1. fejezet: Az OSBPL7-et célzó vegyületek az ABCA1- függő koleszterinkiáramlás növelése, a veseműködés megőrzése a vesebetegség két modelljében
May 13, 2022
További információért:tina.xiang@wecistanche.com
A károsodott sejtkoleszterin kiáramlás kulcsfontosságú tényező a progresszióbanvese-, szív- és érrendszeri, ésautoimmun betegség. Itt ismertetjük az 5-aril-nikotinamid vegyületek egy osztályát, amelyeket fenotípusos gyógyszerkutatással azonosítottak, és amelyek az oxiszterolkötő fehérjeszerű 7 (OSBPL7) megcélzásával fokozzák az ABCA1--függő koleszterinkiáramlást. Az OSBPL7-et ezeknek a vegyületeknek a molekuláris célpontjaként azonosították kémiai biológiai megközelítéssel, fotoaktiválható 5-aril-nikotinamid-származékok felhasználásával egy celluláris térhálósító/immunprecipitációs vizsgálatban. Két vegyület (Cpd A és Cpd G) további értékelése kimutatta, hogy in vitro ABCA1-et és koleszterin kiáramlást indukáltak a podocitákból, és normalizálták a proteinuriát, és megakadályozták a vesefunkció hanyatlását proteinurikus vesebetegség egérmodelljeiben: Adriamycin-indukálta nephropathia és Alport-szindróma. Összefoglalva, megmutatjuk, hogy az OSBPL7-et célzó kis molekulájú gyógyszerek alternatív mechanizmust tárnak fel az ABCA1 felszabályozására, és ígéretes új terápiás stratégiát jelenthetnek a vesebetegségek és a sejtes koleszterin homeosztázis egyéb rendellenességeinek kezelésére.
Krónikus vesebetegség (CKD) jelentős egészségügyi teher az Egyesült Államokban, amely több mint 30 millió embert érint. Jelentős előrelépés történt a CKD progressziójának lassításában az angiotenzin-konvertáló enzim-gátlók (ACEi) és az angiotenzinreceptor-blokkolók (ARB-k), valamint a 2-es típusú nátrium-glükóz kotranszporter-gátlók (SGLT2i) bevezetése révén. Sok krónikus vesebetegségben szenvedő beteg azonban még mindig végstádiumú vesebetegségbe (ESRD) fejlődik2-6. Jelentős kutatási erőfeszítések folynak a CKD kezelésének javítására. Elterjedt az új betegség-specifikus célpontok és a korai beavatkozást lehetővé tevő új gyógyszerek azonosítása (pl. diabéteszes vesebetegség), valamint ritkábban.vesebetegségek(pl. fokális szegmentális glomerulosclerosis és Alport-szindróma), kívánatosak.
Mi és mások kimutattuk, hogy a lipidek, például a koleszterin, glomeruláris felhalmozódása diabéteszes vesebetegségben (DKD)7-1l, fokális szegmentális glomerulosclerosisban (FSGS)12-14, valamint Alport-szindrómában (AS)13 és Az ATP-kötő kazettás transzporter (ABC Al) által közvetített koleszterin kiáramlás csökkenésével jár. Azt is kimutattuk, hogy az ABCA1 genetikai túlzott expressziója megmenti az egereket az FSGS-típusú glomerulosclerosistól4, és hogy a podocita-specifikus ABCA1 hiány rontja a kísérleti DKD-t. Nemrég beszámoltunk arról, hogy a koleszterin glomerulusok ciklodextrinnel történő kimerítése szintén renoprotektív a DKD9, FSGSl3, 14 és AS13 modellekben. Bár védő hatású, a ciklodextrin meglehetősen szelektív módon elősegíti a koleszterin eltávolítását, és a beadás módja (azaz parenterális) kényelmetlen. Ezek az adatok együttesen alternatív megközelítéseket javasolnak az ABCA{14}}közvetített koleszterin-kiáramlás felszabályozására, és hatékony kezelést kínálhatnak az FSGS és más vesebetegségek kezelésére.
Kimutatták, hogy korábbi vegyületek, mint például a T1317 és a GW3965, a máj-X-receptorok (LXR) agonistái, szignifikánsan indukálják az ABCal mRNS expresszióját és elősegítik a sejt koleszterin kiáramlását a lipoproteinekbe5-17. Vesebetegségben az LXR agonisták javítják a sejtek koleszterintranszportját, és tompítják a gyulladásos válaszokat a közepesen súlyos vagy súlyos CKD18-ban szenvedő betegek lipoproteineknek kitett makrofágokban. Cukorbeteg egerekben az LXR agonisták csökkentik a proteinuriát,vesegyulladásés a vese glomeruláris koleszterintartalmát az ABCA19-21 növelésével. Sajnos az LXR agonistáknak megvan az a nem kívánt hatása, hogy növelik a plazma és a máj trigliceridszintjét, ami meghiúsította a klinikai fejlődést22.
