A kalretikulin hiánya megzavarja a riboszóma biogenezist, és az embrionális vese fejlődésének retardációját eredményezi

edmund.chen@wecistanche.com

Absztrakt

A nefrogenezist összetett jelátviteli utak hajtják, amelyek szabályozzák a sejtek növekedését és differenciálódását. Az endoplazmatikus retikulum chaperone calreticulin (Calr) jól ismert a kalciumtárolásban és a glikoproteinek összerakásában betöltött funkciójáról. Szerepe abbanvesea fejlődés még mindig nem érthető. Ebben a vizsgálatban bizonyítékot szolgáltatunk a Calr kulcsfontosságú szerepére a nefrogenezisben. Megmutattuk, hogy a Calr-hiány az ép nefrogén zóna kialakulásának zavarát és a nefrogenezis késleltetését eredményezi, amit a vessző- és s-alakú testek képződésének zavara bizonyít. Proteomikai és transzkriptomikai megközelítésekkel kimutattuk, hogy a Wnt-jeladó kulcsfehérjék megváltozása mellett az embrionálisveseCalr-tól // általános károsodást mutatott ki a riboszomális fehérjék expressziójában, ami a fehérjeszintézis és a nefrogenezis zavarait mutatja. A CRISPR/cas9 által közvetített kiütés megerősítette, hogy a Calr-hiány számos riboszómális fehérje és a riboszóma biogenezisben kulcsfontosságú fehérje hiányához kapcsolódik. Adataink rávilágítanak a közvetlen kapcsolatra a Calr-expresszió és a riboszóma biogenezise között.

Bevezetés

VeseAz organogenezist a morfogenetikai események egymásutánja jellemzi, amelyet a sejtnövekedés és a differenciálódás vezérel. A nefrogenezis során a mesenchymalis-epiteliális átmenet (MET) és az ureter bimbó (UB) elágazása, amely az UB és a metanefris mesenchyma (MM) közötti kölcsönös indukció eredménye [1], a nefronképződés hajtóereje. E folyamat során a különböző jelátviteli útvonalak komplex és kölcsönös kölcsönhatása szükséges a hámdifferenciálódás és a nefron kialakulásának megszervezéséhez [1–3]. Ennek a folyamatnak a kulcsfontosságú útvonalai közül a glia eredetű neurotróf faktor (Gdnf) a Ret receptoron keresztül történő jelátvitel központi szerepet játszik az ureter bimbózásnak nevezett folyamat során. Ennek a jelzésnek a megszakadása méhen kívüli uretert illvese-agenesis, amikor a jelzés teljesen hiányzik [4]. A Gdnf/Ret jelzésen kívül a kanonikus Wnt/ -catenin jelzésről ismert, hogy több szempontot is koordinálvese-az MM-en és az UB-n belüli fejlődés [5], valamint a kanonikus Wnt jelátvitel gátlása az ureterbimbó-vonalban és a nephron progenitorokbanvese-agenesis [6]. A transzkripciós újraprogramozás fenntartása a nefrogenezis során a kromatin hozzáférhetőségétől függ [7]. Kimutattuk, hogy a heterokromatin fehérjék, amelyekről ismert, hogy részt vesznek a géncsend epigenetikai szabályozásában, elengedhetetlenek az elágazó aktivátorok és inhibitorok közötti egyensúly fenntartásához a fejlődés korai szakaszában [7].

A CISTANCHE JAVÍTJA A VESE/VESE MŰKÖDÉSÉT

A calreticulin (Calr) az endoplazmatikus retikulum (ER) kósza kísérője, nagy kalciumkötő képességgel és alacsony affinitással, amely kulcsfontosságú a Ca2 plusz ER-hez való megkötéséhez és a különböző sejtfolyamatokhoz, beleértve a jelátvitelt, a génexpressziót és a fehérje-forgalmat. [8,9]. A Calr betegségekben betöltött szerepével foglalkozó mechanizmusok főként a Calr Ca2 plusz-kötő C-terminális doménje által létrejövő Ca2 plusz kelátképzésen és az unfolded protein response (UPR) szerepén alapulnak [10,11]. Az UPR citoprotektív szerepet játszhat a rosszul hajtogatott fehérjékkel való kihívás során, vagy káros lehet a sejtekre, mivel a tartós UPR jelátvitel indukálta apoptózist. Bár kevés tanulmány foglalkozott a Calr potenciális szerepével a betegségekben a transzkripció szabályozásán keresztül, a Calr ER chaperon funkciója továbbra is a sejt sorsának egyik kulcsfontosságú mechanizmusa [9,12]. A hosszan tartó ER-stressz és a fehérje hibás feltekeredése számos esetben kiemelkedővesebetegségekmint például a glomerulopathiák, akutvese sérülés, diabéteszes nephropathia,vese-fibrózis és krónikusvesebetegség[13,14]. A Calr szerepe az embrionális fejlődésben még mindig nem tisztázott. A Calr knockout embrionális letalitást okoz az E14.5 fejlődési szakaszban a szívfejlődés károsodása miatt [15]. A Calr-hiány következményei a molekuláris mechanizmusokraveseaz embrionális fejlődés azonban még nem teljesen ismert. Jelen tanulmányunkban az embrionális összehasonlító transzkriptomikai és proteomikai elemzéseket végeztükvesea három genotípusból Calr plus / plus , Calr plus // és Calr//, és kiemelte a Calr knockout hatását a nefrogenezisre és a riboszomális fehérjék expressziójára.

Kulcsszavak:kalretikulin-hiány; nefrogenezis; riboszómális biogenezis, vese, vese

