2. fejezet: A Krϋppel-szerű 15-ös faktor elnyomja a vese glomeruláris mesangiális sejtszaporodását a P53 SUMO1 konjugáció fokozásával

További információért. kapcsolatba lépnitina.xiang@wecistanche.com

3 EREDMÉNY

3.1|KLF15-kötő gének szűrése ChIP-Seq-en keresztül primer vese glomeruláris MC-kben

A KLF15 közvetlen kötőpartner génjeinek azonosítására ChlP-Seq analízist végeztünk, és végül 2478 gént szűrtünk. Ezeknek a géneknek a GO-elemzése a www.uniprot.org webhelyen található eszközzel (1A, B ábra) 1941 génhez kapcsolódó molekuláris funkció kifejezéseket, 1662 génhez kapcsolódó sejtkomponens kifejezéseket és 1766 génhez kapcsolódó biológiai folyamat kifejezéseket tárt fel. Mivel célunk az volt, hogy megtudjuk, hogyan hat a KLF15 az MC-kre, ezért a sejtfolyamatokhoz kapcsolódó génekre összpontosítottunk. Az 1315 sejtfolyamattal kapcsolatos gén közül 74 génről találtak részt a sejtciklus folyamataiban; konkrétan ezek a gének részt vettek a mitotikus sejtciklusban, a sejtciklus fázisátalakulásában és más folyamatokban (1C, D ábra). Ezenkívül elemeztük a növekedésben részt vevő géneket, és megállapítottuk, hogy kapcsolatban állnak a fejlődési növekedéssel, a sejtnövekedéssel és más típusú növekedéssel (1E ábra).

3.2|Különlegesen szabályozott gének szűrése KLF15-túlexpresszáló vese glomeruláris MC-kben SILAC és LC/MS segítségével

A KLF15-öt túltermelő HRMC-k SILAC és LC/MS analízise a szülői sejtekhez képest 1357 fehérje azonosítását eredményezte. A DAVID és az IPA segítségével megszereztük a SILAC által azonosított mennyiségileg meghatározott fehérjék GO doménjeit és gazdagabb útvonalait. Érdekes módon számos fehérje biológiai funkciójával kapcsolatos kifejezés szerepelt a 30 legjobban dúsított GO kifejezés között, beleértve a celluláris aminosav metabolikus folyamat szabályozását, a proteaszóma komplexet, a fehérjekötést, valamint a transzkripciós és transzlációs kifejezéseket, amelyek mindegyike szorosan összefügg ubikvitináció (2A ábra). A 2B. ábra a legjobb 30 jelentősen gazdagodott útvonal kifejezést mutatja. Számos biológiai folyamat kifejezés, köztük a proteaszóma és a neurodegeneratív betegség kifejezés, szintén az ubikvitinációhoz kapcsolódott.

Kattintson, ha többet szeretne tudni rólacistancherészletekkel eladó

3,3|KLF15-kötő gének bioinformatikai elemzése, amelyek potenciálisan kapcsolatba hozhatók a vese glomeruláris MC proliferációjával

A potenciálisan társított KLF{0}}gének felfedezésevese glomerulárisMC proliferáció, a ChIP-Seq adatok és a SILAC-LC/MS adatok bioinformatikai elemzését végeztük. Ötvenkét gént szűrtünk (2. táblázat és 2C. ábra), és ezek közül öt gént, köztük a SUMO1-et, a makrofág migrációt gátló faktort (MIF), az eukarióta iniciációs faktort (EIF), az inzulinszerű növekedési faktort (IGF) és a retikulocalbint (RCN). ), szorosan összefüggteksejtburjánzás. Mivel a differenciálisan expresszált fehérjék GO- és útvonalanalízise arra utalt, hogy a szűrt gének főként az ubiquitinációs folyamathoz kapcsolódnak, arra a következtetésre jutottunk, hogy a SUMO1, az ubiquitin-szerű (UBL) fehérje család tagja, a poszttranszlációs módosulásban vesz részt, hasonlóan az ubikvitináció, mint a KLF15 célgénje.