Ebben a munkában egy fenotípusos gyógyszerkutatási (PDD) kezdeményezés eredményeit ismertetjük, amely az ABCA1 kis molekulájú induktorainak (5-aril-nikotinamidok) osztályának azonosításához vezetett. A kémiai biológia felhasználásával végzett céldekonvolúció az oxiszterolkötő fehérjeszerű 7 (OSBPL7) azonosításához vezetett molekuláris célpontként. A homológia modellezés és a ligandum dokkolás azt mutatja, hogy a vegyületek közvetlenül kölcsönhatásba lépnek a megjósolt szterinkötő zsebbel. A további optimalizálás az A(Cpd A) és G(Cpd G) vegyületek azonosításához vezetett, amelyek alkalmasak in vivo tesztelésre. Mind a Cpd A, mind a Cpd G növeli a plazma membrán ABCA-t a tenyésztett humán podocitákban, és jelentősen növeli az ABCA{7}}függő koleszterin kiáramlást. A proteinurikus vesebetegség (adriamicin által kiváltott nephropathia és Alport-szindróma) egérmodelljein végzett hatékonysági vizsgálat kimutatta, hogy a Cpds A és G normalizálja a proteinuriát, és jelentősen csökkenti a vesefibrózist és a vesefunkció hanyatlását. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az OSBPL7-et célzó kis molekulájú gyógyszerek alternatív megközelítést kínálnak az ABCAl aktivitás fokozására, és hatékony, biztonságos új terápiás stratégiát jelenthetnek a vesebetegségek kezelésére.
Eredmények
Az 5-aril-nikotinamidok, mint az ABCA1 indukálóinak felfedezése. Fenotípusos szűrést végeztünk koleszterinnel töltött humán makrofágok (THP1 sejtek) felhasználásával, hogy azonosítsuk azokat a vegyületeket, amelyek képesek stimulálni a koleszterin kiáramlását az extracelluláris apoAI-ba. Új ólomsorozatot azonosítottunk, amelyet az 5-aril-nikotinamid H(Cpd H) vegyület képvisel. A Cpd H növelte a radioaktívan jelölt koleszterin kiáramlását leghatékonyabban a lipidszegény HDL-hez (HDL3) vagy az apoAI-hoz, ami arra utal, hogy a hatást az ABCA1 közvetíti (la ábra). A Cpd H az 1-es típusú kannabinoid receptor (CB1R) antagonisták korábbi gyógyszerkutatási programjából származik, anyagcserezavarok kezelésére23. Szerkezete és a CB1R-hez való kötődési képessége az 1. kiegészítő ábrán és az 1. kiegészítő táblázaton látható.
Efflux kísérleteket végeztek egy Tangier-betegségben24 szenvedő egyén fibroblasztjain, amely az ABCA1 genetikai elvesztése által okozott szindróma. Mind az 5-aril-nikotinamidok, a Cpd H és Cpd J, mind a T1317 LXR agonista képesek voltak növelni a koleszterin kiáramlását az apoAI-ba a normál, de nem az ABCA{4}}hiányos fibroblasztokból, ami az ABCA1 abszolút szükségességét mutatja. (1b. ábra). Az 5-arynikotinamiddal és T1317-tel kezelt humán THP1 makrofágokból származó lizátumok Western-blotja azt mutatta, hogy minden ágens növelte a celluláris ABCAl fehérjét (lc. ábra). A valós idejű kvantitatív PCR (RT-qPCR) kimutatta, hogy a T1317 ~5--szeresére növelte az ABCAl mRNS-t (1d. ábra), míg ezzel szemben a Cpd H és Cpd J 25 uM-ig nem mutatott hatást. Ezek az adatok együttesen azt mutatják, hogy az 5-aril-nikotinamidok nem transzkripciós mechanizmus révén fokozzák az ABCA1 fehérje és a koleszterin kiáramlását.