2. Eredmények

2.1. Calreticulin Knockout eredmények a vese morfológiai és szövettani rendellenességeiben és károsodott veseelágazásban

A Calr genetikai kiütése egerekben korai embrionális letalitást okoz a kamrai septum defektusok miatt [15]. Annak megvizsgálása érdekében, hogy a Calr-kiütés hatással van-eveseA fejlődés során az E13.5 stádiumú egérembriókat Calr plus // vemhes egerekből készítettük elő (1A. ábra). A Calr// embriók szignifikáns növekedési változást mutattak a Calr plus / plus és Calr plus // összehasonlítva, és jelentős károsodást mutattak ki az embrionális fejlődésben. Az embriók durva morfológiája és aveseszignifikáns méretcsökkenést mutatott a Calr plus/plus és a Calr−// egerek között, a Calr// egerek pedig a legnagyobb eltérést mutatták (1A. ábra). A Calr-kiütés hatásának szemléltetésérevesefejlődés és szerkezet három különböző fejlődési szakaszban (E13.5, E14.5, E16.5) és a három genotípusból (Calr plus / plus , Calr plus // és Calr//) származó embriókat leölték, és aveseszerezték meg. A szövetmetszetek különböző fejlődési stádiumait mutattákvese,amely bonyolult morfológiai struktúrákon halad keresztül, amint azt a szövetmetszetek PAS- és HE-festése bizonyítja.Veseugyanabból az embrionális stádiumból, különböző genotípusokkal, eltérő fejlettségi szintet mutattak (1B. ábra). Ezen túlmenően jelentős különbségek vannakvesestruktúrák figyelhetők meg, különösen a Calr // és Calr plus / plus és Calr plus // összehasonlításakor. Ezek a különbségek a nefrogenezis előrehaladott stádiumában is megmaradnak (1B. ábra). Calr//vesesúlyos károsodást mutat a Calr plus / plus és a Calr plus // (1B. ábra). Az E13.5 szakaszban a Calr mérete//vesekisebb volt, és szignifikánsan alacsonyabb volt az ureterrügyek és az ureterbimbó-ágak száma. Hasonló megfigyeléseket végeztek az E14.5 és E16.5 szakaszokban. Az embrionális szervkultúravesea három embrió genotípusból lényeges rendellenességet tárt fel az UB elágazásában ésvesenövekedés. Vizualizálni avese-struktúrákat, a tenyésztett rudimentumokat lamininnel festettük meg a bazális membrán markereként és Dolichos biflorus agglutinin (DBA) lektinnel az UB vizualizálására.

A tenyészet kombinált FL fluoreszcens festésevesea kezdetlegesek jelentős elágazási károsodást mutattak, amely a Calr-hiányt kísérte, és általános retardációt eredményezettvesefejlesztés (2A, B ábra). Az elkülönítés idején a Calr//veseA rudimentek 6–10 UB tippet, míg a Calr plus / plus és Calr plus // rudimentek 20–30 UB tippet mutattak. A Calr plus / plus és Calr plus // tenyésztett rudimentumok normálisan fejlődtek a tenyésztési periódus alatt (72 óra), és jól elágazó UB-t mutattak (mindegyik 85 ± 9, n=6), valamint különböző ismert szerkezeteket mutattak a tenyésztési időszakban. vivo fejlődő vese. A kulturáltvesekimutatott cső előtti aggregátumok,vese-hólyagok és a sapka mezenchima (2A, B ábra). Ezzel szemben a Calr// rudimentumok nem fejlődtek normálisan, és jelentős változást mutattak az UB elágazásában (15 ± 3 n=6) (2B. ábra).

2. ábra Calr−/− egérvesekezdetleges növekedése és UB elágazása súlyos változást mutat. (A):Vesea Calr plus / plus Calr plus /− és Calr−/− (E13.5) kezdetleges elemeit izoláltuk és ex vivo tenyésztettük három napig. Calr−/−veseA rudimentek a növekedésben általános változást és az ureterbimbó elágazásában jelentős változást mutattak. (B): Immunfluoreszcens festésevesekezdetleges három napos kultúra után. Laminin (piros) és DBA-lektin (zöld) együttes festését végeztük el, hogy láthatóvá tegyük a rudimentumok különböző szerkezetét. Az elágazás mennyiségi meghatározását az ureterbimbó ágainak megszámlálásával végeztük. A számszerűsítés oszlopdiagramként jelenik meg hibasávokkal. Minden oszlop az ág számátlagát ± sd jelenti hat tenyésztett alapelemből. Jelentős eltérések: (*) p < 0.05,="" (***)="" p="">< 0,001.="" 2,5×="" 2,5×="" 2,5×="" int.="" j.="" mol.="" sci.="" 2021,="" 22,="" 5858="" 4="" of="" 21="" 2.="" ábra.="" calr悆="" egérvese="" rudimentjei="" súlyos="" változást="" mutatnak="" a="" növekedésben="" és="" az="" ub="" elágazásában.="">Vesea Calr plus / plus Calr plus // és Calr / (E13.5) kezdetleges elemeit izoláltuk és ex vivo tenyésztettük három napig. Calr /veseA rudimentek a növekedésben általános változást és az ureterbimbó elágazásában jelentős változást mutattak. (B): Immunofluoreszcens festésevesekezdetleges három napos kultúra után. Laminin (piros) és DBA-lektin (zöld) együttes festését végeztük el, hogy láthatóvá tegyük a rudimentumok különböző szerkezetét. Az elágazás mennyiségi meghatározását az ureterbimbó ágainak megszámlálásával végeztük. A számszerűsítés oszlopdiagramként jelenik meg hibasávokkal. Minden oszlop az ág számátlagát ± sd jelenti hat tenyésztett alapelemből. Jelentős eltérések: (*) p < 0.05,="" (***)="" p=""><>

2.2. A Calr-hiány nagy és jelentős transzkriptumváltozásokkal jár

A morfológiai és szövettani vizsgálatok károsodást mutattak kivesefejlesztés Calr/ egér embriókban a Calr plus / plus és Calr plus // . Annak megvizsgálása érdekében, hogy a Calr-kiütés befolyásolta-e a nefrogenezis kulcsfontosságú fehérjék és útvonalak expresszióját, teljes transzkripciós elemzéseket végeztek avesekezdetleges vizsgálatokat végeztünk a három embrió genotípusból. A Calr plus / plus , Calr plus // és Calr/ közötti differenciáltan expresszált gének értékeléséhezvesemintákon a leolvasási számokon alapuló kvantitatív teszteket Fisher-féle egzakt teszttel végeztük Benjamini–Hochberg korrekcióval több teszthez. Az S1 és S2 kiegészítő ábra a génexpressziók közötti összehasonlító elemzés hőtérképét mutatja.vesea Calr plus / plus , Calr plus / / és Calr / alapelemei . Annak érdekében, hogy átfogó áttekintést kapjunk a Calr plus / plus és a Calr / vese közötti génexpressziós változásokról, MA-diagramot hoztunk létre a Calr plus / plus és Calr / közötti expresszió transzformált fold változásával (FC) a transzformált transzformáció log2-jére. átlagos expressziós szint minden génre az összes mintában (3A ábra, S1 kiegészítő ábra). Az MA-diagram eltérően szabályozott géneket mutat Calr plus/plusban a Calr/-hez képest. A szabályozott gének funkcionális osztályozása a biológiai folyamatok szerint a fejlődési folyamat megváltozását tárta fel Calr /vese(3B. ábra, S1 kiegészítő táblázat). A szabályozott gének útvonal-annotációjának alaposabb vizsgálata két fő folyamat aberrációját tárta fel: a Wnt jelátvitelben és a fehérje feltekeredésében, mivel a szabályozott fehérjék többsége ebben a két fő útvonalban vesz részt (3B. ábra). Az expressziós profilokon végzett hierarchikus klaszterezés és k-közép klaszterezés megerősítette, hogy az embrionálisvesea Calr plus / plus és a Calr plus // átiratai nagyon hasonlóak, de jelentősen eltérnek a Calr / transzkriptómáitól (3C ábra, S1 és S2 kiegészítő ábra).

