A természetes polifenol antioxidánsok fotoreaktivitásának és fototoxicitásának in vitro értékelése

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtöbbet tudni.

Absztrakt:A polifenolok a kozmetikai termékekben széles körben használt természetes vegyületek nagy családját alkotják, antioxidáns és gyulladáscsökkentő jótékony tulajdonságaik, valamint az UV-sugárzás által kiváltott oxidatív stressz megelőzésére való képességük miatt. Mivel ezek a vegyületek kromoforokat tartalmaznak, és közvetlenül a bőrre kerülnek, reagálhatnak a napfénnyel és fototoxikus hatást fejthetnek ki. Ezeknek a természetes vegyületeknek a fototoxikus potenciáljáról kevés rendelkezésre álló tudományos információ áll rendelkezésre, ezért a tanulmány célja öt fenolsav fotoreaktivitásának és fototoxicitásának értékelése volt.antioxidánsokkozmetikai termékekben való dokumentált felhasználással. Standard ROS-tesztet validáltunk és alkalmaztunk a természetes fenolos antioxidánsok, a kávésav, a ferulinsav, a p-kumársav, a 3,4-dihidroxi-fenil-ecetsav (DOPAC) és a rutin fotoreaktivitásának szűrésére. A fototoxicitási potenciált humán keratinocita sejtvonal (HaCaT) segítségével határoztuk meg, a 3T3 Neutral Red Uptake fototoxicitási teszt alapján. Bár mindfenolos antioxidánsokat tanulmányoztaelnyelt UV/Vis sugárzás 290-700 nm tartományban, csak a DOPAC volt képes szingulett oxigén előállítására. A reaktív oxigénfajták képződése a fototoxicitási mechanizmus részeként egy korai stádiumú kémiai reakció. Ennek ellenére egyik vizsgált vegyület sem csökkentette a keratinociták életképességét besugárzás után, ami arra a következtetésre vezetett, hogy nincs fototoxikus potenciáljuk. Az ezzel a munkával kapott adatok azt sugallják, hogy ezek a vegyületek biztonságosak, ha kozmetikai termékekbe építik be.

Kulcsszavak:fényképes biztonság; fotoreaktivitás; fototoxicitás; polifenolok;természetes fenolos antioxidánsok; reaktív oxigén fajok; keratinociták; bőrápolás; kozmetikai termékek

