A Biomphalaria Alexandrina biokémiai és hisztopatológiai válaszai a RIPEX-re (növényi növekedést szabályozó)Ⅰ

Absztrakt

Háttér

A növényi növekedésszabályozókat széles körben alkalmazzák a mezőgazdaságban a növények növekedésének és érésének fokozására, de veszélyeztetik a vízi ökoszisztémát. A jelenlegi tanulmány a RIPEX 48 százalékos EK-koncentrációjának (8 és 16 µl/l) való szubletális expozíció hatását vizsgálta az oxidatív stressz paraméterekre, a nemi hormonokra, az immunpotenciál enzimekre, a különböző hemocitaszámokra, valamint az emésztőmirigyek és az ovotestis hisztopatológiájára. Biomphalaria alexandrina csigák.

Kattints a tesztoszteron herba citanche-hoz

Eredmények

A RIPEX expozíció a szuperoxid-diszmutáz és a glutation-S-transzferáz aktivitásának általános növekedését okozta B. Alexandrinában. Az extrém RIPEX expozíció azonban gátolja az SOD aktivitását a csigákban. A malondialdehid aktivitás növekedést mutatott a B. Alexandrinában mindkét koncentrációnak kitéve az összes expozíciós időszak után. A RIPEX emellett jelentős tesztoszteron-növekedést okozott a 16 µl/l-nek kitett csigákban, azonban csökkentette a hormonszintet azokban a csigákban, amelyek 8 µL/L-nek voltak kitéve 7 napon belül. Az ösztradiol esetében szignifikáns növekedés volt megfigyelhető 3 napos 16 µl/l-es és 7 napos 8 µl/l-es expozíció után. A RIPEX expozíció növelte a mieloperoxidáz és az adenozin-deamináz enzimek aktivitását is a csigák emésztőmirigyeiben. Növelte a kitett csigák teljes hemocitaszámát, valamint a granulociták számát. A csiga emésztőmirigyei és az ovotestis kóros elváltozásokat mutattak 7 napos RIPEX expozíció után.

Következtetések

Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a RIPEX mérgező a B. Alexandrina számára, és hogy ez a csiga bioindikátorként használható a növényi növekedést szabályozó anyagokkal történő környezetszennyezés esetén.

Kulcsszavak

Biomphalaria alexandrina, RIPEX, tesztoszteron, ösztradiol, mieloperoxidáz, adenozin-deamináz, kórszövettan

1.Háttér

A felszíni vizek agrokémiai szennyezése egyre nagyobb globális környezeti probléma, különösen azokon a területeken, ahol a mezőgazdaság gyorsan terjeszkedik és intenzívebbé válik. Különféle szintetikus vegyszereket, például peszticideket vagy műtrágyákat használnak a termés mennyiségének és minőségének módosítására a vásárlók igényeinek kielégítésére [7, 40]. A növényi növekedésserkentők sok országban elterjedt mezőgazdasági vegyszerek [18].

Ha ezeket a vegyi anyagokat közvetlenül belélegzik, vagy szennyezett zöldségekkel együtt fogyasztják, károsítják az emberi egészséget [39]. A szerves foszfortartalmú peszticid, az etefon (2-klór-etil-foszfonsav) egy etilént felszabadító szintetikus vegyszer, amelyet általában növényi növekedést szabályozóként (PGR) használnak a virágzás, a gyümölcsérés és más élettani reakciók elősegítésére. Számos szabadban termesztett élelmiszer-, takarmány-, nem élelmiszer-, üvegházi faiskolai és dísznövényen engedélyezett [3, 50]. Az etefon toxicitásának laboratóriumi értékelése kimutatta, hogy az etefon a Daphnia magna második antennájának, szenzoros sörtéinek, farokgerincének és rostrumának morfometrikus fejlődési rendellenességeit idézte elő, amelyek funkcióvesztéshez és halálhoz vezettek [54].