A CISTANCHE JAVÍTJA A VESE/VESE FERTŐZÉSÉT

Transzkriptomenalízis adataink azt mutatták, hogy a Calr kiütését a kulcsfontosságú fehérjék expressziójának megváltozása kísértevesefejlődés (3C és 4A ábra, S2 kiegészítő táblázat) a Wnt jelátvitel kulcsfontosságú fehérjéi mellett, és számos nefrogén gén leszabályozott, vagy nem volt kimutatható a Calr /vesekezdetleges (3C. ábra, 4A. ábra). Többek között az olyan transzkripciós faktorok, mint a Six1 és Six2, amelyekről korábban azt írták, hogy a nefrogenezis különböző szakaszaiban működnek, jelentősen csökkentek a Calr// embrionális vesében. Az Osr1 egyike azoknak a géneknek, amelyek expressziója szükséges az Eya1, Pax2, Six2, Sall1 és GDNF számára, és ennek a génnek az expressziója szinte hiányzott a Calr / -ban. Annak vizsgálata érdekében, hogy a Wnt jelátvitel és a nefrogén kulcsgének megváltozása milyen hatással van avesefejlesztés Calr knockout egerekben, az embrionális fejlődés markereivel immunfluoreszcens festést végeztekvesestádiumú embriók metszete E14.5. A festés egyértelműen megerősítette a Calr / vizsgált gének megváltozását (4B. ábra). Ezenkívül a Calr plus / plus és a Calr plus // összehasonlításával a Calr /vesehiányzik egy tiszta nefrogén zóna (4B. ábra), amint azt a festés bizonyítja, és ez megerősíti avesefejlődés Calrban/embriókban.

2.3. Összehasonlító proteomikai elemzések jelentős változásokat azonosítottak a Calr / embrionális vese proteomjában

A morfológiai és szövettani elemzések kimutatták, hogy a Calr korlátozása problémás az embrionális fejlődés szempontjából.vese. Hogy jobban megértsük Calr szerepétveseembrionális fejlődés, széles körű proteomanalíziseket végeztek embrionálisanvesekét stratégiát használva. Az első kísérletekben 2D-gél elektroforézist használtunk az embrionális összehasonlításraveseproteomok a Calr plus / plus és Calr plus // egérembriókból az E13.5 stádiumból. A 2D minta jelentős változást mutatott a Calr plus proteomjában //vese(p < 0,05)="" (s3a="" kiegészítő="" ábra).="" a="" differenciálisan="" bőséges="" fehérjék="" azonosítása="" a="" stresszútvonalakban="" és="" az="" rns-anyagcserében="" részt="" vevő="" fehérjék="" expressziójának="" megváltozását="" tárta="" fel="" calr="" plus="" embrionális="">vese(S3B,C kiegészítő ábra). A Calr plus // és Calr悆 / proteomváltozásának jobb feltárása érdekében a Calr plus / plushoz képestvese, tömegspektrometrián alapuló proteomprofilozást végeztünk (5. ábra, S3–S8 kiegészítő táblázatok). Egy átfedés-analízis azt mutatta, hogy a genotípusok között a fehérje-detektálás magas reprodukálhatósága van (5A. ábra). A statisztikai elemzés szignifikáns változásokat mutatott ki a fehérje expressziójában a Calr plus / plus és Calr 悆 / (5A ábra, S3 és S4 kiegészítő táblázatok, S4A kiegészítő ábra), Calr plus // vs Calr között (5A ábra, S5 és kiegészítő táblázatok). S6, S4B kiegészítő ábra) és Calr plus / plus vs Calr plus // (5A ábra, S7 és S8 kiegészítő táblázatok, S4C kiegészítő ábra). Az immunfluoreszcens festés megerősítette a Calr kiütését Calrban //vese. Ezenkívül megerősítettük a proteomikai eredményeket két lefelé szabályozott fehérjére vonatkozóan a Calr / ban: Calbindin 1 (Calb-1) és Superoxide dismutase 1 (Sod1). A Sod1 esetében mind a proteomikai, mind a transzkriptomikai adatok a Sod1 kiütését mutatták ki a Calr embrionálisveseés immunfluoreszcens festés megerősítette a Sod1 hiányát a Calr / embrionálisvese(5B. ábra). A Sod1 egy antioxidáns metalloenzim, amely fontos szerepet játszik a reaktív oxigénfajták (ROS) méregtelenítésében azáltal, hogy a szabad szuperoxid gyököket hidrogén-peroxiddá alakítja a sejtkatalázok általi további méregtelenítés érdekében, így megelőzve a toxicitást. A Calb-1 a fő intracelluláris kalciumkötő fehérje a distalis convolute tubulusban (DCT), és kulcsszerepet játszik a transzcelluláris Ca2 plusz reabszorpcióban. Intracelluláris Ca2 plus -puffer és Ca2 plus -tranzit fehérjeként a Calb-1 Ca2 pluszt szállít az apikális oldalról a bazolaterális oldalra anélkül, hogy az intracelluláris Ca2 plus -koncentráció jelentős mértékben megváltozna. A Calr-kiütés és a két fehérje expressziójának megváltozása közötti kapcsolat nem egyértelmű, és további vizsgálatokat igényel.

3. ábra: Kalretikulin knockout egerek összehasonlító génexpressziós analízise. (A): MA diagram, amely széles körű fel- és leszabályozott géneket mutat Calr plus/plus egerekben a Calr / ellen. A hajtásváltozás kvantitatív tesztjeit (a normalizált log-transzformált leolvasási szám alapján) Fisher-féle egzakt teszttel végeztük Benjamini–Hochberg korrekcióval (p < 0,05),="" és="" a="" nem="" szignifikáns="" gének="" szürkével="" vannak="" ábrázolva.="" az="" ma="" diagram="" a="" differenciálisan="" expresszált="" gének="" megjelenítésére="" szolgál="" calr="" plus="" plus="" vs.="" calr="" között.="" (b):="" a="" leszabályozott="" gének="" biológiai="" folyamatainak="" megoszlása="" ​​calr-ban/összehasonlítva="" a="" calr="" plus="" plus="" --val.="" az="" azonosított="" gének="" osztályozása="" david="" bioinformatikai="" eszközzel="" történt.="" a="" génszimbólumot="" a="" génontológiai="" annotációk,="" pl.="" biológiai="" folyamatok="" kategorizálására="" használták.="" (c):="" a="" három="" genotípus="" (calr="" plus="" plus="" ,="" calr="" plus="" és="" calr/)="" között="" szignifikánsan="" szabályozottnak="" talált="" legfontosabb="" gének="" dúsítási="" elemzése.="" az="" összehasonlító="" elemzést="" hőtérképként="" ábrázoltuk="" (fc=""><2 and="" fc="" >="">