Egyre több bizonyíték utal arra, hogy a HG a diabéteszes nefropátia kialakulását kiváltó egyik fő tényező, és elősegíti az MC proliferációt és a fokozott mátrixszintézist in vitro.25 Egy korábbi tanulmány kimutatta, hogy a PDGF-BB elengedhetetlen a MC proliferációjához, amely megelőzi a kialakulást. glomerulosclerosis kísérletes glomerulonephritisben.26 Miután megerősítettük, hogy az MC-ket HG vagy PDGF-BB stimulálta in vitro, változásokat észleltünk a KLF15 és SUMO1 expressziójában mind az RNS-ben, mind a fehérjében

szinteket, és megállapították, hogy ezek a molekulák hasonló tendenciákat mutatnak (2D-l ábra). Végül meghatároztuk, hogy a SUMO1 a KLF15 célgénje.

3.4|A KLF15 fokozza a SUMO-1 génexpressziót azáltal, hogy egy 16 bp-os CACCCA-SUMO-1 promoter régióhoz és egy C plusz A-ban gazdag motívumhoz kötődik

A MEME csomagot (http://meme-suite.org/tools/meme) használtuk az 52 szűrt gén KLF15-kötő motívumainak jellemzésére a KLF15 ChlP-Seq adatokból, és azonosítottuk a KLF-kötő motívumot. (3A. ábra). Ezenkívül további több mint ezer bázist elemeztünk a SUMO1 promoter előtt, és azt találtuk, hogy a KLF15 képes felismerni egy 16 bp hosszúságú szekvenciát (-205~-199 nukleotidok) és ahhoz kötődni, beleértve: CACCCA-(3B. ábra). A ChIP-PCR megerősítette, hogy a KLF15 kötődik a SUMO1 promoterhez, és az eredmények szignifikánsan magasabb SUMO1 expressziót mutattak az anti-KLF15 antitest csoportban, mint a háttér kontrollcsoportban (3C. ábra).

Ezenkívül kettős luciferáz riporter vizsgálatot végeztünk a SUMO1 és a KLF15 közötti célzási kapcsolat megerősítésére. A vad típusú SUMO1 promoter csoport nagyobb luciferáz aktivitást mutatott, mint a pGL3 vektor és a mutáns csoportok HRMC-kben, és az aktivitást szignifikánsan növelte a KLF15 túlzott expressziója. A luciferáz aktivitás fokozódását a mutáns promoterrégiót expresszáló plazmiddal való transzfekció megfordította (3D. ábra). Összességében ezek az adatok arra utalnak, hogy a SUMO1 a KLF15 közvetlen transzkripciós célpontja.

3.5 |A P53 szűrése, mint a SUMO1 SUMOilációs szubsztrátja

A SUMO módosítások széles körben kifejezett poszttranszlációs módosítások eukariótákban. Ezeknek a módosulásoknak a szubsztrát fehérjékhez való reverzibilis konjugálását SUMOilációnak is nevezik, amely fontos szerepet játszik a célfehérjék funkcióinak szabályozásában, és részt vesz különféle biológiai folyamatokban, mint például a nukleocitoplazmatikus transzportban, transzkripciós szabályozásban, apoptózisban, fehérje stabilizálásában, stresszválaszokban és A sejtciklus progresszióját.27 A SUMO1-el közvetlenül konjugált downstream jelátviteli molekulák feltárása érdekében a SUMO1 hálózati elemzését végeztük el az IPA adatbázis segítségével, és az adatok azt mutatták, hogy a SUMO1 közvetlenül konjugálhat többek között a P53-hoz, APP-hoz, JUN-hoz és AKT-hoz. fehérjéket (4A-C. ábra). Kezdetben a P53-at választottuk a SUMO1 downstream molekulájaként, mert ez egy jól ismert fehérje, amely szorosan kapcsolódik a sejtproliferációhoz.28.29 Továbbá SUMOsp szoftvert használtunk a P53 különféle fajok lehetséges SUMOilációs szekvenciáinak előrejelzésére, és megállapítottuk, hogy a P53 rendelkezik a SUMOilációs szekvenciával. 4D ábra). Annak megállapítására, hogy a P53 valóban módosult-e a SUMOilációval, átmenetileg transzfektáltuk a HRMC-ket SUMO1 overexpressziós plazmiddal vagy SUMO1 siRNS-sel. Mind az IP, mind a Western blot eredmények feltárták a SUMO1-P53 és P53 expressziós változásainak tendenciáit, amelyek összhangban voltak a változásokkal a SUMO1-ben (4E-J ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a P53 a SUMO1 SUMOilációs szubsztrátja.