Az OSBPL7 azonosítása az 5-aril-nikotinamidok célpontjaként. Feltételeztük, hogy a Cpd H ABCAl-t indukáló aktivitása a célon kívüli hatás lehet a nem rokon CB1R ligandumok ABCAl aktivitásának hiánya miatt. A céldekonvolúcióhoz a Cpd H egy fotoaktiválható azid funkciós csoportot tartalmazó származékát szintetizáltuk, és kiértékeltük a koleszterin kiáramlási aktivitását. Ez a származék: Cpd K (5-(4-azido-3-klórfenil)-6-(ciklopropilmetoxi)-N-[(1R,2R)-2-hidroxiciklohexil]{ {11}}piridin-karboxamid), ugyanolyan aktív volt, mint a Cpd H az ABCA1 efflux szabályozásában in vitro (2a. ábra), de több mint 200--szeresére csökkent a hCB1R iránti affinitása. A Cpd K azid csoportja lehetővé teszi, hogy kovalensen térhálósodjon a lizin maradékokkal UV fény hatására. A Cpd K-t próbaként alkalmaztuk fehérje célpont(ok) azonosítására.
A jelölt célpontok azonosításához először globális szűrést végeztünk összetett rögzítő tömegspektrometriával (CC-MS). A CC-MS által azonosított fehérjéket más jelöltek hozzáadásával dolgozták ki az ABCA1 útvonalban való részvételük valószínűsíthetősége alapján, ami hatvankilenc érdekes célponthoz vezetett. Olyan plazmidokat kaptunk, amelyek mindegyike teljes hosszúságú fehérjeként expresszálódik C-terminális FLAG címkével. A plazmidokat egyenként transzfektáltuk HEK293 sejtekbe, majd 3H-Cpd K jelenlétében inkubáltuk, majd in situ UV-keresztkötést végeztünk, sejtlizátumokat állítottunk elő, immunprecipitációt anti-FLAG antitesttel, majd párhuzamos Western blottal a fehérje expresszió megerősítésére. és autoradiográfiával a3H-Cpd K kötődés értékelésére (2b. ábra). Negyvenkilenc jelöltet, beleértve magát az ABCAl-t is, kizártuk az első szűrés során, mivel nem volt térhálósodás 5H-Cpd K-val (2c. ábra). Nyolc jelölt kapott pozitív kölcsönhatást a Cpd K-vel. Ezek közé tartozott az OSBPL7, CB1R, SCARB1, CAV1, ABCG4, ELOV1, TSPO és STT3A (2c. ábra). Annak értékelésére, hogy a3H-Cpd Kbinding specifikus volt-e, kompetíciós kísérleteket végeztünk térhálósítással. a jelöletlen Cpd K 50-szeres feleslege jelenlétében. A jelöletlen Cpd K hatékonyan versengett a 3H-Cpd K OSBPL7-hez és CB1R-hez való kötődéséért, a másik hat jelölthez azonban nem, így nem specifikus kötőanyagként kiküszöbölte őket. Megismételtük a kísérletet annak meghatározására, hogy a Cpd A és Cpd G, amelyek egyaránt hatékonyan indukálják az ABCAl-függő koleszterin kiáramlást, versengenek-e a3H Cpd K OSBPL7-hez való kötődéséért. Mind a Cpd A, mind a Cpd G hatékony versenytárs volt, ami azt jelzi, hogy az OSBPL7-tel is kölcsönhatásba lépnek (2d. ábra, 2. kiegészítő ábra). Az OSBPL7-be vetett bizalom növelése érdekében egy harmadik szűrőt adtunk hozzá 12 szerkezetileg hasonló molekula és rimonabant (Cpds A, G, H, J, K, L, M, N, P, Q, R, S) értékelésével. ). A vegyületek közül hétről kimutatták, hogy fokozza az ABCAl által közvetített koleszterin kiáramlást, míg a másik öt és a rimonabant inaktív volt (3a. ábra). Azt találtuk, hogy ezeknek a molekuláknak az ABCA-kiáramlást stimuláló aktivitása korrelált a 3H-Cpd K OSBPL7-hez való kötődéséért való versengési képességükkel. Ez a pozitív „aktivitás-aktivitás” kapcsolat az OBPL7 kötődése és az ABC Al-aktivitás fokozása között a kompetitív vizsgálatban, erősen arra utal, hogy az OSBPL7 a farmakológiailag releváns célpontja ezeknek az ABCal-indukáló kis molekuláknak.
A potential contribution of CBIR remained, however, rimonabant, a structurally unrelated CBIR antagonist, did not induce ABCAl cholesterol efflux (Fig. 3a; Fig. 4a). Several other CBIR agonists/antagonists including AM251, WIN55-212-2, and arachidonic choloroethylamine (ACEA), were also inactive (Fig. 4a). Cpd A and Cpd G carried forward into animal studies, were active to induce ABCAl and to compete for Cpd K binding to OSBPL7, but had either no(Cpd A; Ki hCBIR=>10,000 nM) vagy alacsony (Cpd G; Ki hCBIR=13,20 nM) kötési affinitás a CB1R-hez (2d. és 3a. ábra).
