriában. Az oxidatív stressz, a proinflammatorikus és az angiogenezishez kapcsolódó génexpressziós szinteket vizsgálták.

2.7. Propidium-jodidos festődési vizsgálat magkárosodásra Celluláris morfológiák jellegzetes magkárosodás, piknózis vagy apoptotikus morfológiai változások kimutatására 0,1 és 0,2 µg/mL BPME-vel (H2O2-vel vagy anélkül) HUVEC-ben PI festési analízissel határoztuk meg fordított fluoreszcens mikroszkóppal Leite és mtsai. [27].

2.8. Mitokondriális membránpotenciál (∆ψm) vizsgálata JC-1 festékfestéssel A mitokondriális membrán potenciálját (∆ψm) JC-1 assay-vel határoztuk meg a vivőanyag-kontroll mitokondriális hatékonyságának felmérésére és a {{4} },1 és 0,2 µg/mL BPME-vel kezelt HUVEC-k (H2O2-vel és anélkül). Röviden, a JC-1 festőoldatot hasonló térfogatú táptalajjal kevertük, majd hozzáadtuk a kísérleti HUVEC-ekhez, és 20 percig sötétben, 37 ◦C-on inkubáltuk. Ezután a meg nem kötött JC-1 festéket óvatosan kétszer mostuk 200 µL JC-1 festőmosópufferrel 4 ◦C-on. Ezt követően a JC-1 festéssel szembeni j-aggregátum felhalmozódását fluoreszcens mikroszkóppal fluoreszcens mikroszkóppal figyelték meg, és képeket rögzítettek. Ezenkívül a mitokondriális membrán potenciálját áramlási citometriával mértük a BDTM MitoScreen (JC-1) Kit segítségével.

2.9. Annexin V/apoptosis analízis áramlási citometriával Az életképes, proapoptotikus, korai apoptotikus és nekrotikus sejtek számszerűsítésére a másik citometriai alapú Annexin V/PI detektáló kit (Sigma Chemicals, USA) módszert alkalmaztuk. Az oxidatív stressz által kiváltott HUVEC-eket (1 × 105/lyuk) 24-lyukú lemezekre szélesztettük, és BPME-vel (0,1 és 0,2 µg/ml) vagy vivőanyag kontrollal inkubáltuk. 48 óra. Inkubálás után a sejteket 400 µl 5 µl Annexin V-fluoreszcein-izotiocianátban (FITC) és 5 µl PI-t tartalmazó kötőpufferben inkubáltuk; ezt követően a sejteket 15 percig szobahőmérsékleten (RT) sötétben tartottuk. A sejteket társcitometriával elemeztük (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), hogy azonosítsuk az apoptotikus (PI-negatív és Annexin V pozitív) és a késői apoptotikus (PI-pozitív és Annexin V-pozitív) sejteket [28].

2.10. Kvantitatív valós idejű PCR-elemzés A Fastlane® sejt-cDNS-készletet (Qiagen, Hilden, Németország) használtuk a teljes RNS kinyerésére és a cDNS szintézisére a vivőanyag-kontrollból, BPME-vel kezelt HUVEC-kből (H2O2-vel és anélkül) kvantitatív PCR-rel (qPCR) félautomatizált. eszköz (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Az oxidatív stressz expressziós szintjei, beleértve (lipid-peroxid, NOS-3), antioxidáns (Nrf-2, GSK-3 és GPx), gyulladásgátló (nukleáris faktor-κ (NF-κ), tumornekrózis faktor (TNF-), interleukin-1 (IL-1), vaszkuláris sejtnövekedési faktor (VEGF), toll-like receptor-4 (TLR-4)) , valamint a vaszkuláris gyulladást (intracelluláris adhéziós molekula (ICAM), vascularis sejt adhéziós molekula (VCAM), EDN1 és endoteliális nitrogén-monoxid-szintáz (eNOS)) és a referenciagént, az -aktint elemeztük HUVEC-ben, és a módszerrel számszerűsítettük. Yuan et al. [29]. Az amplifikációs értékeket (∆Ct) a Ct (kezelt) és Ct (kontroll) különbségéből számítottuk ki. A génexpressziót a 2−∆∆Ct érték kifejezésével ábrázoltuk.