3.6|A KLF15 gátolja az MC proliferációt azáltal, hogy elősegíti a SUMO1 expressziót és a P53 SUMOilációt

A P53 SUMOiláció és MC proliferáció KLF15 és SUMO1 általi szabályozásának megállapítása érdekében beavatkoztunk a KLF15 vagy SUMO1 expressziójába HRMC-kben, és a HRMC-ket PDGF-BB-vel kezeltük. A PDGF-BB-vel kezelt HRMC-k közül a KLF15 túlexpressziós plazmiddal transzfektált sejtek magasabb SUMO1-P53, P53, KLF15 és SUMO1 expressziót mutattak, mint a KLF15 kontrollplazmiddal transzfektált sejtek. A SUMO1-P53, P53 és SUMO1 esetében ugyanazokat a változásokat találtuk a SUMO1 túlexpresszióval plazmiddal transzfektált sejtekben, míg a KLF15 expressziója nem változott ezekben a sejtekben (5A-F. ábra). A PDGF-BB az eddig leírt MC-k egyik leghatékonyabb növekedési faktora, és megfigyelték a HRMC-k proliferatív válaszát a PDGF-BB-re. Amint az 5G, H ábrán látható, az EdU-pozitív sejtek százalékos aránya jelentősen megnőtt a rekombináns PDGF-BB beadásával. Az EdU festési eredmények azt mutatták, hogy mind a KLF15, mind a SUMO1 túlzott expressziója gátolta a PDGF-BB által kiváltott sejtproliferációt (5G. ábra, H).

Ahhoz, hogy további betekintést nyerjünk a KLF15 és SUMO1 szerepébe a proliferáló HRMC-kben, csak SUMO1 siRNS-sel transzfektáltuk a sejteket, vagy kotranszfektáltuk őket SUMO1 siRNS-sel és egy KLF15 overexpressziós plazmiddal. A SUMO1 downregulációja nem befolyásolta a KLF15 expresszióját, de a SUMO1-P53 és P53 expressziós szintje nyilvánvalóan csökkent a SUMO1 siRNS transzfekciója után (6A-C ábra). Ezen túlmenően, amikor a SUMO1 expressziója gátolt volt, a SUMO1-P53 és P53 expressziós szintjei is elnyomtak még a KLF15-öt túlzottan expresszáló sejtekben is (6D-F ábra). Ezután az MC proliferációt EdU festési vizsgálattal értékeltük. A SUMO1 RNSi fokozta a PDGF-BBon HRMC-k proliferatív hatását, és a KLF15 overexpressziós plazmiddal és SUMO1 siRNS-sel kotranszfektált csoport több EdU-pozitív sejtet tartalmazott, mint a overexpressziós plazmiddal és a hibrid szekvencia kontroll siRNS-sel kotranszfektált csoportban (6G ábra, H) . Ezért arra a következtetésre jutottunk, hogy a KLF15 elnyomja az MC proliferációt a P53 SUMOiláció fokozásával.

3.7|Globális SUMO1 és P53 expresszió a glomeruláris MC-ben negatívan korrelál a patkány Thy-1 nephritisben előforduló MC proliferációval

Az Anti-Thy1 nephritis az önkorlátozó mesangialis proliferatív glomerulonephritis klasszikus modellje proliferatív és gyógyulási fázissal. Ennek a modellnek a létrehozásához Thy1 antitestet fecskendeztünk Wistar patkányokba. Sem a szérum karbamid-nitrogén, sem a kreatinin nem mutat szignifikáns változást a kontrollpatkányok és a modellpatkányok között (S1. ábra). Jelentős mezangiális proliferációt és ECM-felhalmozódást figyeltek meg a proliferációs fázisban (5. és 7. nap) a modellpatkányokban, és az MC-k száma csökkent a 10. napon a felépülési szakaszban (7A. ábra). A sejtproliferációs marker PCNA expressziós változásait IHC-vel is kimutattuk (7A., B. ábra). A PCNA-szintek az 5. napon emelkedtek, a 7. napon értek csúcsot, és a 10. napon csökkentek (7F. ábra). A Western blot analízis azt mutatta, hogy a P53, SUMO1 és KLF15 fehérje expressziója az izolált glomerulusokban alacsonyabb volt a modellcsoportokban, mint a kontrollcsoportban (7C., D. ábra), ami összhangban van az immunhisztokémiai eredményekkel (7E., F. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az MC-k abnormális proliferációja az anti-Thy1 modell patkányokban a KLF15 és a SUMO1 alacsony szintű expressziójával függ össze. E molekulák expressziójának megzavarása várhatóan enyhíti a patkányok patológiás fenotípusát.