SiRNS leütési kísérleteket végeztünk. Az OSBPL7 siRNS transzfekciója kb. 60%-kal csökkentette az mRNS-t, ami jelentős, 50%-os koleszterinkiáramlás növekedést serkentett (4b. és d. ábra). Ezzel szemben a CBIR elnémítása ~80 százalékkal csökkentette az mRNS-t, de nem volt hatással a koleszterin kiáramlásra, és nem befolyásolta a Cpd G aktivitását (4c-e. ábra). Ezek az adatok megerősítik az OSBPL7 szerepét, és kizárják a CBIR-t az 5-aril-nikotinamidok koleszterin-efflux aktivitásának közvetítésében.
A homológia modellezés azt mutatja, hogy az OSBPL7 kötőzsebét elfoglaló vegyületek vannak. Az oxiszterolkötő fehérjével rokon fehérjék, beleértve az OSBPL7-et is, erősen konzervált oxiszterol szabályozó domént (ORD) tartalmaznak a karboxi-terminálisukon2526. A ligandumkötő zseb előrejelzése érdekében elkészítettük az OSBPL7 homológia modelljét (UNIPROT: Q9BZF2) a SWISS-MODEL webszerver27 (3c. ábra). Az emberi ORP{11}}ORD kristályszerkezete a koleszterinnel komplexben 42,5 százalékos homológiát mutat, és sablonként használták28. Az előzetes modellt először a molekuláris modellező csomag segítségével minimalizálták, hogy eltávolítsák az esetleges atomütközéseket, majd optimalizálták a dokkolási számítások elvégzésére a Schrodinger molekuláris modellezési programcsomagon belüli "fehérje előkészítő varázsló" segédprogramjával29.30. Ez a megközelítés biztosította a megfelelő számú hidrogénatom jelenlétét, az összes atom azonosítását, a fehérje hiányzó, modellezhetetlen részeinek kimutatását, és végül az összes aminosav megfelelő protonálódási állapotának hozzárendelését.
A modell alapján azonosítottuk azokat a kulcsfontosságú aminosav-maradékokat, amelyek várhatóan az OSBPL7 ligandumkötő zsebébe illeszkednek, és bevezettünk egy sor egyedi mutációt. Mindegyik mutánst sejtekbe transzfektáltuk, és teszteltük a 'H-Cpd K-kötést. A 636 lizin alaninná történő mutációja kb. 75%-kal csökkentette a Cpd K OSBPL7-hez való térhálósodását (3b. ábra). Ez azt jelezte, hogy a Cpd K a megjósolt szterinkötő zsebben kötődik, és a Lys636 elengedhetetlen az OSBPL7-tel való kovalens kölcsönhatáshoz. A homológiamodell azt is megjósolja, hogy egy hidrofób béta-lemez szegélyezi a zsebet, amelyet más OSBP-k (Ile641, Val616, Val618 és Lys636) ORD-jaiban konzervált aminosavak határoznak meg. Az Ile641 mutációja Ala-ra csökkentette a Cpd K kötődést; Ez arra utal, hogy a Cpd K a zseb egészét elfoglalja (3b. ábra, 3. kiegészítő ábra és 3c. ábra). A Val616 vagy Val618 helyettesítése Ala-val szintén csökkentette a Cpd K kötést, míg a konzervatív szubsztitúciók, mint például a Val619lle és Ile641Val tolerálhatók (3b., c. ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a K vegyület szorosan kötődik az OSBPL7 előre jelzett szterinkötő zsebébe.
Ezután a ligandumok dinamikus dokkolási szimulációit végeztük az OSBPL7 modellhez a Glide program segítségével (Glide, Schrodinger, LLC, New York, NY, 2019)30. Egy rácsot határoztunk meg egy 30 A-es külső és egy 10 A-es belső dobozzal, amelyek középpontjában az egyes ligandumok állnak, és gyakorlatilag a templáttal együtt kristályosodtak. Mivel a Lys636 kulcsszerepet játszik a Cpd K OSBPL7-hez való kötődésében, ennek a maradéknak az orientációját gondosan elemeztük a Maestro rotamer szelekciós eszközével. Két rotamert találtak a legvalószínűbbnek; az egyik a kötőhely felé, a másik pedig a fehérje belseje felé orientált. Mivel a második orientáció nem tette lehetővé a vegyületekkel való kölcsönhatást, a Lys636 első rotamer állapotát választottuk ki a dokkolási vizsgálatokhoz.