2.4. A génontológia osztályozása és a fehérje-fehérje interakciós hálózat elemzései

A vulkán diagramok és a kördiagram elemzések azt mutatták, hogy a Calr kifejezés változása globális változásokat eredményez az embrionálisveseproteom (kiegészítő S4 ábra). Annak érdekében, hogy több információt szerezzünk az embrionálissal kapcsolatos biológiai mechanizmusokrólveseA Calr / egerek fejlődési változása során a DAVID bioinformatikát kombináltuk az UniProt és GenBank adatbázisokban található fehérjék feltételezett funkciójával kapcsolatos információkkal. Az azonosított fehérjék besorolása a biológiai folyamatokban való részvételük szerint húsz kategóriát eredményezett, amelyekből kilenc kategória magasan reprezentált (S4D kiegészítő ábra). Az egyik fő kategória a fejlődési folyamat volt, az azonosított fehérjék közül több mint 1000 ebbe a csoportba tartozik. Mivel a fehérje-fehérje kölcsönhatások a kulcsmechanizmusok szinte minden biológiai folyamatban, beleértve a fejlődést, a lehetséges fehérje-fehérje kölcsönhatásokkal kapcsolatos információk kinyerését és a szabályozott fehérjéket összekötő útvonal szabályozását a Calr plus // és a Calr/ embrionális sejtekben.vesejelentős információkat szolgáltathat azokról a folyamatokról, amelyek a Calr-hiányos körülmények között károsodtak. Ebből a célból megvizsgáltuk a szabályozott fehérjék közötti interakciós hálózatokat a STRING 11.0 (http://string.embl.de, elérve 2021. március 24-én) segítségével. A kizárólag Calr plus / plus és Calr plus // expresszált fehérjék további elemzése két erős kölcsönhatási csomópontot tárt fel a két fő folyamatban részt vevő fehérjékből, amelyek az RNS-metabolizmus és az oxidatív foszforiláció (S5A kiegészítő ábra). Ez arra utal, hogy a Calr / embrionálisveseRNS-anyagcsere-zavarban és energiahiányban szenvedhet. A Calr plus / plus és Calr plus // fehérjék közötti interakciós hálózatok vizsgálata a Calr/-hez képest erősen alátámasztja feltételezéseinket, mivel a hálózatok három erős interakciós csomópontot mutatnak. A csomópontok közül kettő felhalmozta az RNS-metabolizmusban és az oxidatív foszforilációban részt vevő fehérjéket, míg a harmadik csomópont riboszomális fehérjéket tartalmaz, és feltárta a riboszómaképződés és a fehérjeforgalom zavarát (S5B kiegészítő ábra). A szabályozottnak talált riboszomális fehérjék alapos vizsgálata jelentős változást mutatott ki mind a nagy, mind a kis riboszomális alegységekből származó fehérjékben, és ez feltárta a riboszómális biogenezis és fehérjeszintézis súlyos zavarát (6A–D ábra).

2.5. A Calr Knockout a riboszómális fehérje expressziójának megváltozását eredményezi 

A transzkriptomikai és proteomikai adatok elemzése szignifikáns változást mutatott ki a riboszómális fehérjék expressziójában Calr/embrionális egérben.vese. Western blot analízis és az embrionális MS mennyiségi meghatározásavesea három genotípusból származó fehérjekivonatok megerősítették az Rps10, Rps19 és Rps26 szignifikáns leszabályozásátvese(7A ábra) és Rps12, Rps13, Rps14 Rps15, Rps17 és Rps19 (kiegészítő S6A, B ábra) a Calr/ . Sőt, az embrionális festésvesemetszetek igazolták a riboszomális fehérjék expressziójában bekövetkezett változás mértékét; nem volt kimutatható Rps10 vagy Rps6 a Calr/embrionálisbanveseszakaszok (7B. ábra). A Calr knockout és a riboszomális fehérje expresszió közötti kapcsolat vizsgálata érdekében egy in vitro Calr knockout modellt hoztunk létre MDCK-ban.vese-tubulussejteket a CRISPR/cas9 endonukleáz rendszer segítségével. A Western blot elemzések megerősítették a Calr expressziójának dózisfüggő leszabályozását MDCK sejtekben, és kimutatták az Rps10 és Rps19 fehérjéket kódoló 40S riboszomális alegység jelentős kimerülését, ami a riboszóma biogenezisének zavarát tárta fel. Ezenkívül a fehérjeszintézishez nélkülözhetetlen komponensek expressziója, például az elongáció feltárta, hogy az eEIF5a iniciációs faktor szignifikánsan csökkent a Calr knockout MDCK sejtekben (7C. ábra). A Calr-kiütést jelentős morfológiai, proteomikai és transzkriptomikai változások kísérték. In vivo és in vitro vizsgálataink rávilágítottak arra is, hogy ezeket az eltéréseket a riboszóma biogenezis jelentős csökkenése kísérte. A riboszomális fehérje expresszió csökkenése a Calr knockoutbanvesenem korlátozódott az embrionális stádiumokra, hanem kimutatható volt felnőtt sejtekben isvese, amely feltárja a Calr potenciális szerepét a riboszómális biogenezisben.

7. ábra. A Calr-hiány a riboszomális fehérje expressziójának csökkenésével jár. (A): Rps10, Rps19 és Rps26 riboszomális fehérjék Western blot elemzése a Calr plus / plus , Calr plus // és Calr // embrionális fehérjekivonatokbanvese. Az embrionális veséket három különböző vemhes Calr plus /- egérből gyűjtöttük be. A genotipizálást követően az azonos anyától és genotípustól származó embriókat csoportosították, és embrionálisak voltakvesea fehérjekivonatokat egyesítettük. A fehérjebecslés után Western blot analízist végeztünk három párhuzamosban minden egyes vizsgált fehérjére. A minták összehasonlító elemzéséhez egyutas ANOVA-t használtunk. Az eredményeket legalább három független kísérlet átlag ± sd értékében adjuk meg. A különbségeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük, ha p < 0.05.="" (b):="" immunofluoreszcens="" festés="" rps10="" és="" rps6="" ellen="" calr="" plus="" plus="" és="" calr悆="" mbrionális="" veseszövet="" metszetekben="" 20×-es="" nagyítással.="" (c):="" mdck="" sejtekből="" származó="" fehérjekivonat="" western="" blot="" analízise="" (balra)="" és="" mrns="" mennyiségi="" meghatározása="" a="" calr="" kiütése="" után="" mdck="" sejtekben="" (jobbra).="" calr-t="" a="" crispr/cas9="" rendszer="" segítségével="" ütötték="" ki="" két="" különböző="" sgrns-sel.="" a="" western-blotokat="" calr,="" gapdh,="" rps10,="" rps19="" és="" eif5a="" antitestekkel="" vizsgáltuk.="" a="" calr="" és="" rps10="" mrns="" mennyiségi="" meghatározását="" az="" sgcalr-2="" mintában="" qpcr="" segítségével="" végeztük.="" a="" calr="" csökkentése="" a="" crispr/cas9="" rendszerrel="" összefüggést="" mutatott="" ki="" a="" calr-hiány="" és="" a="" riboszomális="" fehérje="" expressziójának="" megváltozása="" között.="" jelentős="" eltérések:="" (**)="" p="">< 0,01,="" (***)="" p="">< 0,001,="" (****)="" p=""><>