4. MEGBESZÉLÉS

Azglomerulusoka szűrőegységek avese. A glomeruláris funkció zavarát okozhatja primer glomeruláris patológia, vagy másodlagos lehet szisztémás betegségek. A glomeruláris sérülést követően mesangiális változásokat észleltek, beleértve az MC-k hiperproliferációját, amelyet túlzott ECM-termelés (mezangiális expanzió) és a gyulladásos sejtek kemoattraktáns termelése követett. Ezért az MC válaszok modulálása, különösen az abnormális proliferáció, új terápiás megközelítés. A KLF15 egy olyan fehérje, amely specifikus DNS-szekvenciákhoz kötődve szabályozó szerepet játszik transzkripciós faktorként. Számos tanulmány beszámolt arról, hogy a KLF15 részt vesz a sejtproliferáció szabályozásában. Például azt találták, hogy a KLF15 részt vesz az MC proliferációval kapcsolatos jelátviteli útvonalak gátlásában15, 30, de közvetlen célgénjéről nem számoltak be az irodalomban. Ezért ez a tanulmány főként a transzkripciós és transzlációs szintek közös szűrését foglalta magában a KLF15 közvetlen célgénjének azonosítására.

A KLF15 különböző géneket szabályoz különböző fajokban és különböző szövetekben és szervekben. Az MC-k proliferációjának szabályozása során a KLF15 több gén expresszióját befolyásolja, és több útvonalon vesz részt.131,32 A KLF15 közvetlen célgénjeinek feltárásához ChIP-Seg-et használtunk. Klein RH és munkatársai ChlP-seq-et használtak. technológia a KLF7 szaruhártya hámsejtek differenciálódásának vizsgálatára.33 Ying M és munkatársai ezt a technikát használták a KLF9 glioblasztóma pluripotenciájára gyakorolt ​​gátló hatásának tanulmányozására.34 A ChlP-chippel összehasonlítva a ChIP-Seq valódi teljes genom elemzést tesz lehetővé. nagyobb felbontással, nagyobb detektálási érzékenységgel és kisebb mintaméret-igénnyel.35 ChP-t használtunk a KLF15 által közvetlenül kötött DNS-fragmensek kinyerésére, majd a GenBankkal való összehasonlítást és elemzést követően 2478 lehetséges célgént szűrtünk. A GO és az útvonalelemzések révén számos olyan célgént azonosítottunk, amelyek részt vesznek a sejtciklusban és a proliferációs folyamatokban.

A ChlP-Seq kísérletekhez PCR-re van szükség a detektálási jel erősítéséhez, és az amplifikációs folyamat során elkerülhetetlen bizonyos fokú torzítás. Ezenkívül a ChIP-Seq csak azokat a géneket szerzi meg, amelyekhez a KLF15 képes kötődni, és nem jelzi azokat a változásokat, amelyek ezeknek a géneknek az expressziójában következnek be, amikor a KLF15 expressziója megváltozik. E hiányosságok kompenzálására SILAC-LC/MS proteomikai analízist alkalmaztunk. Ez a technika információt nyújt az összes olyan fehérjéről, amelyek expressziója megváltozik a KLF15 általi szabályozás hatására, beleértve a KLF15 által közvetlenül szabályozott fehérjéket, valamint a közvetetten szabályozott vagy poszttranszlációs módosult fehérjéket. A HRMC-ket SILAC alkalmazásával tenyésztettük, és a KLF15 túlzottan expresszálódott a sejtekben plazmid transzfekció révén. A fehérjéket összegyűjtöttük LC/MS kimutatáshoz, és 1357 differenciálisan expresszált fehérjét kaptunk. A GO és az útvonalelemzések kimutatták, hogy a differenciálisan expresszált fehérjék némelyike ​​részt vett az ubikvitinációban. A gén- és fehérjeadatokat metszettük. A kutatási célhoz nem kapcsolódó és a KLF15 által közvetlenül nem szabályozott géneket eltávolítottuk; végül 52 gént vizsgáltak meg. Ezek közül választottuk ki azt az öt gént, amelyekben a legnyilvánvalóbb expressziós különbségek mutatkoztak, és amelyek a legszorosabb kapcsolatban állnak a proliferációval. A proliferációs HRMC-kben végzett SUMO1 és KLF15 expressziós elemzések, ChlP-PCR és kettős luciferáz riporter vizsgálatok kombinált eredményei alapján a SUMO1 fehérjét választottuk a KLF15 célgénjeként.