2.11. Statisztikai analízis Minden kísérletet háromszor megismételtünk, és az eredményül kapott adatokat átlagértékek ± standard deviáció (SD) formában fejeztük ki. A csoportok közötti különbségek statisztikai elemzését egyutas varianciaanalízissel (ANOVA) végeztük SPSS szoftverrel (28.5 verzió, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Ezután Tukey többszörös összehasonlító tesztjét végezték el, ha szignifikáns különbségeket találtak. Az összes eredményt átlag ± SD-ként adtuk meg hat ismétlés esetén minden csoportban. Ha p-érték < 0,05,="" akkor="" azt="" szignifikánsnak="" tekintettük="">

Cistanche az immunitás javítására

3. Eredmények

3.1. Bioaktív molekulák a BPME-ben A BPME kémiai összetevőit GC-MS (Turbomass, PerkinElmer) segítségével igazoltuk. A céklahéj-kivonat kémiai összetételét a rendelkezésre álló tömegspektrumok és a National Institute of Standard and Technology (NIST) spektrális adatbázisával való összehasonlításával határozták meg. A GC-MS eredmények megerősítették, hogy a BPME hidroxi-acetont (8,18 százalék), 5-hidroxi-metil-furfurált (32,6 százalék), metil-piruvátot (15,13 százalék), béta-d-allopiranózt (1,48 százalék), furfurált (9,98 százalék), 2-hidroxi-gamma-butirolakton (1,32 százalék), és 2,3-dihidro-3,5-dihidroxi- 6-metil-4H-pirán -4-egy (12,4 százalék; 2a. ábra, 1. táblázat). 3.2. Sejtszaporodás A BPME in vitro sejtproliferációs potenciálját a HUVEC-okkal szemben a 2b. ábra mutatja be. A kísérleti csoportokban nem figyeltünk meg szignifikáns sejtnövekedésgátlást a vivőanyag-kontrollhoz képest. Jelen tanulmány megerősítette, hogy a HUVEC-ekkel kezelt BPME koncentrációjának növelése 48 óra (112 százalék) megnövekedett sejtproliferációt és életképességet eredményezett, szemben a 24 órás kezeléssel (1{51}}3 százalék). Ezenkívül a BPME-vel kezelt HUVEC-k fénymikroszkópos felvételei 48 óra elteltével megerősítették, hogy a normál sejtek egységes alakúak a tapadó sejtmorfológiával, megnövekedett proliferáló (replikációs) sejtek száma károsodás nélkül (2c. ábra). 3.3. A sejt- és nukleáris morfológia, a mikrotubulusok képződése és a JC-1 festődés elemzése HUVEC-ben A 3. ábra a mikrotubulusok fejlődésének morfológiáját mutatja FL fluoreszcens mikroszkópos felvételeken. A H2O2--indukált oxidatív stresszt okozó HUVEC-k gyenge proliferációt és szabálytalan morfológiát mutattak a tapadó sejteken a kontroll HUVEC-ekhez képest. A normál HUVEC-ek, amelyeket 0,2 µg/mL BPME-vel kezeltek, szaporodó sejteket mutattak replikáció vagy neogenezis útján mikrotubulus morfológiával. Mindeközben a BPME-vel kezelt sejtek 0,1 µg/ml dózisa 100 százalékban adherens sejteket mutatott a mikrotubulusok korai stádiumában. A 0,2 µg/mL BPME-vel kezelt oxidatív stresszhatású HUVEC-k proliferáló új sejteket azonosítottak mikrotubulus morfológiával és csökkent oxidatív sejtkárosodással. Ezen túlmenően, 0,1 µg/ml BPME is növelte a normál vaszkuláris sejtmorfológiát a proliferáló sejtekkel.