További információért kattintson ide

Bevezetés 

A polifenolok (PP-k) a természetes termékek egyik legnagyobb számú és legszélesebb körben elterjedt csoportját alkotják a növényvilágban. A PP-k kémiai szerkezetét egy vagy több fenolos hidroxilcsoport jelenléte jellemzi, amelyek egy vagy több benzolgyűrűrendszerhez kötődnek [1]. A polifenolok számos előnyös biológiai hatást fejtenek ki az emberben, beleértve a vírusellenes, antibakteriális, antikarcinogén, májvédő, gyulladáscsökkentő és antioxidáns hatást [2–5].Antioxidánsként, a polifenolok megvédhetik a sejtösszetevőket a reaktív oxigénfajták (ROS) oxidatív károsító hatásaitól, mint például a szingulett oxigén-, szuperoxid- és hidroxilgyökök, csökkentve az oxidatív stresszel összefüggő számos betegség kockázatát [6,7]. Kémiai tulajdonságaiknak köszönhetően a PP-k képesek megkötni a ROS-t és kelátot képeznek az átmenetifém-ionok, például a vas és a réz ionjairól, ami felkeltette a kozmetikai ipar érdeklődését a bőrápoló készítményekben való felhasználásuk miatt [8–10]. Az ultraibolya (UV) expozíció a bőrrák egyik fő tényezője, és a bőrsejteket közvetlenül az UV-sugárzás, vagy közvetve az UV-közvetített ROS-túltermelés károsíthatja [11]. Kísérleti és epidemiológiai vizsgálatok azt sugallták, hogy a polifenolok többféle úton védik a bőrt az UV-sugárzás káros hatásaitól [12]. Ezért számos ebbe a családba tartozó vegyületet már számos kereskedelmi forgalomban kapható kozmetikai termék összetevőjeként használnak [13]. A natúrkozmetikumok iránti megnövekedett fogyasztói igények arra késztették az ipart, hogy olyan készítményeket fejlesszenek ki, amelyek természetes kivonatokat tartalmaznak aktív összetevőkkel, például polifenolokkal, amelyek ígéretes és hatékony megoldást jelentenek a bőrápolásban [13]. A polifenolok szerkezetében jelenlévő kromoforok azonban képesek elnyelni az UV/Vis sugárzást, és olyan kémiai reakciókon mennek keresztül, amelyek sorozatos eseményeket eredményeznek, amelyek fototoxikus reakciókat eredményezhetnek [14]. A fototoxicitás olyan toxikus válasz, amelyet helyileg vagy szisztémásan alkalmazott fotoreaktív vegyszerek váltanak ki, miután a testet környezeti fénynek teszik ki [15]. A szisztémás beadásra szánt hatóanyagok és segédanyagok, helyi alkalmazásra szánt klinikai készítmények, bőrtapaszok és mások fototoxikus potenciállal rendelkeznek, és jelentős fototoxikus reakciókat okozhatnak. Következésképpen a szabályozó ügynökségek, az Egyesült Államok FDA, az EU EMA és az ICH fotóbiztonsági irányelveket adnak, amelyek vizsgálati módszereket és értékelési stratégiákat vezetnek be [15–17]. A kozmetikai termékek biztonsági értékelése az Európai Unió jogszabályai szerint kötelező [18]. Az előírt biztonsági értékelés magában foglalja a kozmetikai összetevőkre vonatkozó releváns toxikológiai vizsgálatokat, beleértve a fény által kiváltott toxicitás értékelését [18]. Mióta a kozmetikai termékek állatkísérleteit betiltották, az elmúlt években számos in vitro fotóbiztonsági tesztet javasoltak, beleértve az UV-spektrum-analízist, a 3T3 Neutral Red Uptake fototoxicitási tesztet (3T3 NRU PT) és egy reaktív oxigénfajtát. ROS) vizsgálat [18–20]. A ROS assay-t gyógyszerek fotoreaktivitásának értékelésére tervezték, melynek alapelve a fotokémiai reakciók nyomon követése a szimulált napfénynek kitett vizsgált vegyi anyagokban [19,20]. Ezekkel a fotokémiai reakciókkal ROS, például szuperoxid-anion és szingulett oxigén képződhet, és ezek a fotokémiai folyamatok kiválthatják a gyógyszer okozta fototoxicitást [19,20]. A magas szintű ROS citotoxicitást okozhat a DNS, a lipidek és a fehérjék oxidatív stressz általi károsodása révén.https://www.voachinese.com/a/us-lawmakers-united-condemn-russias-ukraine-invasion-20220224/6458599.htmlA 3T3 NRU-PT in vitro módszertan a Balb/c 3T3 egér fibroblaszt sejtvonalat és a neutrális vörös felvételt használja a citotoxicitás végpontjaként. A fototoxicitást ezután a vizsgált vegyi anyagnak kitett sejtek életképességének relatív csökkenése alapján határozzák meg a napfényt szimuláló fény jelenlétében és távollétében. Az irodalomban közölt tanulmányok arra a következtetésre jutottak, hogy ez a teszt túlérzékeny, tévesen előrejelzi az állatok és az emberek fényképezésének biztonságát, ami nagyszámú téves pozitív eredményhez vezet az in vivo eredményekhez képest [21–23]. Ezt a korlátot figyelembe véve csoportunk a 3T3 NRU-PT módszertan módosítását javasolta humán keratinocita sejtvonal (HaCaT) felhasználása alapján [24]. Mivel ez a módszer humán keratinocita sejteket használ, valósághűbb modellt képvisel, mivel ezek a legelterjedtebb sejttípusok a bőr külső rétegében, ahol helyileg alkalmazható vegyületeket alkalmaznak és napfénysugárzásnak tesznek ki [24]. Jelen tanulmány célja a természetes polifenolok, a p-kumársav, a kávésav, a 3,4-dihidroxi-fenil-ecetsav (DOPAC), a ferulsav és a rutin fotoindukált toxicitási potenciáljának becslése volt (1. ábra). amelyeket már kozmetikai összetevőként használnak, vagy érdekes kémiai és antioxidáns tulajdonságaik miatt fontolgatják [25–27]. Egy ROS vizsgálatot validáltunk és alkalmaztunk a vegyületek feltáró fotóbiztonsági értékelésére, valamint citotoxicitásukat és fototoxicitásukat tovább értékeltük humán keratinocita sejtvonal (HaCaT) segítségével.