3. Megbeszélés

Azveseelágazó morfogenezis révén fejlődnek ki, amely egy olyan folyamat, amely összetett növekedési és differenciálódási folyamatokat foglal magában, és amelyet a környező sejtekből érkező jelek vezérelnek a születőben lévő mesenchymális kompartmentben [16]. Az elmúlt években számos kulcsfontosságú gén és útvonal bejutottvesefejlődést azonosítottak. A trofikus faktorok, különösen a GDNF, a csont morfogenetikus fehérjék (BMP-k) és a fibroblaszt növekedési faktorok (FGF) szerepet játszanakvese-növekedés és differenciálódás. Ezek szabályozzák az UB elágazás morfogenezisében, valamint a nefrogén mesenchyma fenntartásában és differenciálódásában részt vevő jelátvitelt az embrionálisban.vese[17]. A Calr knockout embrionális letalitást okoz a diszfunkcionális szívfejlődés következtében [15]. A normál kardiomiocitákban a citoplazma Ca2 plusz koncentrációjának növelése szükséges a szív myofibrillogenezisének elindításához. A Ca2 plusz koncentrációjának ez a nélkülözhetetlen változása a Calr-tól függ, és hiányzik Calr-hiányos körülmények között [18]. Az ER chaperon és a Calr kalciumkötő fehérje funkcionális szerepét a nefrogenezisben még nem vizsgálták. A Calr lehetséges szerepének vizsgálata az embrionális sejtekbenvesefejlődését és a Calr-hiány nefrogenezisre gyakorolt ​​hatását, összehasonlító transzkriptomikai és proteomikai elemzést végeztünk. Összességében a Calr-hiány a vesefejlődés késleltetését és jelentéktelen transzkriptum- és proteomváltozásokat eredményezett. Adataink továbbá azt mutatták, hogy a Calr-hiány súlyos rendellenességeket váltott ki a nefrogenezis útvonalakban, mivel a Wnt jelátviteli kulcsfontosságú fehérjék (pl. Wnt7a, Wnt11, Wnt10b, Fzd10, Fzd9, Prkcb, Prkcq és Kremen2) jelentős expressziós változásait azonosították. Az ureter bimbóhám és a metanefris mesenchyma közötti induktív jelátvitelt elsősorban a Wnt visszacsatolási jelátvitel szabályozza [19,20]. Míg a Calr a celluláris kalcium-homeosztázis fő része, egyúttal nélkülözhetetlen ER-kaperon is a sejtjelátvitelben és a génexpresszióban részt vevő glikoproteinek és fehérjék hajtogatásához és forgalmazásához [21]. A Calr kiütése a fehérje feltekeredésének megzavarását és az ER stresszt okozhatja, ami zavart okoz a transzlációs gépezetben. Ez magyarázhatja a homozigóta egerek vesefejlődésének megfigyelt retardációját.

Az egyik meglepő és érdekes szempont, amelyre adataink rávilágítottak, a riboszomális fehérjék expressziójának megváltozása. Kimutattuk, hogy a 40S és 60S riboszomális alegységek számos fehérjéje csaknem teljes mértékben kiürült. Ezen túlmenően in vitro kísérleteink megerősítették az összefüggést a Calr csökkent szabályozása és a riboszomális fehérje expresszió károsodása között. A riboszóma biogenezise jól szervezett és szigorú szabályozáson megy keresztül. Újabb kutatások kimutatták, hogy a riboszóma nemcsak a normál sejtfiziológiában játszik fontos szerepet, hanem az ingerekre adott reakciókban és a betegségek patogenezisében is. Ezenkívül a riboszóma biogenezis szabályozza a sejtnövekedést, és a proliferáció és a riboszómák változásai a sejtproliferáció rendellenességeiben, a sejtciklus leállásában, az apoptózisban és a patológiás manifesztációban tükröződnek [22, 23].

A riboszóma-biogenezisben betöltött szerepükön túlmenően a riboszómális fehérjékről azt találták, hogy sokféle extra riboszómális funkciót látnak el, például a sejtnövekedésben és -proliferációban, a DNS-javításban, valamint a sejtek differenciálódásában és fejlődésében [24–31]. A riboszómális fehérjefunkciók károsodása hematológiai és anyagcserezavarral járt együtt, és szív- és érrendszeri betegségekhez és rákhoz vezethet [32–36]. A riboszómális fehérjéket kódoló gének mutációja az erythropoiesis rendellenességével jár, ami klinikai szindrómákat, például Diamond–Blackfan anémiát (DBA) [37] és 5q-szindrómát [38] eredményez. Az RPS10 mutációi a Diamond-Blackfan vérszegénységhez kapcsolódnak, és ezeknek a betegeknek a 30 százaléka patkós vagy szigmakóros.vese[39]. Érdekes módon a Diamond–Blackfan betegeknél nagyobb eséllyel alakul ki mielodiszpláziás szindróma, amely a Calr gén 9. exon mutációjához kapcsolódik [40–42]. A transzlációs gépezet ezen átalakulása hatalmas aberrációkat okoz a fejlődési folyamatban, és nemcsak az urogenitális, hanem a keringési és reproduktív rendszert is érinti, végül kalretikulinhiány esetén embrionális letalitást okozva. Adataink zavaró riboszóma biogenezist tártak fel a Calr/embrionális sejtekbenveseés rávilágított a Calr jelentős szerepére a fehérje biogenezisben. Úgy gondoljuk, hogy a Calr-hiány és a riboszomális fehérje expressziós változása közötti összefüggések jobb megértése új betekintést adna annak megértéséhez, hogy a Calr hogyan befolyásolja a riboszóma biogenezisét és az embrionális sejteket.vesefejlődését, és újszerű nézeteket tesz lehetővé a szervek fejlődését irányító folyamatokról.

4. Anyagok és módszerek

4.1. Állatok

Az azonos C57BL/6J genetikai háttérrel rendelkező kalretikulin heterozigóta (Calr plus // ) és vad típusú (Calr plus / plus) alomtárs egereket Marek Michalak professzortól szereztük be, Alberta Egyetem, Edmonton, Alberta, Kanada. Az egereket specifikus kórokozó-mentes tartási körülmények között tenyésztettük, és genotipizáltuk a korábban Michalak és mtsai. [15]. Vizsgálatunkhoz vemhes Calr plus // egereket áldoztunk le az embrionális fejlődés különböző szakaszaiban (embrionális napok 13.5: E13.5; 14.5: E14.5; és 16.5: E16.5), az embriókat begyűjtöttük, és avesefelboncolták. A genotipizáláshoz az embrió farkának egy darabját használtuk. Azvesetovább készültek vagy hisztokémiai festésre, vagy transzkriptomikai vagy proteomikai analízisre. Minden kísérleti eljárást a német állatgondozási és etikai jogszabályoknak (NIH szabványok) megfelelően hajtottak végre, és a németországi Göttingeni Egyetemi Orvosi Központ helyi etikai bizottsága hagyta jóvá (33.14-42502-04-11/0598).