Az összetett dokkolás az extra precíziós eljárással és pontozási funkcióval (GlideScoreXP) történt.. Minden egyes molekula esetében a legjobb dokkolóoldatot azonosítottuk a GlideScore segítségével. Az egyes molekulákra számított kötési energiákat a 3a. ábra mutatja. Az OSBPL7-hez kötődő molekulák átlagos pontszáma -8,2 kcal/mol, míg a fehérjéhez nem vagy rosszul kötődő molekulák átlaga magasabb; -6,8 kcal/mol. Ez azt jelzi, hogy a különböző pózok energiái minőségileg összefoglalják a különböző molekulák kötődési fokát. Az aktív Cpd M kötődése a 3c. ábrán látható (bal oldali panel), míg az R vegyület legjobb pozíciója, amely nem mutatott aktivitást, a 3c. ábrán (jobb oldali panel) látható. Mindkét vegyület egyértelmű T-kation kölcsönhatást vált ki a Lys636-tal. A magasabb GlideScore-ral rendelkező R azonban kevésbé illeszkedik a 4-piridingyűrű metilcsoportja miatt, amely túl közel van a pozitív töltésű Arg550-hez. Összehasonlítottuk az OSBPL7 modellt az ORP1-ORD (oxiszterol felismerési tartomány) szerkezetével is egy koleszterinnel alkotott komplexben (pdb kód 5zm5). Megfigyeltük, hogy az I64 a V712-nek, a K636 pedig az N707-nek felel meg (3d. ábra). Az ORP1-ORD/koleszterin komplex vizuális ellenőrzése azt mutatja, hogy ez a két maradék érintkezik a szubsztrátummal, és különösen az N707 esetében H-kötést képez a koleszterinnel, jelentősen hozzájárulva a kötődéshez. Figyelembe véve a valin és az izoleucin hasonló fizikai-kémiai tulajdonságait, valamint a lizinnek az aszparaginhoz képest megőrzött H-kötését képező képességét, ésszerű az a következtetés, hogy az I641 és a K636 hasonló módon járul hozzá a koleszterin OSBPL7 ORD-hoz való kötődéséhez.
Az 5-aril-nikotinamidok növelik az ABCAL-t a tenyésztett humán podocitákban. Az 5-aril-nikotinamid sorozatból a Cpds A-t és G-t vizsgálták az ABCA-expresszióra és a vese podocitákban a koleszterin-kiáramlásra gyakorolt hatások szempontjából, összehasonlítva az LXR agonistával, a Cpd C-vel. A Cpd C egy erősebb LXR agonista ugyanabba a hexafluor-izopropanol osztályba. molekulák T131731-ként. Az ABCA1 expresszióját Western blot segítségével elemeztük podocitákból származó teljes sejt lizátumokban gyógyszeres kezelés után. A Cpd G ABC Al induktorok (5. ábra bal oldali panel, kiegészítő 4a, c ábra) és Cpd A (5a. ábra jobb oldali panel, 4b, d kiegészítő ábra) jelentősen megnövelték az ABC Al fehérjeszinteket 10 uM, illetve 5 uM koncentrációk mellett. , de kisebb mértékben, mint az LXR agonista, a Cpd C.
Ezután megmértük az apo Al által közvetített koleszterinkiáramlást a podocitákból (5b. ábra). A Cpd G, a Cpd A és a Cpd C mindegyike szignifikánsan növelte az apo Al által közvetített koleszterin kiáramlást 10 μM, 5 μM és 1 μM mellett, megközelítőleg azonos mértékben; 2-fold vs. kezeletlen sejtek. Érdekes módon a Cpd G és Cpd A által kiváltott efflux növekedés hasonló volt az LXR agonista Cpd C által kiváltott növekedéshez, annak ellenére, hogy az utóbbi magasabb szintű teljes sejt ABCAal fehérjét indukált a WB kísérletben (5a. ábra). Sejtfrakcionálási kísérleteket végeztünk az ABCAl szubcelluláris eloszlásának felmérésére a gyógyszeres kezelés után (5c., d. ábra, 5. kiegészítő ábra). Ezek a kísérletek feltárták, hogy az 5-aril-nikotinamidok (Cpds G és A) növelték az ABCAl-t a plazmamembránon (5c. ábra), de az LXR agonistával ellentétben nem növelték az ABCAl mennyiségét a mikroszomális frakciókban (5d. ábra). Az organellumoktól mentes citoszolos frakcióban nem volt kimutatható ABCA (kiegészítő 5. ábra, jobb panel). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a Cpd A és a Cpd G stabilizálhatja az ABCAl-t a plazmamembránon.