2. Eredmények és megbeszélés 

A fotoreaktív potenciál értékelésének kezdeti szempontja az, hogy egy vegyület elnyeli-e a fotonokat 290 és 700 nm közötti bármely hullámhosszon. Az olyan vegyület, amelynek moláris extinkciós együtthatója (MEC) nagyobb, mint 1000 L mol-1 cm-1 bármely 290 és 700 nm közötti hullámhosszon, kellően fotoreaktívnak tekinthető ahhoz, hogy közvetlen fototoxicitást okozzon [15]. A kávésav, p-kumársav és ferulasav, DOPAC és rutin abszorpciós spektruma DMSO-ban UV-látható fényben a 2. ábrán látható. Az összes vegyület a 200-700 nm spektrumtartományban abszorbeál, maximális hullámhossza pedig ill. 290 nm feletti és MEC-értéke jellemzően nagyobb, mint 4000 L mol−1 cm−1 (1. táblázat). A polifenolok olyan biológiai vegyületek, amelyek π konjugált rendszereket tartalmaznak fenolos hidroxilcsoportokkal. A π típusú molekulapályák elektronátmenetei felelősek ennek a vegyületcsoportnak az UV-sugárzással látható spektrumáért [28]

Valamennyi vizsgált vegyület MEC-értéke magasabb, mint 1000 L mol−1 cm−1, ami azt jelenti, hogy mindegyik lehetséges fototoxikus vegyület, amelyet érdemes tanulmányozni [15]. A ROS vizsgálat elvégzése előtt a szoláris szimulátort kiértékelték, és a kísérleti körülményeket úgy optimalizálták, hogy a szingulett oxigén (SO) és szuperoxid anion (SA) mért értékei közel álljanak az irodalomban említettekhez [29]. A ROS generációs vizsgálat optimalizálását pozitív és negatív kontrollok segítségével végezték el, és megvalósíthatósági tanulmányt végeztek referencia vegyszerek felhasználásával. Az alkalmazott kísérleti körülmények között a megvalósíthatósági tanulmányban vizsgált összes anyag megfelelt az elfogadási kritériumoknak, amelyek a megengedett tartományon belüli SO és SA értékeket adtak [29].

A ROS vizsgálatot a polifenolos vegyületekre végeztük, és a vizsgált anyagok ROS-képző képességét 200 µM koncentrációnál a 2. táblázat mutatja. 2. táblázat. Az eredményeket a vizsgált vegyületekre a ROS vizsgálattal kaptuk.