Abd-El Azeem [1] a növekedési sebesség, a DNS-károsodás és az apoptotikus hatások csökkenését észlelte a Deroceras reticulatum csiga emésztőmirigysejtjeiben az etefon hatását követően. Sok szerző jóváhagyta az Ethephon toxicitását patkányokon és madarakon [2, 17, 55]. Ezenkívül az etefon expozíció genotoxicitást, oxidatív stresszt és reprodukciós toxicitást okozott egerekben [16]. A teratogenitást és az ivarmirigy-rendszer diszfunkcióját egereknél szintén összefüggésbe hozták az etefon expozícióval [2, 16]. Az etefonról kimutatták továbbá, hogy immuntoxikus, mutagén hatású [26], fokozza az oxidatív stresszt, valamint csökkenti a dezoxiribonukleinsav és ribonukleinsav koncentrációját [4].

Az etefon a víztestekben veszélyeztetheti a vízi faunát; a vízi élőlényekre gyakorolt ​​hatásáról azonban kevés adat áll rendelkezésre. Számos vízi fajt használtak a növényi növekedési hormonok vízi rendszerekben történő kimutatására. Ezen organizmusok némelyikét azonban nehéz a laboratóriumban manipulálni és fenntartani, ami megnehezíti az ökotoxikológiai értékelésekben való felhasználásukat [54]. A vízi puhatestűek, beleértve a csigákat is, a közelmúltban felkeltették a figyelmet tesztszervezetként, mivel gerinctelen modelleket kell kifejleszteni a vízi szennyeződések környezeti monitorozására [21, 45]. A vízi rendszerekben a csigák a legelterjedtebb puhatestű-csoport. A csigák bioindikátorként kevésbé kizsákmányoló alternatívát jelentenek a magasabb gerincesekkel szemben, mivel számos kísérletben felhasználhatók etikai jóváhagyás nélkül, és beszerzésük és fenntartásuk olcsó [13].

Ebből a szempontból a Biomphalaria alexandrina csigát széles körben használták az édesvíz peszticidekkel való szennyezésének indikátoraként [29, 30]. A bioindikátori potenciálon túl ez a csiga köztes gazdaszervezetként is működik a Schistosoma mansoni átvitelében [35]. Ezért a környezetben lévő agrokémiai koncentrációk befolyásolhatják a schistosomiasis átvitelét a köztes gazdaszervezetre és a parazita sűrűségére gyakorolt ​​közvetlen és közvetett hatások révén [27]. Jelen vizsgálat célja a növényi növekedésszabályozó, a RIPEX 48% EC (az etefon, a 2-klór-etil-foszfonsav kereskedelmi neve) szubletális expozíciójának a B. alexandrina különböző biokémiai, immunológiai és szövettani vonatkozásaira gyakorolt ​​hatásának vizsgálata volt. a csigák, mint bioindikátor organizmusok.

2 Módszerek

2.1 Teszt organizmus

A Biomphalaria alexandrina csigákat az egyiptomi El-Matareya-ban, Dakahlia kormányzóságban található Manzalah-tóból gyűjtöttük (31 fok 11′ N 32° 2′ K), és jól levegőztetett csapvízben tartották állandó, 20 fokos hőmérsékleten. Naponta friss salátalevéllel etették őket. Laboratóriumi körülmények között 4 hetes karbantartás után egészséges, kifejlett csigákat (10-12 mm héjátmérő) használtunk a további kísérletekben.

2.2 Kísérleti anyag és expozíciós feltételek

A növénynövekedés-szabályozót, a RIPEX-et (48 százalék etefon [2- klór-etil-foszfonsav (C2H6ClO3P)] és 52 százalék közömbös összetevőket tartalmazó oldat forma) a Chema Industries-től (New Nubaria város, Behira, Egyiptom; regisztrációs engedély száma) vásárolták. . 1840). Koncentrációsorozatot készítettünk. Tíz csigát tartalmazó famásolatokat tártak fel. 1-napos expozíció után az elhullott csigákat megszámolták, eltávolították, és az LC50 és LC90 értékeket társadalomtudományi statisztikai szoftverrel (SPSS; IBM Corp. Armonk, NY, USA) számították ki.