Annak a kérdésnek a megválaszolására, hogy az ABC Al és az OSBPL7 fizikailag kölcsönhatásba lépnek-e, koimmunprecipitációt (co-IP) végeztünk úgy, hogy HEK293 sejteket transzfektáltunk olyan plazmidokkal, amelyek konstitutívan túltermelik az OSBPL7-V5 és ABCA1-FLAG-címkézett fehérjéket. . Anti-FLAG gyöngyöket használtunk az ABCAl és a kötött fehérjék immunprecipitálására, amelyeket SDS-PAGE-val választottunk el, és Western blottoltunk antitestekkel az ABCAl és az OSBPL7-V5 kimutatására. Bár mindkét fehérje túlzottan expresszálódott, és sikerült immunprecipitálnunk ABCAl-FLAG-ot, ilyen kísérleti körülmények között nem mutattunk ki OSBPL7-V5-öt (6. kiegészítő ábra).
Az OSBPL7 a vese podocitáiban expresszálódik. Western blot analízist végeztünk humán podocitákból és veseszövetből származó lizátumokon. Azt találtuk, hogy az OSBPL7 jelen van az emberi vesékben és humán podocitákban, valamint más emberi sejtvonalakban (Caco2, HepG2, THP1 és HEK293) (5e. ábra, 7. kiegészítő ábra). A vese keresztmetszeteinek immunfestése kimutatta, hogy az OSBPL7 a vesekéregben expresszálódik, beleértve a glomerulusokat is, ahol kolokalizálódik a szinaptopodinnal, egy podocita-specifikus markerrel (5f. ábra).
A Cpds G és A csökkenti a vesekárosodást az adriamicin által kiváltott nephropathiában. Összességében körülbelül 180 5-aril-nikotinamidot szintetizáltak és értékeltek ki THPI celluláris efflux vizsgálatokban. Ezen molekulák közül a Cpds G-t és A-t választottuk az in vivo vizsgálatokhoz. Ez az ABCAl koleszterin kiáramlási aktivitáson, a patkány és humán máj mikroszómák metabolikus stabilitásán, a citokróm P450 alacsony interakciós potenciálján és a kovalens fehérje kötődési potenciálon alapult. Ezeket az adatokat és a patkány egyszeri dózisú Cpd G farmakokinetikáját az S2 kiegészítő információs táblázat foglalja össze. A Cpd G-t és a Cpd A-t az Adriamycin (ADR) által kiváltott vesebetegség modelljében tesztelték. Az ADR nephropathia proteinurikus vesebetegséget tükröz, és a fokális szegmentális glomerulosclerosis (FSGS) leggyakoribb kísérleti modellje. Az ADR-modell legfontosabb jellemzői a mély proteinuria, a súlycsökkenés és az FSGS-hez hasonló glomeruláris szövettani változások32,3.
Dóziskereső vizsgálatokat végeztünk a hatékonyság előzetes értékelésére és a későbbi vizsgálatokhoz szükséges dózis kiválasztására. Az ADR-fertőzött Balb/c egereket A vagy G vegyülettel kezelték orális szondán keresztül 30mg/kg vagy 100mg/kg naponta egyszer, egy naptól kezdődően. -ADR injekció. Az LXR agonistát, a Cpd C-t 10 mg/kg dózisban alkalmaztuk komparátorként (kiegészítő 8. ábra). A vesekárosodás kiváltására az adriamicint 12 mg/ttkg dózisban adták be. A vizelet albumin-kreatinin arányát (ACR) és a testtömeget az injekció beadását követő 7., 14., 21. és 28. napon határoztuk meg. Az ADR-fertőzött egerek minden időpontban súlyos átmeneti proteinuriát és testtömeg-csökkenést mutattak. Az ACR-értékek szignifikánsan javultak azoknál az állatoknál, amelyeket 30 mg/kg/nap vagy 100 mg/kg/nap Cpd A-val vagy 100 mg/kg Cpd G-vel, és kisebb mértékben 30 mg/kg Cpd G-vel kezeltek (kiegészítő ábra). 8). A vesekéreg metszeteinek immunfluoreszcens mikroszkópos vizsgálata ADR-indukálta glomeruláris degenerációt mutatott ki podocitavesztéssel és az ABC Al expresszió elvesztésével. Mindezeket a hatásokat a Cpd G-vel végzett kezelés megakadályozta (9. kiegészítő ábra). A kísérleti vizsgálat alapján a Cpd A és Cpd G optimális kezelési dózisa 30 mg/kg/nap, illetve 100 mg/kg/nap volt. A második vizsgálatban nagyobb számú állatot használtak, és az albumin-kreatinin arányt 28 nappal a kezelés után határozták meg (6a. ábra). Az előzetes eredményekkel összhangban az ADR-fertőzött egerekben (ADR plusz V) súlyos proteinuria alakult ki. A Cpd A-val (ADR plusz A) (6a. ábra, bal oldali) és még szembetűnőbb a Cpd G-vel (ADR plusz G) (6a. ábra, középen) végzett kezelés 8-szor, illetve 30-szor alacsonyabb ACR-t mutatott, medián IQR mellett. 