A kapott eredmények azt mutatják, hogy a DOPAC kivételével minden vegyület nem fotoreaktívnak minősíthető. Bár ezek az anyagok UV-látható fényelnyelést és 1000 L mol−1 cm−1-nél nagyobb MEC-t mutattak, a vizsgált körülmények között nem termeltek ROS-t, sem SO, sem SA fajokat. Meglepő módon a DOPAC képes volt SO-fajták képződését indukálni, és ezért fotoreaktívnak minősítették, annak ellenére, hogy ennek a vegyületnek a legalacsonyabb MEC-értéke volt az UV-látható tartományban az összes vizsgált vegyület közül. További vizsgálatokra van szükség a DOPAC-ra kapott eredmények megértéséhez, amelyek szintén fontosak lehetnek a közeljövőben, hogy összefüggést állapítsanak meg egy vegyület kémiai szerkezete és fotoreaktív képessége között. A fototoxikus hatások értékelésére használt DMSO citotoxicitását, besugárzás jelenlétében és hiányában, 1 órás expozíció után értékeltük. A nem besugárzott lemez esetében a DMSO nem mutatott statisztikailag szignifikáns különbséget a negatív kontrollokhoz képest. A besugárzott lemez esetében azonban szignifikáns különbség volt az 1 százalékos DMSO és az oldószeres kontroll között a negatív kontrollokhoz képest (p < 0,0001),="" ami="" indokolta="" az="" oldószeres="" kontroll="" használatát="" minden="" kísérletben,="" hogy="" garantálni="" lehessen="" a="" sejtek="" életképességében="" mutatkozó="" különbségeket.="" csak="" a="" vizsgált="" vegyületeknek="" tulajdonították.="" a="" humán="" keratinocita="" sejtvonalat="" (hacat)="" használó="" fototoxicitási="" vizsgálat="" megvalósíthatóságának="" biztosítása="" érdekében="" pozitív="" kontrollként="" 5-metoxi-psoralént,="" klórpromazin-hidrokloridot="" és="" kinint,="" negatív="" kontrollként="" pedig="" acetilszalicilsavat,="" hexaklorofént="" és="" nátrium-lauril-szulfátot="" teszteltünk.="" [24].="" a="" besugárzott="" és="" nem="" besugárzott="" hacat="" sejtek="" sejtéletképességét="" a="" vizsgált="" (poli)fenolos="" vegyületek="" jelenlétében="" összehasonlító="" fototoxicitási="" vizsgálat="" eredményeit="" a="" 3.="" ábra="" mutatja="" be.="" az="" (irr="" plus="" )="" és="" a="" fény="" hiányát="" (irr−)="" dózistartomány-kereső="" kísérletekkel="" határoztuk="" meg,="" figyelembe="" véve="" az="" 1000="" µm="" maximális="" koncentrációt.="" geometrikus="" hígítási="" sorozatot="" használtunk,="" és="" szükség="" esetén="" beállítottuk="" a="" koncentráció-válasz="" függvényében="" besugárzás="" jelenlétében="" és="" hiányában.="" a="" vizsgált="" koncentrációtartományon="" belül="" (12,5;="" 31,25;="" 62,5;="" 125;="" 250;="" 500="" és="" 1000="" µm)="" egyik="" vizsgált="" anyag="" sem="" okozott="" 50="" százalékos="" csökkenést="" a="" sejtek="" életképességében,="" ezért="" nem="" lehetett="" kiszámítani="" a="" megfelelő="" ic50="" és="" pif="" értékeket.="" .="" éppen="" ellenkezőleg,="" a="" besugárzott="" sejtek="" életképességének="" dózisfüggő="" növekedését="" lehetett="" észlelni="" a="" vizsgált="" anyagok="" jelenlétében,="" valószínűleg="" ezen="" antioxidánsok="" fényvédő="" hatásának="" köszönhetően="" a="" sugárzás="" által="" kiváltott="" oxidatív="" károsodással="" szemben,="" ami="" magasabb="" százalékos="" arányt="" eredményez.="" az="" életképes="" sejtek="" száma="" a="" kontrollhoz="" (kezeletlen="" besugárzott="" sejtek)="" képest.="" a="" szakirodalomban="" leírták,="" hogy="" az="" uv-sugárzás="" ros-képződéshez,="" a="" nitrogén-monoxid="" túltermeléséhez="" és="" a="" keratinociták="" antioxidáns="" védekezésének="" kimerüléséhez="" vezet="" [30].="" ezen="" okok="" miatt="" az="" antioxidáns="" hatású="" polifenolokat="" fényvédő="" szerként="" tanulmányozták.="" bár="" a="" legtöbb="" tanulmány="" a="" polifenolok="" fényvédő="" képességére="" összpontosított,="" nem="" vizsgálták="" fototoxikus="" potenciáljukat.="" korábbi="" vizsgálatok="" megerősítették="" a="" kávé-,="" ferulin-="" és="" p-kumársav="" azon="" képességét,="" hogy="" megkötik="" a="" ros-t="" és="" a="" reaktív="" nitrogénfajtákat="" (rns).="" ezen="" túlmenően="" e="" három="" fenolos="" vegyület="" esetében="" az="" uv-sugárzás="" káros="" hatásaival="" szembeni="" védelmet="" is="" létrehozták="" in="" vivo="" vagy="" a="" bőrsejtekben="" [31–34].="" ezek="" az="" adatok="" magyarázatot="" adhatnak="" az="" életképes="" sejtek="" százalékos="" arányának="" növekedésére,="" ha="" a="" vizsgált="" vegyületek="" jelenlétében="" besugárzásnak="" vannak="" kitéve.="" a="" rutin="" a="" kávésavhoz,="" a="" ferulsavhoz="" és="" a="" p-kumársavhoz="" hasonlóan="" negatívnak="" bizonyult="" a="" ros="" generációs="" tesztben,="" és="" nem="" indukált="" fototoxicitást="" a="" hacat="" sejtvonalban.="" a="" szakirodalomban="" ellentmondásos="" információk="" találhatók="" a="" rutin="" fototoxikus="" potenciáljával="" kapcsolatban,="" ezért="" a="" kapott="" eredmények="" érdekesek.="" a="" fototoxikus="" potenciál="" keratinocita="" sejtrendszerrel="" (hacat)="" végzett="" értékelése="" azt="" mutatta,="" hogy="" a="" rutin="" fototoxicitást="" mutat="" [35].="" éppen="" ellenkezőleg,="" egy="" olyan="" kísérleti="" elrendezést="" használva,="" amely="" elektrokémiai="" és="" uv-detektálást="" alkalmazó="" kapilláris="" elektroforézist="" alkalmaz="" a="" növényi="" kivonatok="" és="" komponensek="" fototoxicitásának="" tesztelésére="" az="" oxigénfogyasztás="" és="" a="" látható="" fénnyel="" történő="" besugárzás="" hatására="" reaktív="" oxigénfajták="" képződése="" tekintetében,="" arra="" a="" következtetésre="" jutottunk,="" hogy="" a="" rutin="" nem="" fototoxikus="" [36],="" ami="" egybevágott="" az="" ebben="" a="" munkában="" kapott="" eredményekkel,="" ahol="" a="" rutin="" nem="" mutatott="" fotoreaktivitást,="" mivel="" sem="" so-t,="" sem="" sa-t="" nem="" termelt="" a="" ros="" generációs="" vizsgálatban.="" másrészt="" ebben="" a="" munkában="" azt="" is="" kimutattuk,="" hogy="" a="" rutin="" önmagában="" nem="" mutat="" fototoxikus="" potenciált="" a="" hacat="" sejtvonalban.="" ezek="" az="" egymásnak="" ellentmondó="" eredmények="" rávilágítanak="" a="" szabványos="" vizsgálati="" feltételek="" alkalmazásának="" fontosságára,="" valamint="" a="" megfelelő="" fényforrás="" használatára="" a="" félrevezető="" eredmények="" elkerülése="" érdekében.="" érdekes="" módon,="" és="" a="" dopac="" és="" a="" többi="" vizsgált="" pp="" közötti="" szerkezeti="" hasonlóság="" ellenére="" a="" dopac="" so-t="" generált="" a="" ros="" generációs="" vizsgálatban,="" és="" fotoreaktívnak="" minősítették.="" a="" hacat="" sejtvonalon="" végzett="" tesztelés="" során="" azonban="" a="" dopac="" nem="" fototoxikusnak="" bizonyult.="" a="" kapott="" eredmények="" alapján="" a="" dopac="" fotoreaktívnak="" tűnik,="" de="" nem="" fototoxikus,="" ezért="" nem="" várható,="" hogy="" fototoxikus="" reakciók="" lépnek="" fel="" a="" vegyület="" helyi="" alkalmazása="">