A 4a. ábra a gömb alakú magszerkezet normál morfológiáját mutatja a kontroll és BPME-vel (0,1 vagy 0,2 µg/mL) kezelt HUVEC-ekben. A 4b. ábra a H2O2 által kiváltott oxidatív stresszt okozó normál és HUVEC-k PI-festésének képeit mutatja. A H2O{{10}}kezelt HUVEC-ek szabálytalan alakú magokat mutatnak, amelyek 30 perc elteltével kondenzációt és piknózist mutatnak. Azonban 0,2 µg/mL BPME-kezelés oxidatív stressz alatti HUVEC-k esetében normál morfológiájú, körkörös magokat mutatott. A 0,2 µg/ml BPME kivonattal összehasonlítva a 0,1 µg/mL BPME kevésbé védő hatást fejtett ki a H2O2- által kiváltott oxidatív stressz ellen HUVEC-ekben.

2. ábra: Céklahéj-metanol-kivonat (a), in vitro sejtproliferáció (b) GC-MS kromatogramjának és sejtmorfológiai fénymikroszkópos képeinek (c) eredményei HUVEC-ben, növekvő koncentrációjú céklahéj metanolos kivonattal (BPME) kezelve. ) (a tapadó és szaporodó sejtek egységes alakja, amelyet piros nyílhegy említ). Minden érték átlag ± SD (n=6). * p Kisebb vagy egyenlő, mint 0,05 a járművezérléssel összehasonlítva.

3. ábra: A mikrocsövek képződésének elemzése fluoreszcens mikroszkóppal vivőanyag-kontrollban, 0,1 és 0,2 µg/mL adag céklahéj metanolos kivonat (BPME) kezelt normál és H2O{{6} }indukált oxidatív stresszes HUVECs 48 óra elteltével. 48 óra elteltével a H2O2-indukált oxidatív stresszhatású HUVEC-k morfológiája megváltozott a vivőanyag-kontrollhoz képest. A céklahéj metanolos kivonattal (BPME) kezelt 0,1 és 0,2 µg/ml térfogatú HUVEC-k normál morfológiát mutattak a simaizomsejtek viselkedésének általános morfológiájához hasonló, proliferáló sejtekkel rendelkező vaszkuláris mikrotubulusokkal.

4. ábra Propidium-jodid (PI) festődési analízis a magmorfológiához vivőanyag-kontrollban, 0,1 és 0,2 µg/mL céklahéj metanolos kivonat (BPME) kezelt normál (3a) és H2O2-indukált oxidatív stressz (3b) HUVEC 48 óra elteltével. A PI-festés során a vivőanyag-kontroll azt mutatta, hogy a sejtmag normálisnak tűnt, zsugorodás, piknózis vagy apoptotikus sejtmag jelei nélkül. Csak H2O2-ban a kezelt sejtek polarizált magmembránt mutattak 48 óra elteltével. A 0,2 µg/mL BPME-vel végzett kezelés normalizálta a H2O2- által kiváltott nukleáris membrán polarizációt, összehasonlítva a 0,1 µg/mL BPME-vel vagy kvercetinnel 10 µM.

Az 5a. ábra a HUVEC-sejtek JC-1 festési eredményeit mutatja, beleértve a kontroll- és BPME-kezelt sejteket; az ábra egészséges sejteket ábrázol aktív mitokondriumokkal, amit az extramitokondriális lipofil kationos JC-1 (zöld szín) és a vörös színnel intramitokon-driálisan átalakult J-aggregátumok negatív töltésű mitokondrium felvétele igazol. Az 5b. ábra a JC-1 festési eredményeket mutatja 0,2 µg/mL BPME-re, amelyet a H2O2 által kiváltott oxidatív stresszt okozó HUVEC-sejtekhez adtak; az eredmények megerősítették, hogy a negatív töltésű mitokondriumok csaknem 94 százaléka a lipofil kationos JC-1-ot (zöld szín) vörös színű J-aggregátumokká alakította, összehasonlítva a 0.1 µg/ml BPME-kezeléssel (61,4 százalék) vagy H2O{{20}}indukált oxidatív stressz a HUVEC-ben (2 százalék). Megfigyelték, hogy a mitokondriális membránpotenciál (MMP) magasabb a BPME-vel kezelt sejtekben, mint a referencia gyógyszer kvercetin. 3.4. FACS-asszisztált mitokondriális membránpotenciál (∆ψm; BD MitoScan) és Annexin V/apoptózis elemzése HUVEC-ekben A 6. ábra mutatja a mitokondriális membránpotenciál kapacitását a BD MitoScan analízisben normál HUVEC-k esetén 0,2 µg/mL BPME-kezelés után és a H2O2 által kiváltott oxidatív stresszes HUVEC-k. Azt találtuk, hogy 0,2 µg/ml BPME-kezelés az MMP-t (∆ψm) 92,7%-ra ± 3,7%-ra növelte, összehasonlítva a csak H2O2-val kezelt HUVEC-kkel (27,9% ± 7,2%). Ezzel szemben a kvercetinnel kezelt sejtek 41,4 ± 1,6 százalékos megnövekedett MMP-t (∆ψm) mutattak a BPME-vel és H2O2-vel vagy csak H2O2-vel kezelt HUVEC-ekhez képest.