2,3 (0.{35}}mg albumin/mg kreatinin) a Cpd A esetében és 0,6 (0.{39}},6 mg albumin/mg kreatinin) a Cpd G esetében. A kontroll ADR-fertőzött egerek IQR mediánja 19 (10-72 mg albumin/mg kreatinin). Az LXR agonistával Cpd C kezelt egerek ACR-ben változóbb csökkenést mutattak (6a. ábra, jobbra). A Cpd A (6b. ábra, bal oldalon) és a Cpd G (6b. ábra, középen) szintén jelentősen csökkentette a súlycsökkenést. Az ADR-kihívást követő 28-napok során a hordozó csoportba tartozó egerek testtömegük akár 30 százalékát is elvesztették. Ezzel szemben a Cpd G-t kapott 10 egérből 7 nem mutatott súlycsökkenést, a fennmaradó 3 egérnél csak kismértékű, 5 százalék alatti veszteség (6b. ábra balra). Az LXR agonistának, a Cpd C-nek nem volt jelentős hatása a súlycsökkenés megelőzésére (6b. ábra, jobbra).
Mivel a Cpd G volt a leghatékonyabb a proteinuria és a súlyvesztés csökkentésében, szövettani elemzést végeztünk a vesemetszeteken (6c. ábra). Az ADR-kihívás kiterjedt szövettani elváltozásokat idézett elő, beleértve a nagyfokú fokális és szegmentális glomerulosclerosis kialakulását, amelyet tubuláris mikrociszták, intersticiális gyulladás és mesangialis expanzió kísért (6d. ábra). A Cpd G szignifikánsan csökkentette a globális és szegmentális glomerulosclerosis mértékét, csökkentette a podocita hipertrófiát és hiperpláziát, valamint csökkentette a tubuláris mikrociszták számát és az intersticiális gyulladást (6d. ábra). A Cpd G az ADR által kiváltott gyulladást is tompította, amit a vesekéregben a csökkent IL1 és MCP{5}} tükröz (10. kiegészítő ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a Cpd G rendkívül hatékonyan csökkenti az FSGS jellemzőit, legfőképpen az ACR javulása és az ADR által kiváltott testtömeg-csökkenés megakadályozása révén (6. ábra).
Effects of Cpd G on plasma parameters and renal and liver lipids. Plasma lipids, hematological parameters, and liver trans-aminase levels were evaluated in all groups after 28 days of treatment. No significant differences in plasma total cholesterol or triglycerides were found. However, sporadically high cholesterol levels (>122mg/dL, 99.5th percentile of the healthy control group) were detected in 50% of ADR-challenged animals that received the vehicle,10% that received Cpd A,33% that received Cpd C, and none that received Cpd G (Supplementary Fig. lla, Supplementary Table 3). Hypercholesterolemia was observed only in mice with particularly severe proteinuria (ACR>15 mg albumin/mg kreatinin). A trigliceridszintekben nem figyeltek meg változást (kiegészítő 11b. ábra). A hematokrit, hemoglobin, fehérvérsejtszám, valamint az ALT és AST értékek a 2. kiterjesztett adattáblázatban láthatók. A vérsejtszámban nem észleltünk különbséget. Az adriamicin-kezelés növelte az ALT- és AST-szintet, amelyeket a Cpd G részben gyengített (4. kiegészítő táblázat). A vesekéreg összkoleszterin- és trigliceridtartalma változatlan maradt, bár magasabb trigliceridtartalmat figyeltek meg az LXR agonista Cpd C-t kapó állatok körülbelül 30 százalékánál (kiegészítő 11c, d ábra). A máj össz- és észterezett koleszterin (CE) szintje szintén változatlan maradt az ADR-fertőzött állatokban. (Kiegészítő lle,f ábra). A máj triglicerid-tartalmának az ADR-kihívás miatti csökkenését gyógyszeres kezelés ellensúlyozta. A Cpd A és Cpd C, de a Cpd G nem, növelte a máj trigliceridtartalmát a vivőanyaggal kezelt kontrollokhoz képest (kiegészítő 11g. ábra).
