5. fejezet Az enzim aktivitásának változásai az enzim fermentációja során

5. fejezet Az enzim aktivitásának változásai az enzim fermentációja során

 

Proteáz, lipáz ésszuperoxid diszmutáz (SOD)a fő funkcionális enzimekmikrobiális enzim egészségügyi ételek- Köztük,proteázszerepet játszikA fehérje hidrolízisének előmozdítása az élelmiszerbenaz emberi testben. Ezenkívül lebonthatja néhány haldokló cellát, eltávolíthatja a szennyeződéseket a bőr felületén és a pórusokon, és szerepet játszhat a hámlasztásban, így széles körben használják a fürdőtermékekben. A lipáz a zsírsavak és a glicerin közötti észterkötésre hat, és a hidrolízis szubsztrát általában természetes olajok. Ezért sok súlycsökkentő élelmiszerben és egészségügyi termékben látható. Sok nőt rendkívül aggasztja a fogyás témája, ezért az enzimek gyorsan népszerűvé váltak az egész világon.Az enzimek gazdagok lipázban, ami azt jelenti, hogy magas kutatási értékkel és alkalmazási kilátásokkal rendelkeznek.GYEPegy speciális fém enzim, amely katalizálja a dekorációs reakciótszuperoxid anion radikálisok, ezáltalA szuperoxid anion radikálisok eltávolításaa testben. Ez egy védőgát az organizmusok számára, tehát széles körben használják az orvosi területen.
Ez a fejezet példaként az Apple enzimet veszi. A fermentáció kezdeti szakaszától kezdve, aA szuperoxid diszmutáz aktivitása, A kísérleti csoportban és a kontrollcsoportban az amiláz, a lipáz, a proteáz és a celluláz 15 naponta megmértük, hogy átfogóan és szisztematikusan tükrözzék az enzimaktivitás változó tendenciáját a teljes fermentációs folyamat során.

Új gyógynövények cistanche

Kattintson a további részletek megszerzéséhez

 

A Wecistanche-a Kína legnagyobb cistanche exportőre támogató szolgáltatása:
E -mail: wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel: +86 15292862950

 

 

 

 

 

 

5.1 Anyagok és módszerek

5.1.1 Anyagok

(1) Kísérleti anyagok

Mossa meg a friss almát steril vízzel steril körülmények között, szárítsa meg természetesen egy steril műtőasztalon, hámozza meg, és szeletelje őket későbbi használatra. Adjon hozzá fehér cukrot és almát egy sterilizált üvegedényhez, 1: 1 tömeg arányban. Aktiválja a kísérlethez szükséges baktériumokat, és oltja be őket az enzimbe az optimális séma szerint (ezt a műveleti lépést a kontrollcsoport számára kihagyják), lezárja, és helyezze egy hűvös és száraz helyre. 3 hónapos szobahőmérsékletű fermentáció után vegyen be egy mintát a pépből álló teljes enzim folyadék előállításához és szűréséhez. Vegye ki a felülúszót a kísérleti mintaként. Miután a mintát 10, 000 fordulat / perc sebességgel centrifugálják 15 percig nagysebességű centrifugában, a releváns adatok mérésére használják. Érdemes megjegyezni, hogy az enzimek készítésének folyamatában a felesleges szennyeződés elkerülése érdekében minden műveletünket steril körülmények között hajtottuk végre.

(2) Fő eszközök
A kísérlethez szükséges eszközök megegyeznek a 3.1.1 (2) -es.

 

5.1.2 Módszerek

(1) A szuperoxid diszmutáz (SOD) aktivitásának meghatározása [66]
A pirogálol -oldatot 25 fokos állandó hőmérsékletű vízfürdőben előmelegítettük egy ideig. Az 5.1. Táblázat szerint megfelelő mennyiségű puffert, desztillált vizet és azonos mennyiségű sósav- vagy pirogálol -oldatot adtunk a kémcsőhöz. Az állandó hőmérsékleti vízfürdőt 25 fokra állítottuk 2 0 percre. Miután a vegyes folyadékot gyorsan megrázta, azonnal befecskendezték a kóbettába. A minta A0 abszorbancia -értékét 30 másodpercenként mértük 325 nm hullámhosszon spektrofotométerrel.

Tab.5.1 Adja hozzá a szomszédos benzol három fenol reagens mennyiségét az autoxidációs sebesség meghatározásához

 