5. ábra: A mitokondriális membránpotenciál elemzése JC-1 festéssel a vivőanyag kontrollhoz, 0,1 és 0,2 µg/mL céklahéj metanolos kivonat (BPME) kezelt normál (a) ) és H2O2-indukálta oxidatív stressz (b) HUVECs 48 óra elteltével. JC{{10}}flfluoreszcens képek, amelyek a festék vörös és zöld jeleinek egyesített képeit mutatják, amelyek megfelelnek a JC-1-nak J-aggregátumok és monomer formában. Kevesebb J-aggregátumot találtunk, H2O2 önmagában kezelt HUVEC-et. A 0,2 µg/mL BPME-vel kezelt HUVEC-ben magas j-aggregátumok mutatkoznak, amelyek közvetlenül (magas MMP, ∆ψm) magas mitokondriális membránpotenciálnak felelnek meg 0,1 µg/mL BPME-hez vagy 10 µM kvercetinhez képest.

4. Megbeszélés

Extracelluláris vagy intracelluláris stressz esetén a reaktív oxigénfajták (ROS) biológiai hozzáférhetősége felülmúlja az antioxidáns védelmet, az oxidatív stressz pedig megzavarja a redox jelátvitelt és szabályozást [31]. Az oxidatív stressz kialakulása összefüggésbe hozható a krónikus betegségek, például a neurodegeneratív betegségek, a cukorbetegség és az érelmeszesedés patogeneziseivel. Az oxidatív stressz például az endothel diszfunkcióját idézi elő, és elősegíti a szisztémás gyulladást és a makrofágok felszaporodását [32]. Az aktivált immunsejtek az érrendszerbe vándorolnak, és citokineket és kemokineket szabadítanak fel, amelyek az érszűkülethez és a simaizomsejtek vérereinek átépüléséhez, valamint a vaszkuláris simaizomsejteket és az érfalat érintő gyulladáshoz kapcsolódnak [33]. A megnövekedett vaszkuláris oxidatív stressz érkárosodással, a simaizomsejtek merevségével és szerkezeti elasztin-rendellenességekkel végződik. Ezenkívül a vaszkuláris oxidatív stresszt egyéb kóros állapotok, például zsigeri elhízás vagy érelmeszesedés is stimulálták, a perivaszkuláris zsírszövetben megnövekedett NADPH-oxidáz (NOX-2) aktivitás miatt [34]. A vaszkuláris oxidatív stressz az öregedés során fellépő fő epigenetikai változásokat okozza, és egy korai öregedési folyamattal zárul [35]. A ROS termelés és az oxidatív stressz kialakulása a biológiai rendszerben nagymértékben függ a mitokondriális diszfunkciótól, a NOX-2 mellett az endoteliális xantin-oxidáztól, a nem csatolt eNOS-tól és a lipoxigenáztól [36]. Az étrendi szerek antioxidáns tulajdonságai a megnövekedett antioxidáns kapacitás révén semlegesíthetik a ROS képződést [26]. A Ginkgo Biloba kivonat védelmet nyújt az ateroszklerózis kialakulásával szemben azáltal, hogy csökkenti a ROS képződését és a lipoxigenáz aktivitást az OxiLDL által kiváltott endothel diszfunkcióban [37]. Emellett különféle fenolos vegyületek, illszármazó flavonoidokaz ehető növények és magvak képesek megkötni a ROS-t és a lipidperoxidációt [38]. A céklahéj (Beta vulgaris) metanolos kivonata antioxidáns potenciállal rendelkezik a magas rosttartalom, antocianinok és flavonoidok, például a vitexin és a betanin elérhetősége miatt [39]. Jelen tanulmányban a BPME-t választottuk ki a mitokondriális függő mechanisztikus megközelítés azonosítása érdekében, hogy felfedezzék annak hatását a mitokondriális membránpotenciálra, az LPO kioltására és a vaszkuláris gyulladással