2.3 Kísérleti tervezés

Két szubletális koncentrációt használtunk, amelyek az LC10 és LC20 értékeket képviselik (8 és 16 µL/L). 90 csigát három csoportra osztottunk, mindegyik csoport három ismétléssel (tíz csiga/replikáció): a kontrollcsoport, a 8 µl/l-nek kitett csoport és a 16 µl/l-nek kitett csoport. 1-, 3- és 7-napos időközönként értékelték az oxidatív stressz biomarkereit és az immunpotenciál enzimeket az emésztőmirigyben. a szteroid hormonokat Ovotestisben értékelték. Felmértük a hemocitaszám különbségét, valamint az emésztőmirigyek és az ovotestis szövettanát. Biokémiai vizsgálatokhoz minden csoportból 0,5 g szövetet (emésztőmirigy vagy ovotestis) homogenizáltunk 0,5 ml foszfát pufferben (pH 6,5) üveghomogenizátorral, és 10,000×g, 4 fokon 10 percig centrifugáltuk. . A kapott felülúszót felhasználtuk a következő vizsgálatokhoz.

2.4 Oxidatív stressz markerek meghatározása

2.4.1 Szuperoxid-diszmutáz (SOD, EC 1.15.1.1)

Az SOD aktivitást az EnzyChrom™ Superoxide Dismutase Assay Kit (Kat. szám: ESOD{{0}}; BioAssay Systems, Hayward, CA, USA) segítségével határoztuk meg a gyártó utasításai szerint. A szövethomogenizátumot hideg lízispufferrel (50 mM kálium-foszfát, 0,1 mM EDTA és 0,5% Triton X-100) centrifugáltuk 12, 000g-vel 5 percig 4 fokon. , és a felülúszót összegyűjtöttük az SOD meghatározásához [43]. Az SOD aktivitását az optikai sűrűségen (OD) mértük 440 nm-en.

2.4.2 Glutation-S-transzferáz (GST, EC 2.5.1.18)

Ez az enzim katalizálja a GSH konjugációját {{0}}klór-2,4-dinitrobenzollal (CDNB). Spektrofotometriásan mérjük 340 nm-en. A reakcióelegy 0,1 M kálium-foszfát puffert (pH 6,5), kálium-foszfát pufferben oldott GSH-t (140 mg/100 ml) és 4 mg/ml CDNB-t etil-alkoholban tartalmaz. Az enzimaktivitás egy egysége az az enzimmennyiség, amely percenként 1 μmol S-konjugátum képződését katalizálja [11].

2.4.3 Malondialdehid (MDA)

A teljes homogenizátumban a malondialdehidet tiobarbitursav-reaktív anyagként (TBARS) határoztuk meg Ohkawa et al. szabványos módszerével. [37]. A reakcióelegy tartalmazott 0,1 ml szövethomogenizátumot, azonos térfogatú nátrium-dodecil-szulfát oldatot, 0,75 ml ecetsavat, 0,75 ml tiobarbitursavat, és 0,3 ml desztillált vizet. Ezeket a komponenseket vortexben összekevertük és forrásban lévő vízfürdőben 1 órán át inkubáltuk, majd szobahőmérsékletre hűtöttük. Tíz 0,5 ml desztillált vizet és 2,5 ml n-butanolt adtunk minden csőhöz, és erőteljesen kevertük vortex segítségével, majd centrifugában forgattuk 2500 × g-vel 10 percig. Az abszorbanciát 532 nm-en olvastuk le.