A SOD aktivitás meghatározásának módszere alapvetően megegyezik a fenti művelettel. Az egyetlen különbség az, hogy a pirogallol hozzáadása előtt {{0}}. 5 ml különböző koncentrációjú enzimminta -oldatot kell hozzáadni. Ugyanakkor ugyanazt a desztillált vizet adunk hozzá. A mért abszorbancia ASOD. A gátlási sebességet és a SOD enzim aktivitását az 5.1 képlet és az 5.2 képlet szerint számoljuk: gátlási sebesség (%)=(△ a 0- △ ASOD)/△ a 0 × 100 (5,1) enzim aktivitás (U/ml) {12} inhibition/50% × v2 × v2 × v2 × v2 × v2 × v2 × v2 × v2 × v2 × v2 × v2 × v2 × v2 × v2 × v2 × v2 × v2 × v2 × v2 × 100 (5.1) (5.2) ahol: a v1 az oldat teljes térfogata, ML; A V2 az enzimminta oldat térfogata, ML; △ A0 a pirogálol auto-oxidációs sebessége; △ ASOD a minta abszorbancia értékének változásának sebessége; n az amiláz aktivitásának hígítási multiplex (2) meghatározása Ez a tanulmány a jód-kar-kolorimetrikus módszert alkalmazta az amiláz aktivitásának meghatározására. A konkrét működési lépések a "Nemzeti klinikai laboratóriumi üzemeltetési eljárásra" vonatkoznak [67]. Elsősorban a következő két pontra oszlik:

 

① Az oldat előkészítése
Pufferolt keményítő oldat ({{0}}. forrás; Pontosan súlya 0,4 g oldható keményítőt, oldjuk fel 10 ml desztillált vízben, egyenletesen keverjük össze és állítsuk be a pasztát; A pasztához beállítva a fenti forrásban lévő oldathoz beállítva a keményítő oldatot, és mossa meg a főzőpoharat, amíg a keményítő teljesen át nem kerül a forrásban lévő vízoldatba. Miután egyenletesen keverjük egy üvegrúddal, hűtsük le szobahőmérsékletre, adjunk hozzá 5 ml -es 37% haj -formaldehid -oldatot, és hígítsuk 1L -re desztillált vízzel. Az oldat pH -értéke 7,0 ± 0,1, és a hűtőszekrénybe helyezi.
Jód -állományoldat (0. 1 mol/L): Pontosan súlya 1,7835 g kálium -jód és 22,5 g kálium -jodid tiszta 500 ml -ben
A főzőpohár lassan és egyenletesen adjon hozzá 4,5 ml -es koncentrált sósavat, folyamatosan keverve a hozzáadási folyamat során, desztillált vízzel hígítják a skálát, és egyenletesen keverjük. Helyezze a hűtőszekrénybe használatra, és tárolja egy barna reagens palackban.
Jód -alkalmazási megoldás ({{0}}.

② Kísérleti működési lépések
Vegye ki az enzimoldatot, és tízszer hígítsa meg fiziológiai sóoldattal, és működjön az 5.2. Táblázat szerint. Keverje össze jól, a spektrofotométer hullámhossza 660 nm, és a kolorimetrikus csésze fényútja 10 mm. Zero desztillált vízzel, és olvassa el az egyes csövek abszorbanciáját. Számítsa ki az amiláz -aktivitást az 5.3 alapszámítási képlet alapján.

 

Tab.5.2 Az amiláz meghatározásának működési lépései

 

(3) A lipáz aktivitás meghatározása

A meghatározási módszert a qb/t {{0}} [68]. A 2% -os enzim -teszt oldatot {0. A lipáz aktivitást a kísérletben felhasznált nátrium -hidroxid térfogata alapján számítottuk ki. A szabály: 7,5 pH -val és 40 fokos környezeti hőmérsékleten 1 ml folyékony enzimoldatú oldat hidrolizálja 1 percig, hogy 1 μmol zsírsavat előállítson, amely egy lipáz aktivitási egység, U/ML -ként kifejezve. Ezután a lipáz aktivitást az 5.4 képlet szerint számítottuk ki: enzimaktivitás (U/ml)=(BA) × C/0,05 × 50 × 1/15 × N=200/3 × (Ba) × C × n (5,4), ahol: b: b a nátrium -hydroxid standard, ml, ml (ba) × c × n) A a nátrium -hidroxid standard oldat mennyisége, amelyet az üres kontrollcsoportban, ML -ben fogyasztanak; C a nátrium -hidroxid standard oldat koncentrációja, mol/L; 0,05 a nátrium -hidroxid standard oldat koncentrációjának konverziós tényezője; Az 50. a nátrium -hidroxid oldat zsírsavtartalma; 15 perc a reakcióidő; n a hígító többszörös.

(4) A proteáz aktivitásának meghatározása

Lásd: GB/T 23527-2009 [69] enyhe módosításokkal.
① A standard görbe előkészítése
Vegyünk 1 ml tirozin -standard oldatot különböző tömegkoncentrációval, amelyek 0, 1 0, 20, 30, 40 és 50 mg/L, és adjunk hozzá 5 ml 0,4 mol/l nátrium -karbonát -oldatot és 1 ml folin reagens oldatot. Reagáljon 20 percig 40 fokos hőmérsékleten. A reakció befejezése után távolítsa el a reakcióoldatot, és mérje meg az oldat abszorbancia értékét 680 nm hullámhosszon spektrofotométer segítségével. Rajzoljon egy tirozin standard görbét a tirozinkoncentrációval, mint a vízszintes tengely és az abszorbancia érték, mint a függőleges tengely.