3. Anyagok és módszerek

3.1. Reagensek

3,4-Dihidroxi-fenil-ecetsav (DOPAC), kávésav, transzferulinsav, p-kumársav, rutin, klórpromazin-hidroklorid, dinátrium-hidrogén-foszfát-dodekahidrát, nátrium-foszfát-monohidrát, semleges vörös (NR) és dimetil-szulfoxid (DMSO) a Sigma–Aldrich-től (Madrid, Spanyolország) vásároltuk. A kinin-hidrokloridot, benzokaint, diklofenakot és eritromicint az Acofarmától (Madrid, Spanyolország) vásároltuk. Az immortalizált humán keratinocita (HaCaT) sejtvonalat a Cell Lines Service (CLS) (Eppelheim, Németország) cégtől szereztük be. Dulbecco módosított Eagle táptalaj (DMEM) 4,5 g/l D-glükózzal, L-glutamint, 25 mM HEPES-t és DMEM 4,5 g/l D-glükózt, L-glutamint, 25 mM HEPES-t fenolvörös nélkül, Dulbecco pufferolt foszfátot (DPBS), Fetal Bovine Serum (FBS) és tripszin EDTA a Gibco Life Technologies-tól (Waltham, MA, USA) vásároltuk. Az etanolt az Aga (Lisszabon, Portugália) szállította. Az N,N-dimetil-4-nitroguanidint (RNO), az imidazolt és a Nitro Blue Tetrazoliumot (NBT) az Alfa Aesartól (Kandel, Németország) vásároltuk.

3.2. Spektrális abszorpció 

Az egyes vizsgált vegyületek abszorpciós spektrumát 290-700 nm tartományban határozták meg az OECD 101. vizsgálati útmutatója szerint, Jasco V650 UV/VIS spektrofotométerrel [37]. Az anyagokat DMSO-ban oldottuk fel, hogy 10 µg/ml végső koncentrációt kapjunk, és az abszorpciós spektrumokat UV átlátszó kvarcküvetták segítségével mérjük (úthossz=10 mm). Mindegyik spektrumot az oldószer-specifikus kiindulási abszorpcióra korrigáltuk. A moláris extinkciós koefficienseket (MEC) a 290-700 nm-es legmagasabb abszorpciós csúcsok felhasználásával számítottuk ki [15].