2.5 Hormonmeghatározás

2.5.1 Tesztoszteron

A tesztoszteront tesztoszteron enzimhez kötött immunszorbens vizsgálati (ELISA) készlettel határozták meg (kat. szám: ADI-900-065; Enzo Life Sciences, NY, USA). A tesztoszteron a fő androgén, amely mind az elsődleges, mind a másodlagos szexuális fejlődést befolyásolja. szexuális vágy. 100 µl standard hígítót (3. vizsgálati puffer vagy szövettenyésztő tápközeg) pipettáztunk a nem specifikus kötő és a maximális kötő (0 pg/ml standard) lyukakba. Ezt követően 100 µl standard #1-#5 a megfelelő lyukakba. A mintát (100 µl) pipettáztuk a megfelelő üregekbe, és 50 µl 3. vizsgálati puffert a nem specifikus kötőhelyekbe. Ezenkívül 50 µl sárga antitestet adtunk minden egyes üregbe, kivéve a vakpróbát, a teljes aktivitást és a nem specifikus kötőhelyet. A lemez inkubálása szobahőmérsékleten lemezrázógépen 1 órán át 500 fordulat/perc sebességgel. Ezt követően 50 µl kék konjugátumot adtunk minden egyes üregbe, kivéve a teljes aktivitást és a vak mérőhelyeket. A lyukak tartalmának kiürítése után a mosást úgy végeztük, hogy minden lyukba háromszor 400 µl mosóoldatot adtunk. Kék konjugátumot (5 µl) adtunk a teljes aktivitású üregekhez, és 200 µl p-nitro-fenil-foszfát oldatot adtunk minden lyukba, és 37 °C-on 1 órán át inkubáltuk rázás nélkül. A lemez leolvasását 405 nm-en végeztük, miután minden lyukba 50 µL stop oldatot adtunk [12, 48].

2.5.2 Ösztradiol

Az ösztradiolt egy ösztradiol ELIZA kit (katalógusszám: 501890; Cayman Chemical, Michigan, USA) segítségével határoztuk meg a gyártó protokollja szerint. A reakció elve azon alapul, hogy az ösztradiol acetilkolinészteráz (AChE) nyomjelző koncentrációja állandó, de a natív ösztradiol koncentrációja változik, ezért az ösztradiol acetilkolinészteráz (AChE) nyomjelző mennyisége, amely az ösztradiol antiszérumhoz kötődik, fordítottan arányos a natív ösztradiol koncentrációjával. a kútban. 100 µl ELISA puffert adtunk a nem specifikus kötő és maximális kötődésű mérőhelyekhez. Adjunk hozzá 50 µL-t a 8-as csőből mindkét legalacsonyabb standard lyukba (8. szabvány), és 50 µL-t a 7. csőből a következő standard lyukak mindegyikébe (7. szabvány). Minden lyukba egy mintát (50 µl) adtunk. Ösztradiol AChE nyomjelzőt (50 µl) adtunk minden összaktivitáshoz és vaküreghez. Ezt követően ösztradiol ELISA antiszérumot (50 µl) adtunk minden egyes mérőhelyhez, kivéve a teljes aktivitást, a nem specifikus kötődést és a vaküregeket. Orbitális rázógépen végzett inkubáció után (2 óra szobahőmérsékleten) az abszorbanciát 414 nm-en mértük [52].

2.6 Immunpotenciál enzimek meghatározása

2.6.1 Mieloperoxidáz (MPO, EC 1.11.2.2)

Az MPO aktivitás egy egysége annak az enzimnek a mennyisége, amely hidrolizálja a szubsztrátot, és taurin-klóramint termel, hogy percenként 1.0 μmol TNB-t fogyasszon 25 fokon. Az MPO-t mieloperoxidáz kolorimetriás aktivitási vizsgálati kittel határoztuk meg (katalógusszám: MAK068; Sigma-Aldrich, MO, USA). Az abszorbanciát 412 nm-en mértük.