A Cpd G csökkenti a veseelégtelenséget az Alport-szindróma egérmodelljében. A családi szteroidrezisztens FSGS és a CKD egyéb formáinak számos formáját a Col IV gének mutációi okozzák34-36. Nemrég beszámoltunk az ABCAl-expresszió csökkenéséről a Col4a3 knockout egerekből származó glomerulusokban (Col4a3 KO), az AS13 egérmodellje. A Col4a3 knockout egerek nem expresszálnak IV típusú kollagént. Ezeknél az egereknél 4 hetes koruktól kezdve súlyos albuminuria, magas vér karbamid-nitrogén (BUN) és megnövekedett szérum kreatininszint alakul ki, amely gyorsan a végstádiumú vesebetegség (ESRD) felé halad. Az állatok 8 hetes korukra veseelégtelenségben pusztulnak el37.
Cpd G-t (100 mg/kg) vagy vivőanyagot adtunk be Col4a3 KO egereknek naponta, szájszondán keresztül, 4 hetes koruktól kezdve, amikor az egereken először jelentkeztek veseelégtelenség jelei. A kezelést 4 hétig folytattuk, és a túlélő egereket 8 hetes korukban leöltük. Az albuminuria (7a. ábra), a szérum kreatininszint (7b. ábra), a vér karbamid-nitrogénszintje (7c. ábra) és a súlyvesztés mértéke (7d. ábra) szignifikánsan csökkent a Cpd G-vel kezelt Col4a3 KO egerekben. Azoknál az állatoknál, amelyek egy korábbi, azonos elrendezésű vizsgálatból ramiprilt kaptak38, az albuminuria szignifikánsan csökkent azoknál az állatoknál, amelyek Cpd G-t kaptak, és a Cpd G hatása a BUN-ra és a szérum kreatininre nem volt rosszabb, mint a ramipril (12. kiegészítő ábra). A vesemetszetek szövettani analízise szignifikánsan kisebb mezangiális expanziót mutatott ki Cpd G-vel kezelt egerekben (7e., f. ábra). A Cpd G nem volt hatással a szérum koleszterinszintre (kiegészítő 13a ábra), de hajlamos volt csökkenteni a szérum trigliceridszintjét (kiegészítő 13b ábra). A Cpd G nem befolyásolta az összkoleszterin- vagy triglicerid-tartalmat a vesekéregben (kiegészítő 13c, d ábra).
Annak felderítésére, hogy a Cpd G előnyös lehet-e az előrehaladott veseelégtelenségben, mortalitási vizsgálatot végeztünk, amelyben a Cpd G-vel vagy placebóval történő kezelést 6 hetes korban kezdték meg, amikor is jelentős veseelégtelenség fordult elő. Azt találtuk, hogy a Cpd G csökkentette a mortalitást Col4a3 KO egerekben, ami körülbelül 15%-kal hosszabb élettartamot eredményezett a kontrollokhoz képest (7g. ábra).
A Cpd G mindkét betegségmodellben csökkentette a vese koleszterin-észter tartalmát. A glomeruláris koleszterin és a lipid felhalmozódás köztudottan összefüggésbe hozható a vesebetegség progressziójával7-10,12-14 Az ADR-fertőzés után vivőanyagot kapott egerek vesekéregében, de azoknál nem, amelyek Cpd G-t kaptak, a vesekéreg lerakódást mutatott lipidcseppek, különösen a glomerulusokban, és a koleszterin-észter-tartalom jelentős növekedése (8a, b ábra). A megnövekedett koleszterin-észter-tartalom erősen korrelált az albuminuriával (8c. ábra). A Cpd G szintén jelentősen csökkentette a koleszterin-észter-tartalmat Col4a3 KO egerek veséjében (8d. ábra). A vesében a koleszterin-észter csökkenése ellenére a plazma koleszterinszintje nem változott a Col4a3 egerekben, és csak az ADR egerek körülbelül 50%-ában (kiegészítő lla ábra és kiegészítő 13a ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a Cpd G védelmet nyújthat a vesék koleszterin- és lipidtartalmának csökkentésével.