kapcsolatos mRNS expressziós szintjeinek gátlására. Az MTT-teszt megerősítette, hogy a BPME szignifikánsan növelte a sejtproliferációt, amit a PI-festés megnövekedett nukleáris integritása is megerősített a BPME effektív dózisával 0,2 µg/mL a tesztelt 0,1 µg/ml-rel szemben. a BPME. Az alacsony koncentrációjú és legnagyobb aktivitású effektív dózis azonosítása fiziológiailag biztonságosnak tekinthető. A JC-1 FL fluoreszcens mikroszkópos festődését találtuk, és a mitokondriális membránpotenciál visszaállt normál és H2O{{10}}indukált, külsőleg stimulált, oxidatív stressznek kitett HUVEC-ben 0,2 µg/mL BPME után. kezelés. A mitokondriális diszfunkció megváltoztatja az oxidatív foszforilációt, amely nem képes az oxigén (O2·−) gyököket H2O2-vé és H2O-vá alakítani a glutation-peroxidáz hatására. Az elégtelen ROS méregtelenítés vagy az ellenőrizetlen ROS termelés miatt a megnövekedett mitokondriális oxidatív stressz összefügg az érelmeszesedéssel [40]. A céklahéj kivonatai hatékonyan helyreállították a mitokondriális membránpotenciált, ami sikeresen növelte a ROS méregtelenítését és a H2O2 termelését. Az Annexin V/PI festési analízis megerősítette, hogy a BPME kezelés fenntartotta az életképes sejtek arányát és fokozta a sejtproliferációs stádiumot mind a normál HUVEC-okban, mind a H2O2 által kiváltott oxidatív stresszben szenvedő HUVEC-ekben. Ebben az összefüggésben Choo et al. [41] megerősítette, hogy az ischaemiás helyen túlzott ROS vagy exogén H2O2 képződése után a transzplantált mesenchymális őssejtek (MSC) ronthatják az önproliferációt és a multi-lineage kapacitást. A regeneratív gyógyászatban a vaszkuláris simaizomsejtek a kontraktilis tónus artériák fő szabályozói az artériás perifériás ellenállás fenntartása, a vérnyomás szabályozók, a véralkotó és az artériák helyreállítása révén [42]. Ezenkívül az EC-k életkor által kiváltott fenotípus-modulációja a sejtösszehúzódás csökkenésével és a sejt öregedésének növekedésével jár. Folyamatos stressz hatására vagy a csökkent mechanoszenzitivitás miatt a mikrokörnyezeti jelek csökkent adaptációját azonosítják az elöregedett simaizomsejtekben [43]. A jelen eredmények megerősítették, hogy a BPME-kezelés fenntartotta az életképes sejtpopulációt, amit az angiogenezis kapacitás is bizonyít. A BPME azonosított proliferációs kapacitását HUVEC-ken az LPO expresszió csökkenése és a megnövekedett antioxidáns génexpresszió támasztja alá. A ROS és az LPO kezdetben a mitokondriális komplexből (I és III) és a NOX-4-ból keletkezik a sejtproliferáció vagy -differenciálódás során [44]. A túlzott ROS reagál és károsítja a biomolekulákat, különösen megváltoztatva a genomiális DNS integritását, ami kritikus a sejtproliferáció és -funkciók szempontjából [45]. Megerősítették azonban, hogy az antioxidáns polifenolok, például az epigallocatechin és a tokoferol étrendi bevitele megvédi a sejteket az oxidatív stressztől és növeli a proliferációs kapacitást [46]. Vizsgálatunkban az LPO mRNS expressziós szintje csökkent, a NOS-3, Nrf-2 és eNOS pedig kétszeresére nőtt a H2O2 által kiváltott oxidatív stresszt okozó HUVEC-ekben. Az eNOS a NOS domináns