2.6.2 Adenozin-deamináz (ADA, EC 3.5.4.4)

Az ADA egy enzim, amely katalizálja az adenozin és a 2'-dezoxiadenozin inozinná és 2'-dezoxi-inozinná történő átalakulását. Az ADA meghatározása a technikai közleményben található adenozin-deamináz aktivitást vizsgáló kit (Kat. szám: MAK400; Merck KGaA, Darmstadt, Németország) elvei szerint történt. Az adenozin-deamináz egy egysége az az enzimmennyiség, amely az adenozint percenként 1,0 μmol inozin előállítására hidrolizálja 37 fokon. A reagensek 1×ADA vizsgálati puffer (41 μL), ADA Converter (2 μL), ADA előhívó (2 μL) és ADA szubsztrát (5 μL).

2.7 Differenciális hemocitaszám

A hemolimfát a csigából gyűjtöttük (kontroll, exponált) Sminia szerint [47]. Miután egy Pasteur-pipettával megérintette a fejét-lábát, a csigát kénytelenek voltak mélyen visszahúzódni a héjába, és kinyomni a hemolimfát, amelyet összegyűjtöttek a differenciális hemocitaszám meghatározásához. A mikroszkóp tárgylemezére hemolimfát kentünk a szétterítéshez. 99,8%-os metanolban 5 percig tartó fixálás után a tárgylemezt 45 fokos szögben elforgattuk szobahőmérsékleten történő szárításhoz, és 20 percig Giemsa festéssel festettük. A hemociták differenciálódását a 100 számlálással arányosnak határoztuk meg.

2.8 Szövettani vizsgálatok

A szövettani vizsgálatokat 7 napos 8 és 16 µl/l RIPEX expozíció után végeztük. Az emésztőmirigyeket és az ovotestist kimetszették, és azonnal Bouin᾿s folyadékban rögzítették. 1 napos rögzítés után a mintákat egy sor alkoholon keresztül dehidratáltuk, és xilolban tisztítottuk. Paraffinviasz tömbök készültek [42]. Tíz szekta. (5-7 μm vastagság) vágtuk, és hematoxilinnel és eozinnal festettük (Mayer H és E). A festést egy alapos csapvizes mosás követte. A szövettani metszeteket fotóautomata kamerával fényképeztük (Optika, Olaszország).

2.9 Statisztikai elemzés

Az adatokat átlag±szórásként fejeztük ki, és társadalomtudományi statisztikai szoftverrel (SPSS; IBM Corp. Armonk, NY, USA) elemeztük. Kétirányú ANOVA varianciaanalízist alkalmaztunk a kontroll és a kitett csoport közötti különbségek, a különböző koncentrációk és az expozíció időpontjai közötti különbségek azonosítására. A szignifikancia szintje p Kisebb vagy egyenlő, mint 0.05.

A Cistanche mechanizmusa fokozza a tesztoszteron hatást

Megállapították, hogy a Cistanche több módon is növeli a tesztoszteronszintet. Először is, echinakozid és akteozid néven ismert vegyületeket tartalmaz, amelyekről kimutatták, hogy fokozzák a luteinizáló hormon (LH) termelődését az agyalapi mirigyben. Az LH serkenti a herék Leydig sejtjeit tesztoszteron termelésére. A Cistanche poliszacharidokat és fenil-etanol-glikozidokat is tartalmaz, amelyekről kimutatták, hogy antioxidáns és gyulladásgátló tulajdonságokkal rendelkeznek. Ez segíthet csökkenteni az oxidatív stresszt és a herék gyulladását, ami ronthatja a tesztoszterontermelést. Ezenkívül a Cistanche-ról megállapították, hogy fokozza a tesztoszteronszintézisben részt vevő gének expresszióját, és csökkenti a tesztoszteront lebontó enzimek aktivitását, mint például a {{1} }alfa-reduktáz. Összességében úgy gondolják, hogy ezeknek a mechanizmusoknak a kombinációja hozzájárul a Cistanche tesztoszteron-növelő hatásaihoz.

Hoda H. Abdel-Azeem1*, Azza H. Mohamed1 és Mohamed R. Habib2