3.3. Reaktív oxigénfajták (ROS) vizsgálata 

Létrehozták a ROS vizsgálati protokollt, és a validációs vizsgálatokat a szakirodalomban leírt eljárás szerint végezték [19,29]. Az összes vizsgált anyag törzsoldatait 10 mM koncentrációban DMSO-ban készítettük, és még aznap felhasználtuk, fénytől védve. Röviden, a szingulett oxigén (SO) képződését a p-nitrozo-dimetil-anilin (RNO) fehérítés spektrofotometriás mérésével detektáltuk 440 nm-en, imidazolt alkalmazva a szingulett oxigén szelektív akceptorjaként. A vizsgált vegyszert (200 µM), RNO-t (50 µM) és imidazolt (50 µM) 20 mM nátrium-foszfát pufferben (PB, pH 7,4) tartalmazó mintákat egy csőbe helyeztük, vortex keverővel összekevertük és ultrahanggal kezeltük. fénytől védve, 10 percig. A keveréket Hellma kvarcüveg nagy teljesítményű cellába vittük át, és mikroszkóp alatt ellenőriztük a csapadékot, mielőtt fényt vetnénk rá. Ezután a mintákat Fitoclima S600PL termosztatikus szoláris szimulátorral (Aralab, Portugália) sugároztuk be, amely nyolc Repti Glo (20 W) UV-Vis lámpával volt felszerelve, 90 percig 25 ◦C-on. Besugárzás után az abszorbanciát ismét leolvastuk 440 nm-en. A szuperoxid anion (SA) képződését a nitrokék tetrazólium (NBT) monoformazanná (NBT plusz) való redukciójának megfigyelésével detektáltuk, amelynek képződése spektrofotometriásan követhető 560 nm-en. A vizsgált vegyületeket (200 µM) és NBT-t (50 µM) 20 mM NaPB-ben tartalmazó mintákat besugároztuk, és az NBT csökkenését az 560 nm-es abszorbancia növekedésével mértük, ugyanúgy, mint a SO-meghatározásnál. A kísérleteket három párhuzamosban végeztük. Mivel az alkalmazott szoláris szimulátor eltér az ajánlott modellektől, szükséges volt a besugárzási feltételek validálása. ROS vizsgálatot végeztek annak biztosítására, hogy a besugárzási feltételek megfeleljenek az ajánlott kritériumoknak, pozitív (kinin) és negatív kontrollok (szulisobenzon) és referencia kémiai vegyületek alkalmazásával [29]. A ROS-teszt eredménye (háromszori meghatározások átlaga) szerint a vizsgált polifenolos vegyületeket fotoreaktív anyagoknak minősítették, ha 25-ös vagy nagyobb SO-értéket és/vagy 20-as vagy nagyobb SA-értéket mértek; viszont nem fotoreaktív anyagként határozták meg, amikor a SO-ra 25-nél kisebb, az SA-ra pedig 20-nál kisebb értékeket jegyeztek fel [29].