izoformája, amely a legtöbb NO·-termékért felelős a simaizomsejtekben és az érszövetekben. A NO· tágítja az összes vaszkuláris eret, és védi a vérlemezke-aggregációt és a leukocita adhéziót az EC-kben [47]. Eddig sok egymásnak ellentmondó jelentés született a kardiovaszkuláris kockázati tényezőkről, és az endothel diszfunkciót az eNOS expressziójának csökkenésével vagy megnövekedésével hozták összefüggésbe [48]. Az eNOS fokozott expressziója érbetegség esetén megfigyelhető, ami valószínűleg a túlzott H2O2 termelés következménye. Az O2·−, egy diszmutációs termék, transzkripciós és poszttranszkripciós mechanizmusokon keresztül fokozhatja az eNOS expresszióját [49]. Az érbetegség patogenezisét a NO· felgyorsult lebomlása kíséri az O2·− reakció után, és végül az ONOO− forma, ami az eNOS szétkapcsolásához és a NOX enzim működési zavarához vezet [50]. Az oxidatív stresszt elnyomták az antioxidáns enzimek, és a GSK-3 és a GPX mRNS szintje megemelkedett a BPME kezelés után. A BPME számos biológiailag aktív fitokemikáliát tartalmaz, beleértve a bétalainokat, flavonoidokat, polifenolokat, terápiás enzimeket, aszkorbinsavat, dehidroaszkorbinsavat (DHAA) és szervetlen nitrátot (NO3), és ezek szerepet játszhatnak a HUVEC-k antioxidáns kapacitásának fokozásában. Ebben az összefüggésben Cha és mtsai. (2014) [51] arról számolt be, hogy a klorogénsav hatékonyan véd az oxidatív stressz által kiváltott DNS-károsodástól az emberi keratinocitákban. Az endotelin-1 (Edn-1), egy endothel eredetű érszűkítő, simaizomsejt-migrációt hajt végre, és antiapoptotikus faktorként működik a nitrogén-monoxid által kiváltott stresszben szenvedő sejtekben [52,53]. A vaszkuláris remodelling, a migráció, a proliferáció és az extracelluláris mátrix akkumuláció folyamatait az Edn{60}} és az NO egyaránt stimulálta [54,55]. Megnövekedett Edn-1 expressziót figyeltünk meg BPME-kezelés után oxidatív stresszben szenvedő HUVEC-ben. Oxidatív stressz vagy LPO felhalmozódás esetén a vaszkuláris gyulladás korai stádiuma a leukociták endothel simaizomsejtekhez való adhéziója, amely kiemelt szerepet játszik az ischaemia és az atherosclerosis kritikus eseményeiben [56]. VCAM és ICAM kifejezések közvetítik; számos kemokin és kemotaxis ágens stimulálta, mint például az NF-κB, IL-1 és a TNF-expresszió [57]. Az IL-1 aktivációjának gátlását, majd az adhéziós molekula expresszióját az ellagsav diétás fenolos vegyülettel sikerült elérni [58]. Az oxidatív stresszt okozó, külsőleg stimulált HUVEC-k BPME-vel történő kezelése szignifikánsan csökkentette a vaszkuláris sejtspecifikus proinflammatorikus faktorokat, mint például a VCAM, ICAM, NF-κB, IL-1 és TNF-expressziós szintet. Ebben az összefüggésben Crespo et al. [59] arról számolt be, hogy a kaempferol és a kvercetin gátolta a gyulladást elősegítő géneket, mint például a VCAM, ICAM, NF-κB és IL{78}} expresszióját. Összességében a BPME oxidatív stresszének és érgyulladással összefüggő génexpressziós potenciáljának gátlása kedvezett a vaszkuláris sejtnövekedési faktorok expressziójának, és potenciálisan elősegítette a vaszkuláris sejtek proliferációját és növekedését.