A CISTANCHE JAVÍTJA A VESE-/VESEFÁJDALÁST

4.2. Hisztokémiai festés

Az embrionális szövettani festéshezvese, a kimetszettveseéjszakán át fixáltuk 4%-os pufferolt formaldehid-oldatban, majd paraffintömbökbe ágyaztuk. A paraffinba ágyazott metszeteket paraffinmentesítettük, rehidratáltuk és hematoxilin Gill III oldattal és eozin Y oldattal (Merck, Darmstadt, Németország) festettük a gyártó protokollja szerint.

4.3. Az embrionális vese ex-vivo szervkultúrája

Az ex vivo szervtenyésztést Davies és munkatársai [43] szerint végeztük. A terhes egereket az embrionális fejlődés E13.5 szakaszában leöltük, az embriókat begyűjtöttük, és avesefelboncolták. A genotipizálás után 6veseminden genotípus (Calr plus / plus , Calr plus // és Calr/ ) kezdetleges elemeit 0.4 µM pórusméretű átlátszó PET membránra szélesztettük (24 lyuk, BD Falcon). A membránt egy 24 lyukú lemez egyik üregébe helyeztük, amely 400 µl-t tartalmazottvesetáptalaj (KCM, DMEM, 10% inaktivált FCS). Ez lehetővé tette avesehogy kapcsolatba lépjen a médiummal anélkül, hogy megfulladna. Ilyen feltételek mellett meg lehetett tartani avese37 ◦C-on és 5 százalékos CO2-on tenyésztették legalább 144 órán keresztül.

4.4. A tenyésztett vesék immunfluoreszcens festése és a vesemetszetek immunhisztológiai analízise

Az embrionálisveseex vivo tenyésztettük 72 órán keresztül, ezt követően avesea rudimentumokat hideg metanolban fixáltuk t 20 ◦C-on 30 percig. A rögzítési lépést 3 mosási lépés követte, amelyek mindegyike 5 percig PBS-ben zajlott. Az elsődleges antitest nyúl monoklonális anti-laminin antitestet (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) PBS-ben hígítottuk, és egy éjszakán át 4 ◦C-on inkubáltuk. A kulturáltveseA rudimenteket 4 órán át PBS-ben mostuk, és a másodlagos antitestet (Molecular Probes Alexa Fluor 555 kecske anti-nyúl IgG (1:500)) adtuk hozzá egy éjszakán át 4 °C-on. Az UB-t lectin Dolichos biflflorus agglutinin (DBA) segítségével festettük legalább 3 órán át. Az inkubáció után avesePBS-ben mostuk 3 órán át, és beágyaztuk a mikroszkópos elemzéshez. Paraffinmentesített és rehidratált embrionális immunfestésvesemetszeteket végeztünk számos fehérje expressziójának és eloszlásának kimutatására. A metszeteket ételpárolóban 25 percig előmelegített antigén-visszanyerő oldattal (1,8 µM citromsav és 8,2 µM nátrium-citrát) kezeltük. A metszeteket 10%-os kecskeszérummal blokkoltuk PBS-ben 1 órán át, majd egy éjszakán át 4 ◦C-on inkubáltuk az elsődleges antitestekkel (A következő elsődleges antitesteket használtuk: nyúl monoklonális anti-Calbindin-1, anti-Wt1, anti- Six2, anti-Pax2, anti-Calr (Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság), nyúl monoklonális anti-Rps6, antiRps10 (Invitrogen) és nyúl monoklonális anti-Sod1 antitest (Abnova, Taipei, Tajvan) Az elsődleges antitesteket fluoreszcenciával detektáltuk jelölt másodlagos antitestek (Molecular Probes Alexa Fluor 555 kecske anti-egér IgG antitest és Alexa Fluor 555 kecske anti-nyúl IgG) 1 órán át szobahőmérsékleten. A negatív kontrollokhoz a szövetmetszeteket csak a másodlagos antitesttel inkubáltuk. A tárgylemezeket felhelyeztük fedőlemezekkel Vectashield rögzítőközegben DAPI-val a magok ellenfestésére (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA).

4.5. Sejtkultúra

Madin–Darby kutyaveseAz (MDCK) sejteket az American Type Culture Collection-től (ATCC) szereztük be, és Dulbecco's Modifified Eagle's Medium (DMEM), 10% magzati szarvasmarha szérum (FBS), 1% penicillin/sztreptomicin és 1% L-glutamin tartalmú táptalajban szaporították 37 °C-on. 5 százalékos CO2-atmoszférában. A sejteket T25-ös lombikokban tenyésztjük, és egy héten belül kétszer hasítjuk. A sejtpasszírozáshoz az MDCK sejteket rövid ideig tripszineztük, hogy elkerüljük a sejtszerkezet megváltozását.

4.6. Knockout sejtek generálása

A Canis lupus fajok Calr (XM8622117) sgRNS-szekvenciáját a BlueHeronBio online eszközzel (Origene, Herford, Németország) tervezték. Az sgRNS 50 GTAGATGGCGGGTTCGGCAG 30 szekvenciát BamHI és BsmBI restrikciós enzimekkel inszertáltuk a pLenti-Cas-Guide plazmidba (Addgene plazmidok #3931646), hogy létrehozzuk a pLenti-Cas9- Calr konstrukciót, amelyet később megerősített a Sanger szekvencia. A Carl MDCK sejtekben történő kiütése érdekében pLenti-Cas9-Calr tranziens transzfekciót végeztünk. Egy nappal a transzfekció előtt 200,{11}} sejt/ml mennyiséget oltottunk 6 lyukú lemezekre MEM táptalajjal. A transzfekció előtt a tápközeget FCS-mentes Opti-MEM táptalajra cseréltük. A sejtek transzfektálásához Lipofectamine 2000-et (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) használtunk. A lipofektamin plazmid DNS keveréket OptiMEM-mel készítettük az oktatói protokoll alapján. A 6 lyukú lemez transzfekciójához 4 µg plazmid DNS-t adtunk 250 µl Opti-MEM tápközeghez külön, és 10 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Ezt követően a DNS-elegyet hozzáadtuk a Lipofectamine 2000 keverékhez, és 30 percig inkubáltuk, mielőtt a sejtekhez adtuk. A transzfekció sikerességét Western blot segítségével értékeltük.