3.4. Sejtkultúra 

A HaCaT sejteket 37 ◦C-on, 95 százalék levegőt és 5 százalék CO2-t tartalmazó párásított atmoszférában tartottuk DMEM-ben, 10 százalék FBS-sel és 1 százalék antibiotikummal. Fordított mikroszkóp segítségével sejtösszefolyást figyeltek meg, és ha a sejtek elérték a 70–80 százalékos összefolyást, szubkultúrát végeztek a sejthalál megelőzése érdekében. Ebből a célból a táptalajt leszívtuk, a sejteket DPBS-sel mostuk, 2 ml 0,25%-os tripszint adtunk hozzá, és 7-8 percig inkubáltuk 37 °C-on 5 százalékos CO2-atmoszférában. A sejtek leválása után friss tápközeget adtunk a tripszin hatásának blokkolására. A sejtszámláláshoz 10 µl sejtszuszpenziót helyeztünk egy Neubauer-kamrába, ahol megszámoltuk a sejteket. A kapott sejtszuszpenziót ezután új lombikokba osztottuk friss sejttenyésztő tápközeggel. A sejtek fagyasztásához DMSO-t (5% v/v) használtunk krio-tartósítószerként, hogy megakadályozzuk a kristályok képződését a tárolási fázis során. A sejtek megkettőződéséhez szükséges idő meghatározásához 1 × 106 sejtet oltottunk be öt 75 cm2-es lombikba, és 24 órán át 37 °C-on inkubáltuk 5 százalékos CO2 atmoszférában, hogy elérjük a teljes tapadást. Ezután az egyes lombik sejtjeit különböző időpontokban megszámoltuk. Az eredményeket a sejtszámot az idő függvényében ábrázoló grafikonon ábrázoltuk, amelyből lineáris regressziós analízissel kiszámítottuk a megduplázódási időt. A számított duplázódási idő 20,43 óra volt, ami összhangban van az irodalomban közölt értékekkel, így megerősíti, hogy a felhasznált sejtek normál növekedési körülmények között voltak [38]. 3.5. Fototoxicitási vizsgálat A fototoxicitás vizsgálatához egy korábbi, laboratóriumunkban alkalmazott protokollt követtünk [24]. Az UVA/UVB Osram lámpa (240V E27) magasságát úgy állítottuk be, hogy a sejteket 1,7 mW/cm2 UVA-dózissal sugározzák be (Cosmedico radiométer, UVM-7), az OECD irányelvei szerint [23]. . A besugárzás során (10 perc) a lemezeket hungarocell recipiensben tartottuk, amely vízhűtő rendszert tartalmazott, és a hőmérsékletet az eljárás során folyamatosan figyeltük. Röviden, az NR felvételi vizsgálat elvégzéséhez HaCaT sejteket oltottunk be (2 × 104 sejt/lyuk), és 37 °C-on inkubáltuk 5 százalékos CO2 atmoszférában 24 órán át. Ezt követően a táptalajt eltávolítottuk, a vizsgálandó anyagok különböző koncentrációit adtuk hozzá, és a sejteket azonos körülmények között 1 órán át inkubáltuk. Az egyik lemezt sötétben tartottuk, míg a másik lemezt 10 percig sugároztuk 29-32 ◦C hőmérsékleten. Ezt követően a sejtközeget friss, fenolvörös nélküli DMEM-re cseréltük, és 18–22 órán keresztül inkubáltuk. Ezen inkubációs periódus után mindkét lemez sejtjeit DPBS-sel mostuk, és 50 µg/ml NR-t tartalmazó komplett DMEM-et adtunk mindegyik lyukba, és 3 órán át inkubáltuk. Az NR-vel végzett inkubálás után az NR-oldatot eltávolítottuk, és NR-deszorb-oldatot (50% etanol:1% ecetsav:49% desztillált víz) adtunk hozzá, hogy az NR-festéket a sejtekből extraháljuk. A leolvasási eljáráshoz az abszorbanciát 540 nm-en mértük. Mindegyik lemezen DMSO kontrollokat teszteltünk. Az egyes lemezekről kapott sejtek életképességi adatait a kezelt sejtek és az oldószeres kontrollsejtek abszorbancia arányaként fejeztük ki, majd felhasználtuk az IC50 értékek lineáris regressziós analízissel történő becslésére. A Photo-Irritation-Factor (PIF) értékét minden egyes vizsgált anyagra a besugárzott (Irr plusz) IC50-értéke és a nem besugárzott (Irr-) sejtek IC50-értéke közötti arányként számítottuk ki. Az OECD irányelve szerint a 2-nél alacsonyabb PIF index a fototoxikus hatás hiányát, a 2 és 5 közötti PIF index valószínűsíthető fototoxikus hatást, az 5-nél nagyobb PIF pedig a fototoxikus hatást [23]. A vizsgált vegyületeket a következő koncentráció-tartományban értékeltük ki: 12,5; 31,25; 62,5; 125; 250; 500 és 1000 µM. 3.6. Statisztikai analízis Az összes adatot átlag ± standard deviáció (SD) formájában adjuk meg legalább három független kísérletből, három párhuzamosban futtatva. A variancia normalitásának és homogenitásának igazolására D'Agostino–Pearson omnibus normalitástesztet, majd az egyutas varianciaanalízist (ANOVA), majd Dunnett post hoc tesztjét alkalmaztuk (összehasonlítás az oldószeres negatív kontrollsejtekkel). elő lett adva. A grafikonok a GraphPadPrism for Windows szoftverrel (6.0-s verzió, GraphPad Software, Inc. (San Diego, CA, USA)) készültek.