5. Következtetések

A jelen eredmények megerősítik, hogy az antioxidáns gének fokozott expressziója az oxidatív stressz csillapításával járt együtt, segítve a HUVEC proliferáció és angiogenezis károsodásának leküzdését. A hidroxi-metil-furfurolt tartalmazó fekete fokhagyma elnyomja a TNF-indukált monocita sejtek HUVEC-okhoz való adhéziójának gyulladásos hatását, és tovább gátolja a ROS képződést, a VCAM{1}} expressziót és az NF-κB aktivációt [60]. Ezenkívül He és mtsai. [61] megerősítette, hogy a hidroxi-metil-furfurál képes megvédeni az EC-ket a hipoxiától. A cékla héja flavonoidokat, furánt és antioxidáns összetevőket is tartalmaz, például 5-hidroxi-metil-furfurált, metil-piruvátot, furfurált és 2,3-dihidro-3,5- dihidroxi-6-metil-4H-pirán-4-on; ezek a komponensek felelősek a fokozott antioxidáns kapacitásért és a proinflammatorikus vaszkuláris simaizomsejtek adhéziós molekuláinak elnyomásáért. A céklahéjat serkentőként használták az antioxidáns medencékhez, hogy kioltsák a peroxidatív sejtstressz külső ingereit vagy belső patológiás ingereit. Eredményeink bebizonyították, hogy a cékla összetevői hozzájárulnak a metabolikus stressz és a gyulladás csökkentéséhez a HUVEC-kben, ami jótékony hatással lehet az érsejt-proliferációra és az angiogenezisre.

A szerző hozzájárulásai:

Koncepció, LNA-H. és S.-BP; módszertan, LNA-H. és S.-BP; szoftver, GS; validálás, LNA-H. és S.-BP; formális elemzés, S.-BP, AMA-D., AAA (Ali A Alshatwi) és GS; vizsgálat, LNA-H., S.-BP és AMA-D.; források, LNA-H.; adatkezelés, S.-BP és LNA-H.; írás – eredeti tervezet előkészítés, LNA-H. és S.-BP; írás – áttekintés és szerkesztés, LNA-H., AMS, GS és AAA (Amna Abdullah Alotiby); vizualizáció, S.-BPand AAA (Ali A Alshatwi); felügyelet, LNA-H. és S.-BP; projekt adminisztráció, LNA-H.; finanszírozás megszerzése, LNA-H. Minden szerző elolvasta és elfogadta a kézirat közzétett változatát. Finanszírozás: A szerzők nagyra értékelik a King Saud Egyetem Tudományos Kutatási Dékánságát, amiért ezt a munkát az RG-1442-432 számú kutatócsoporton keresztül finanszírozták. Az intézményi felülvizsgálati bizottság nyilatkozata: nem alkalmazható. Tájékoztatott hozzájárulási nyilatkozat: Nem alkalmazható. Nyilatkozat az adatok elérhetőségéről : Az ebben a tanulmányban bemutatott adatok a megfelelő szerző kérésére hozzáférhetők. Érdekellentét: Ebben a tanulmányban nincs összeférhetetlenség.