4.7. Átiratelemzés

A transzkripciós vizsgálatokhoz 3 vemhes Calr plus // egeret használtunk. Az embriókat (8-10/terhes egér) begyűjtöttük, és aveseelszigeteltek voltak. A genotipizálás utánveseazonos genotípusból és ugyanabból az anyából származó anyagokat egyesítettük és RNS-kivonás céljából feldolgoztuk. Az összes RNS-t a Calr plus/plus, a Calr plus // és a Calr/embrionális sejtekből izoláltuk.veseTrizol (Invitrogen) módszerrel a gyártó ajánlásai szerint. A mintákat ezután DNSse I-gyel (Sigma) kezeltük, hogy eltávolítsuk a DNS-szennyeződést. Az RNS minőségét az Agilent 21{{10}}0 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) mikrofluidikus elektroforézissel állapítottuk meg. A szekvenáláshoz az RNS-mintákat a "TruSeq RNA Sample Prep Kit" segítségével készítettük elő a gyártó protokollja szerint (Illumina, San Diego, CA, USA). Az egyszeri leolvasású (50 bp) szekvenálást HiSeq 2000 (Illumina, San Diego, CA, USA) segítségével végeztük. A szekvenciákat a Mus Muscullus genom referenciaszekvenciájához igazították (Ensembl genome assembly 3.2.1; https://www.ensembl.org/info/genome/genebuild/assembly. html, elérve 2021. március 24-én) a STAR illesztés segítségével szoftver (Cold Spring Labaro tory, Cold Spring Harbor, USA) (2.3.0e verzió, https://github.com/alexdobin/STAR, elérve 2021. március 24-én) [44], amely 50 bázison belül 2 eltérést tesz lehetővé. Az egyedi találatok szűrésére és számlálására a SAMtools csomagot (0.1.18-as verzió) és a HTSeq-et (0.6.1p1-es verzió) használtuk [45,46]. A jelölt géneket a minimális 2-szeres változásra és az FDR-korrigált p-értékre 0,05-nél kisebb értékre szűrtük. A génannotációt az Ensembl v78 (www.ensembl.org, 2019. március 1-jén elérhető) Mus Muscullus segítségével végeztük a biomaRt csomagon keresztül (2.24.0 verzió) [47]. A jelölt gének GO-dúsítási analízisét a Goseq csomaggal (1.2-es verzió) [48] végeztük standard paraméterek használatával.

4.8. Veselízis, fehérjekivonás és kétdimenziós gélelektroforézis (2-DE)

A 2D gélelektroforézishez 6 vemhes Calr plus // nőstény (8-10 embrió/nő) embrióit használtuk. A 2D gélelektroforézishez (2-DE) szolgáló fehérje extrakcióhoz aveseaz azonos embrionális stádiumban lévő, azonos genotípusú embriókból és nőstényekből (8-10 embrió/terhes nőstény) származó embriókat egyesítettük, lízispufferrel (9,5 M karbamid, 2% CHAPS (w/v), 2% amfolit (w) feltártuk. /v), 1 százalék DTT), és vortexeljük. A lízispuffer hozzáadása után a mintákat 4 ◦C-on 30 percig inkubáltuk. A sejttörmelék eltávolításához centrifugálást végeztünk 13,000× g-vel és 4 ◦C-on 30 percig. A felülúszót további 30 percig 13,000× g-vel és 4 ◦C-on újra centrifugáltuk a maximális tisztaság elérése érdekében. A felülúszót összegyűjtöttük, a pelleteket eldobtuk, és a kapott mintákat azonnal felhasználtuk vagy –80 ◦C-on tároltuk felhasználásig. A sószennyezettség csökkentése és a fehérjék gazdagítása érdekében Wessel és Flügge [49] szerinti metanol-kloroform kicsapást végeztünk. A pelletet szárítottuk és feloldottuk a lízispufferben. A teljes fehérjekoncentrációt a Bio-Rad protein assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) alkalmazásával határoztuk meg Bradford szerint. Standardként a BSA-t (Sigma, Steinheim, Németország) használtuk. A kísérleti reprodukálhatóság garantálása érdekében mindegyikből háromszoros gélt állítottunk elővesemedence. A 2D fehérje elválasztást a korábban leírtak szerint végeztük [50]. A 2-DE géleket Flamingo fluoreszcens gélfestékkel (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) festettük a gyártó utasításait követve. A festést követően a géleket 50 µm-es felbontással szkenneltük Fuji FLA{5}} szkenneren. A digitalizált képeket Delta 2D 3.4 (Decodon, Braunschweig, Németország) segítségével elemeztük. A fehérje vizualizálásához a 2-DE géleket egy éjszakán át festettük kolloid Coomassie blue, Roti-Blue színnel (Roth, Karlsruhe, Németország).

4.9. Tömegspektrometriás elemzés és fehérje azonosítás

A szignifikánsan szabályozott foltokat kimetsszük a gélekből, és a triptikus in-gél emésztést és a peptid extrakciót Dihazi és mtsai. [51]. Röviden, a gélfoltokat kétszer öblítettük 25 mM ammónium-hidrogén-karbonátban (amBic), majd egyszer vízben, 100 százalékos acetonitrillel (ACN) zsugorítottuk 15 percig, és SpeedVac készülékben szárítottuk (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 20-30 percig. Minden kimetszett foltot 12,5 ng/µl szekvenálási minőségű tripszinnel (Roche Molecular Biochemicals, Basel, CH) inkubáltunk 25 mM amBic-ben egy éjszakán át 37 °C-on. A peptid extrakciót kétszer végeztük először 50% ACN/1% trifluor-ecetsav (TFA), majd 100% ACN alkalmazásával. Az összes kivonatot egyesítettük, és a térfogatot SpeedVac alkalmazásával csökkentettük. A triptikus peptideket tömegspektrometriás szekvenálásnak vetettük alá nanoflflow ESI Z-spray-vel felszerelt Q-TOF Ultima Global tömegspektrométer (Micromass, Manchester, UK) segítségével. A fehérjeazonosítást a Mascot keresőmotorral végeztük MSDB és Swissprot adatbázisok ellen 0,5 Da peptidtömeg- és fragmenstoleranciával.