Új gyógynövények ciszta, erős antioxidáns erővel

② A proteáz aktivitásának meghatározása
Kísérleti csoport: Vegyen be 1 ml kazein oldatot 10 g/l koncentrációval, és egyenletesen keverje össze 1 ml -es minta oldat tesztelésére, és 10 percig reagáljon 40 fokos környezeti hőmérsékleten; Szűrje le és kapja meg a szűrletet állás után, vegye be 1 ml szűrletet, 5 ml nátrium -karbonát -oldatot és 1 ml folin reagenst, egyenletesen keverje össze, és 20 percig reagáljon 40 fokos környezeti hőmérsékleten; Használjon spektrofotométert az oldat abszorbanciaértékének mérésére 680 nm hullámhosszon.
Üres kontrollcsoport: Vegyen be 1 ml -es minta oldatot a teszteléshez, adjon hozzá triklór -ecetsavat, reagáljon a proteáz inaktiválására, és más működési módszerek megegyeznek a kísérleti csoportgal.

Számítsa ki a proteáz aktivitást az 5.5 képlet szerint:
Proteáz aktivitás (U/ml)=ak × 4/10 (5.5), ahol: A az enzimoldat abszorbanciája a kísérleti csoportban; K a tirozin mennyisége, ha az abszorbancia egyenlő 1; A 4 a reakcióoldat teljes térfogata, ML; 10 a reakcióidő, min.

(5) A celluláz aktivitásának meghatározása [70]

A celluláz enzimekben történő aktivitását általában az egy bizonyos mennyiségű enzimoldat által felszabadított glükóz mennyiségével expresszálják. A szűrőpapír módszer alkalmazásának alapelve a celluláz aktivitásának mérésére, hogy a celluláz bonthatja a cellulózt a szűrőpapírban, hogy másodlagos metabolitokat, például glükózt, és a glükóz 3, 5- dinitrosarosicilsavval reagálhat egy sárga komplex kialakításához. Ennek a reakciónak a színe viszonylag fényes, amely jól meghatározhatja a keletkező glükóz és más redukáló cukrok mennyiségét.

 

①3, 5- Dinitrosacilsav kolorimetrikus szer
Pontosan 1 0 g 3, 5- dinitrozicilsav 168-169 fokos olvadási ponttal oldja fel desztillált vízzel, adjunk hozzá 20 g nátrium -hidroxidot és 200 g kálium -nátrium -tartályt, amíg a szilárd anyagot teljes mértékben fel nem oldják, 500 ml -hez desztilláltak, desztilláltak, desztilláltak, desztilláltak, desztilláltak, desztilláltak, desztilláltak, desztilláltak, desztilláltak, desztilláltak, desztilláltak, desztilláltak, desztilláltak, desztilláltak, diltilláltak. 0,5 g vízmentes nátrium -szulfit, folyamatosan keverje össze a hozzáadási folyamat során, amíg az teljesen fel nem oldódik, hagyja abba a melegítést, miután egyenletesen keverjük, szobahőmérsékleten hűtsük le, add át az összes 1000 ml -es térfogatú lombikot, hígítsuk a jelöléshez desztillált vízzel, szobahőmérsékleten helyezzük, szűrjük, szerezzük be a szupernáttort és a tárolást egy barna reagens palackban.②enzimatikus hidrolízis
Pontosan pipetta {{0}}, 0. 5, 1. 5 perc állandó hőmérsékleti vízfürdő után 40 fokos vízfürdőben adjon hozzá 6 darab kromatográfiás szűrőpapírt, amelynek területe 1 × 1 cm2, és azonnal kezdje el az időzítést, hogy a reakcióidő pontos legyen 60 percre. Azonnal térjen át a forrásban lévő vízfürdőbe reakcióhoz 10 percig, és a celluláz elveszíti aktivitását.

 

 

③ Színreakció
Vegye ki az enzimminta -oldatot, adjon hozzá 3 ml 3, 5- dinitrozicilsav -kolorimetrikus águst, amelyet ① -ben készítenek, melegítsük fel a forrásban lévő vízfürdőben 15 percig, vegyük ki, szobahőmérsékleten hűtjük, adjunk hozzá 10 ml desztillált vizet, egyenletesen keverjük össze, használja a spektrofotométert egy 550 nm hullámhosszon, állítsa be az üres kontrollcsoportot nullára, és méri annak mértékét.
④ A glükóz -standard görbe rajzolása
Készítsen egy glükóz -standard oldatot, amelynek pontos koncentrációja van, és használjon desztillált vizet a glükóz -standard oldat előállításához 0, 0. 2, 0. 3 ml 3, 5- dinitrosaricilsav kolorimetrikus águs ① -ben elkészítve a színfejlesztési reakció végrehajtására. Döntse el a standard görbét a glükózkoncentrációval, mint a vízszintes tengely és az abszorbancia, mint a függőleges tengely.
⑤ kalkuláció
Használja az A abszorbancia értéket a színfejlesztés után enzimoldattal, majd számolja ki a glükózkibocsátási mennyiséget a glükóz standard görbe szerint, és számolja ki az 5.6 képlet szerint:
Celluláz aktivitás (u/ ml)=m/ (t · m) (5,6), ahol: m a glükózkioldó mennyiség, UG; t az enzimatikus hidrolízis idő, min; M az enzimtartalom a reakcióban, UG/ML.