4. Konklúziók

Ebben a vizsgálatban egy Reactive Oxygen Species (ROS) assay-t és egy 3T3 Neutral Red Uptake Phototoxicity assay-t (3T3 NRU-PT) alkalmaztak a természetes fenolos antioxidánsok viselkedésének vizsgálatára a napfényt utánzó sugárzás hatására, hogy megvizsgálják fotoreaktivitásukat és fototoxicitásukat. lehetséges. A kapott eredmények alapján arra a következtetésre jutottak, hogy bár a rutin és a kávésav, a p-kumársav és a ferulinsav elnyeli az UV-látható fénysugárzást, és 1000 L mol-1cm-1-nél nagyobb MEC-értéket mutatnak, nem fotoreaktívnak minősülnek. Ezen túlmenően ezek a vegyületek nem okoztak fototoxicitást a HaCaT sejtvonallal történő tesztelés során. A talált adatok arra utalnakezek az antioxidánsokönmagukban várhatóan nem okoznak fototoxicitást, ezért kozmetikai készítményekben való felhasználásuk biztonságosnak tekinthető. Másrészt megfigyelhető volt a sugárzásnak kitett sejt életképességének növekedése, amikor ezeknek az antioxidánsoknak a jelenlétében fényvédő hatásról lehet szó, amelyet érdekes lehet tanulmányozni a kozmetikai készítményekben való lehetséges fényvédő szerként való felhasználásuk alátámasztására. A DOPAC esetében ez a vegyület fotoreaktívnak bizonyult, bár a 3T3 Neutral Red Uptake assay-ben nem figyeltek meg fototoxicitást. Azonban több tanulmányt kell végezni a DOPAC fotoreaktivitás mögött meghúzódó mechanizmusok megértéséhez, a fotobiztonság biztosításához, valamint a kémiai szerkezet és a vegyület fotoreaktív képessége közötti szerep és kapcsolat megértéséhez. A szerző közreműködése: Formal Analysis, BA; Írás – eredeti tervezet előkészítése, BA; Koncepció IFA, HC és JG: Erőforrások, IFA, HC, JMSL és JG; Írás – áttekintés és szerkesztés, IFA, HC, JMSL és JG; Felügyelet, IFA, HC és JG; Finanszírozás megszerzése, IFA, HC, JMSL és JG Minden szerző elolvasta és elfogadta a kézirat közzétett változatát. Finanszírozás: Ez a kutatás nem kapott külső finanszírozást. Az intézményi felülvizsgálati bizottság nyilatkozata: nem alkalmazható. Tájékoztatott hozzájárulási nyilatkozat: Nem alkalmazható. Adatok Elérhetőségi nyilatkozat: Az ebben a tanulmányban bemutatott összes adatot a cikk tartalmazza. Köszönetnyilvánítás: Ezt a munkát az FCT-Fundação para a Ciência ea Tecnologia, IP nemzeti alapjai finanszírozzák az UIDP/04378/2020, UIDB projekt keretében. /04378/2020 az Alkalmazott Molekuláris Biotudományok Kutatóegysége-UCIBIO és az Associate Laboratory Institute for Health and Bioeconomy-i4HB LA/P/0140/2020 projektje és az UIDB/00081/2020 projekt, amelyet az FCT/ACMCTES finanszíroz. Összeférhetetlenség: A szerzők nem nyilatkoznak összeférhetetlenségről. A minta elérhetősége: Nem alkalmazható.

Hivatkozások

1. Zillich, OV; Schweiggert-Weisz, U.; Eisner, P.; Kerscher, M. Polifenolok, mint kozmetikai termékek hatóanyagai. Int. J. Cosmet. Sci. 2015, 37, 455–464. [CrossRef]
2. Jelena, CH; Giorgio, R.; Justyna, G.; Neda, M.-D.; Natasa, S.; Artur, B.; Giuseppe, G. A polifenolok jótékony hatásai a krónikus betegségekre és az öregedésre. In Polyphenols: Properties, Recovery, and Applications; Galanakis, CM, szerk.; Woodhead Publishing: Kidlington, Egyesült Királyság, 2018; 69–102.
3. Cory, H.; Passarelli, S.; Szeto, J.; Tamez, M.; Mattei, J. A polifenolok szerepe az emberi egészségben és az élelmiszer-rendszerekben: A mini áttekintés. Elülső. Nutr. 2018, 5, 87. [CrossRef]
4. Fraga, CG; Croft, KD; Kennedy, DO; Tomás-Barberán, FA A polifenolok és más bioaktív anyagok hatása az emberi egészségre. Élelmiszer funkció. 2019, 10, 514–528. [CrossRef]
5. Bertelli, A.; Biagi, M.; Corsini, M.; Baini, G.; Cappellucci, G.; Miraldi, E. Polifenolok: Az elmélettől a gyakorlatig. Foods 2021, 10, 2595. [CrossRef]
6. Chen, K.; Lu, P.; Beeraka, NM; Sukocheva, OA; Madhunapantula, SV; Liu, J.; Sinelnikov, MY; Nikolenko, VN; Bulygin, KV; Mikhaleva, LM; et al. Mitokondriális mutációk és mitoepigenetika: Fókuszban az oxidatív stressz által kiváltott válaszok szabályozása az emlőrákokban. Semin. Cancer Biol. 2020. [CrossRef] [PubMed]

7. Forman, HJ; Zhang, H. Az oxidatív stressz megcélzása betegségekben: Az antioxidáns terápia ígérete és korlátai. Nat. Rev. Drug Discov. 2021, 20, 689. [CrossRef] [PubMed]
8. Boo, YC Megvédhetik a növényi fenolos vegyületek a bőrt a levegőben szálló részecskéktől? Antioxidánsok 2019, 8, 379. [CrossRef]
9. Jesumani, V.; Du, H.; Pei, P.; Aslam, M.; Huang, N. Összehasonlító vizsgálat a Sargassum vachellianum polifenolban gazdag kivonatának és poliszacharidban gazdag kivonatának bőrvédő aktivitásáról. PLoS ONE 2020, 15, e0227308. [CrossRef] [PubMed]
10. Saraf, S.; Kaur, CD Phytoconstituents as fotoprotektív új kozmetikai készítmények. Pharmacogn. Rev. 2010, 4, 1–11. [CrossRef]