A CISTANCHE JAVÍTJA A vese-/veseelégtelenséget

4.10. Fehérje extrakció, SDS-PAGE, gél-triptikus emésztés és tömegspektrometriás elemzések

A fehérje változás tömegspektrometriai mennyiségi meghatározásához a Calr/vese, az azonos genotípusból és azonos anyából származó mintákat egyesítettük. Annak érdekében, hogy elegendő készletet hozzunk létre, és biztosítsuk a biológiai és kísérleti replikációt, 6 különböző vemhes Cal plus // 8-10 embrióval/egérrel. Az embrionálisvesea három genotípusból kinyertük az embriókból, és a fehérje extrakciót a fent leírt lízispufferrel végeztük. A fehérjekivonatokat SDS-PAGE-val elválasztottuk, a géleket Coomassie Blue-val festettük, mindegyik sávot kimetszettük és 20 egyenlő méretű szeletekre vágtuk, majd a szeleteket gélben tripszinnel emésztettük. A tömegspektrometriás elemzéshez a mintákat egy öncsomagolt fordított fázisú C18 előoszlopon dúsítottuk (0,15 mm átmérőjű × 20 mm, Reprosil-Pur120 C{{11}). }AQ 5 µm, Dr. Maisch, Ammerbuch-Entringen, Németország), és analitikai fordított fázisú C18 oszlopon (0).075 mm átmérőjű × 200 mm, Reprosil-Pur 120 C{ {21}}AQ, 3 µm, Dr. Maisch) 5–35% acetonitril/0,1% hangyasav (v:v) 30 perces lineáris gradiensével 300 nl percen-1). Az eluenst egy Q Exactive hibrid kvadrupól/orbitrap tömegspektrométeren (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Németország) elemeztük, amely FlexIon nanoSpray forrással volt felszerelve és Excalibur 2.4 szoftverrel működött adatfüggő adatgyűjtési módszerrel. Mindegyik kísérleti ciklus a következő formájú volt: egy teljes MS-vizsgálatot végeztek a 350–1600 m/z tartományban 70-es felbontás mellett,000 az FWHM és az AGC célértéke 106, a maximális kitöltési idő pedig 60 ms . A 2 × 104 intenzitási küszöb feletti töltési állapotok 12 leggyakrabban előforduló peptid-prekurzorát ezután egymást követően 2,0 FWHM-es izolációs szélességben izoláltuk, majd nitrogénnel fragmentáltuk 25 százalékos normalizált ütközési energia beállítás mellett, és a kapott termékion-spektrumot. 17 500 FWHM felbontás mellett rögzítették, és az AGC célértéke 2 × 105 volt, a maximális kitöltési idő pedig 60 ms. A kiválasztott prekurzor m/z értékeket ezután kizártuk a következő 15 másodpercben. Mintánként két technikai ismétlést szereztünk be. A csúcslistákat a nyers adatokból Raw2MSMS v1.17 szoftverrel (Max Planck Institute for Biochemistry, Martinsried, Németország) kinyertük. A fehérje azonosítását a MASCOT 2.5.1 szoftverrel (Matrixscience, London, Egyesült Királyság) végeztük. A fehérjéket azonosították az UniProtKB v2017.09 egérreferenciaproteom (16930 fehérje bejegyzés) ellen, valamint a laboratóriumunkban általában azonosított 51 szennyeződésből álló csoportot. A keresést enzimként tripszin, cisztein blokkoló szerként jódacetamiddal végeztük. Legfeljebb két kihagyott triptikus hasítás és változó módosításként a metionin-oxidáció megengedett volt. A keresési tűréshatárokat 10 ppm-re állítottuk be a prekurzor tömegére és 0,05 Da-ra a töredékek tömegére, és ESI-QUAD-TOF-ot adtunk meg műszertípusként. A Scaffold szoftver 4.8.9-es verzióját (Proteome Software Inc., Portland, OR, USA) használtuk az MS/MS alapú peptid- és fehérjeazonosítások validálására. A peptid azonosítást akkor fogadtuk el, ha a Percolator algoritmussal 95,0 százaléknál nagyobb valószínűséggel állapítható meg. A fehérjeazonosításokat 1 százalékos hamis felfedezési arányra csonkolták legalább 2 magabiztosan azonosított peptid esetében. A hasonló peptideket tartalmazó, és az MS/MS analízis alapján nem megkülönböztethető fehérje találatokat csoportosítottuk, hogy megfeleljenek a szűkösség elvének. A jelentős peptid-evidenciával rendelkező fehérjéket klaszterekbe csoportosították. A fehérje mennyiségét spektrális számuk alapján becsülték meg, miután az összes ismétlés között normalizálták a teljes összeget.

4.11. Western Blot analízis

A Western blot analízist Towbin és mtsai. [52]. Poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) azonos mennyiségű fehérjét választottunk el (5{11}}–75 µg), és nitrocellulóz membránra vittük át (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Egyesült Királyság). A membránokat 5%-os zsírmentes száraz tejben blokkoltuk TBST-pufferben (20 mM Tris-HCl, pH 7.{10}} mM NaCl 0,1% Tween 20), és elsődleges antitestekkel (anti-Calr, anti) inkubáltuk. -Rps10, anti-Rps19, anti-Rps26 és anti-eIF5A) egy éjszakán át 4 ◦C-on. A fehérjesávok megjelenítéséhez fluoreszcenciával jelölt másodlagos antitesteket használtunk. Az egyenlő fehérjeterhelés megerősítése érdekében a blotokat anti-Actb vagy anti-GAPDH antitestekkel kezeltük (Sigma, Taufkirchen, Németország).

4.12. Bioinformatika

Az azonosított fehérjék osztályozását főként ismert és feltételezett funkcióik szerint a DAVID bioinformatika segítségével végeztük (http://david.abcc. ncifcrf.gov, hozzáférés 2019. február 21-én) [53,54]. Génszimbólumokat használtunk a génontológia (GO) annotációk (biológiai folyamatok és molekuláris funkciók) vizsgálatára és kategorizálására. Az azonosított fehérjék ismert és előre jelzett fehérje-fehérje kölcsönhatásainak hálózati elemzését a STRING (Search tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins) segítségével végeztük [55].

4.13. Statisztikai analízis

A {{0}}DE esetében a digitalizált képeket elemeztük, és a gélek között pontegyeztetést végeztünk, majd a normalizálást Delta2D 3.4 (Decodon, Braunschweig, Németország) segítségével végeztük. A Delta2D minden észlelt folthoz kiszámol egy „foltminőség” értéket. Ez az érték azt mutatja, hogy egy folt mennyire pontosan reprezentálja az "ideális" 3D Gauss-harang alakzatot. Az átlagos folttérfogat arány alapján azokat a foltokat tekintettük szignifikánsnak, amelyek relatív expressziója legalább 2--szeresére változott (növekedés vagy csökkenés) háromszor az összehasonlított minták között. A fehérjeszabályozás szignifikanciájának elemzésére Student-féle t-próbát végeztünk, és statisztikai szignifikanciát feltételeztünk 0,05-nél kisebb P értékek esetén. Az összes blot mennyiségét az ImageJ szoftverrel határoztuk meg. Az adatokat a GraphPad Prism 8-as verziójú szoftvercsomaggal (San Diego, CA, USA) állítottuk össze. A szoftvert grafikus megjelenítésre és elemzésre használták Student-féle t-eloszlás vagy egyirányú ANOVA segítségével. Az eredményeket legalább három független kísérlet átlag ± sd értékében adjuk meg. A különbségeket akkor tekintettük statisztikailag szignifikánsnak, ha p < 0,05.="" a="" húgyúti="" rügyvégeket="" és="" a="" nefronokat="" manuálisan="" megszámoltuk,="" és="" az="" adatokat="" a="" graphpad="" prism="" 8-as="" verziójú="" szoftvercsomaggal="" állítottuk="">