Hivatkozások

1. Abdolmaleki, Z.; Arab, H.-A.; Amanpour, S.; Muhammadnejad, S. Az Artemisia sieberi etanolos kivonatának antiangiogén hatásai hatóanyagához, az artemisininhez képest. Rev. Bras. Farmacogn. 2016, 26, 326–333. [CrossRef]
2. Yoo, SY; Kwon, SM Angiogenesis és terápiás lehetőségei. Mediat. Inflflamm. 2013, 2013, 127170. [CrossRef] [PubMed]
3. Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid és egyéb betegségek. Nat. Med. 1995, 1, 27–31. [CrossRef]
4. Hoeben, A.; Landuyt, B.; Highley, MS; Wildiers, H.; Van Oosterom, AT; De Bruijn, EA Vaszkuláris endoteliális növekedési faktor és angiogenezis. Pharmacol. Rev. 2004, 56, 549–580. [CrossRef]
5. Ferrara, N.; Alitalo, K. Az angiogén növekedési faktorok és inhibitoraik klinikai alkalmazásai. Nat. Med. 1999, 5, 1359–1364. [CrossRef]
6. Gálya, HF; Webster, NR Az endotél fiziológiája. Br. J. Anaesth. 2004, 93, 105–113. [CrossRef]
7. Onat, D.; Brillon, D.; Colombo, PC; Schmidt, AM Humán vaszkuláris endothelsejtek: Modellrendszer az érgyulladások tanulmányozására cukorbetegségben és érelmeszesedésben. Curr. Diabetes Rep. 2011, 11, 193–202. [CrossRef] [PubMed]
8. Packard, RR; Libby, P. Inflammation in atherosclerosis: Az érbiológiától a biomarkerek felfedezéséig és a kockázat előrejelzéséig. Clin. Chem. 2008, 54, 24–38. [CrossRef]
9. Esper, RJ; Nordby, RA; Vilariño, JO; Paragano, A.; Cacharrón, JL; Machado, RA Endotheliális diszfunkció: átfogó értékelés. Cardiovasc. Diabetol. 2006, 5, 4. [CrossRef]
10. Baudin, B.; Bruneel, A.; Bosselut, N.; Vaubourdolle, M. A protokoll humán köldökvéna endothelsejtek izolálására és tenyésztésére. Nat. Protoc. 2007, 2, 481–485. [CrossRef] [PubMed]
11. Cao, Y.; Cao, R. Az angiogenezist gátolja a teaivás. Nature 1999, 398, 381. [CrossRef] [PubMed]
12. Yen, G.-C.; Duh, P.-D.; Tsai, H.-L. Az aszkorbinsav és a galluszsav antioxidáns és prooxidáns tulajdonságai. Food Chem. 2002, 79, 307–313. [CrossRef]
13. Dhalaria, R.; Verma, R.; Kumar, D.; Puri, S.; Tapwal, A.; Kumar, V.; Nepovimova, E.; Kuca, K. Ehető gyümölcsök bioaktív vegyületei öregedésgátló tulajdonságaikkal: Átfogó áttekintés az emberi élet meghosszabbításáról. Antioxidants 2020, 9, 1123. [CrossRef] [PubMed]
14. Baião, DdS; da Silva, D.; Del Aguila, EM; Paschoalin, VMF Különböző céklakészítmények táplálkozási, bioaktív és fizikai-kémiai jellemzői. Élelmiszerfüggő. 2017, 6. [CrossRef]
15. Lalonde, R.; Roitberg, B. A fák párzási viselkedésének alakulásáról: Ragadozás vagy időjárás? Am. Nat. 1992, 139, 6. [CrossRef]
16. Silva, D.; Baiao, DDS; Ferreira, VF; Paschoalin, VMF Betanin, mint többutas oxidatív stressz és gyulladás modulátor: Cékla pigment, amely védő hatással van a szív- és érrendszeri betegségek patogenezisére. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2020, 1–16. [CrossRef]
17. Baiao, DDS; Silva, D.; Paschoalin, VMF Figyelemreméltó zöldség: Nitrát- és fitokemikális tartalma új készítményekben módosítható az egészség megőrzése és a szív- és érrendszeri betegségek kezelésének támogatása érdekében. Antioxidants 2020, 9, 960. [CrossRef] 18. Abd El-Ghaffar, EA; Hegazi, NM; Saad, HH; Soliman, MM; El-Raey, MA; Shehata, SM; Barakat, A.; Yasir, A.; Sobeh, M. A répa (Beta vulgaris) leveleinek HPLC-ESI-MS/MS analízise és jótékony tulajdonságai 1-es típusú cukorbeteg patkányokban. Biomed. Pharmacother. 2019, 120, 109541. [CrossRef]
19. Singh, B.; Nathan, BS A cékla kémiai összetétele, funkcionális tulajdonságai és feldolgozása – áttekintés. Int. J. Sci. Eng. Res. 2014, 5, 679.
20. Ninfali, P.; Angelino, D. A Beta vulgaris cicla és rubra táplálkozási és funkcionális potenciálja. Fitoterápia 2013, 89, 188–199. [CrossRef]