Az ubiquitin mellett egyre több UBL-proteint 3637 azonosítanak, beleértve a SUMO-t,38 neurális prekurzor sejtekben expresszált, a fejlődésben lefelé szabályozott 8(NEDD8)3940 és interferon-stimulált 15(ISG15),41 gént. Ezek a módosító fehérjék erőteljesen szabályozzák a különféle biológiai folyamatokat. A SUMO szubsztrátokhoz való kovalens hozzáadása, amelyet SUMOilációnak neveznek, egy poszttranszlációs módosulás, amely számos sejtfolyamatban vesz részt, beleértve a sejtmag-citoszol transzportot, a transzkripciós szabályozást, az apoptózist, a fehérje stabilitás szabályozását, a stresszválaszokat és a sejtciklus progresszióját.27 A SUMO jellemzően konszenzus szekvenciát tartalmazó fehérjeszubsztrátok akceptor lizin maradékaihoz kötődik, és hozzájárul a fehérje-fehérje kölcsönhatások szabályozásához, valamint a szubcelluláris kompartmentalizációhoz és a fehérje stabilitásához.2 A sUMO1 a SUMOS család tagjaként a szubsztrát módosításával befolyásolhatja a sejtproliferációt és a sejtciklust szabályozó fehérjék stabilizálása.43 Ezért a szakirodalmi jelentéssel és az átfogó szűrési és elemzési eredményekkel kombinálva arra összpontosítottunk, hogy a KLF15 hogyan szabályozza a SUMO1 mezangiális sejtproliferációra gyakorolt ​​hatását.

A SUMO1 szubsztrátjainak azonosítására a SUMO1 hálózati elemzését végeztük az IPA adatbázis és a SUMOsp szoftver segítségével. A P53-ról publikált kutatásokkal kombinálva, kezdeti szűrési adataink azt sugallták, hogy a P53 a SUMO1 downstream molekulája YKxD/E SUMOilációs szekvenciával. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a P53 a SUMOiláció szubsztrátja volt,45 és a fokozott P53 SUMO1 konjugáció elősegítette a P53 stabilitását és aktivitását, és sze-neszcenciát indukált.46 Vizsgálatunkban a SUMO1 expressziójával való interferencia a HRMC-kben ugyanazokat a változási tendenciákat idézte elő. SUMO1-P53 és P53, ami azt jelzi, hogy a P53 a SUMO1 SUMOilációs szubsztrátja volt.

Az újonnan felbukkanó bizonyítékok azt mutatják, hogy a SUMOiláció és a de-SUMOiláció számos nephropathiás betegségben játszik szerepet, mint például a vese dysgenesis, a vese karcinóma, a glomeruláris betegségek, a podocita apoptózis és a vese medulla hipertóniája, az akut vesekárosodás és a nephrolithiasis.7-51 A KLF15, SUMO1, P53 SUMOiláció és MC proliferáció közötti kapcsolatra vonatkozóan egy sor transzfekciós kezelést végeztünk PDGF-BB által indukált proliferáción átesett sejteken. A KLF15 túlzott expressziója fokozta a SUMO1 expresszióját, míg a SUMO1 túlzott expressziója nem befolyásolta a KLF15 expresszióját. A KLF15 vagy a SUMO1 túlzott expressziója növelte a P53 SUMOilációját, és antagonizálta a PDGF-BB által indukált sejtproliferációt. Amikor a SUMO1 expresszióját gátolta, a P53 SUMOilációja is gátolt, és a KLF15 elvesztette antagonista hatását a sejtproliferációra. In vivo. az MC-k proliferációja fokozatosan növekedett a mesangialis proliferatív nephritis súlyosbodásával, míg a KLF15, SUMO1 és P53 expressziója szignifikánsan csökkent. Figyelembe véve a sejtekben és szövetekben integrált megfigyeléseket, előzetesen arra a következtetésre jutottunk, hogy a KLF15 szabályozza a P53 SUMOilációját a SUMO1-en keresztül, ezáltal gátolja az MC proliferációt.

5 KÖVETKEZTETÉSEK

Egyes tanulmányok kimutatták, hogy a KLF15 fontos szerepet játszik az MC-k proliferációjának szabályozásában. Ebben a munkában feltártuk a transzkripciós faktor által közvetített MC proliferáció-szuppresszió mechanizmusait. A ChIP-Seq és a SILAC-LC/MS bioinformatikai elemzésével a SUMO1-et azonosítottuk a KLF15 elsődleges célpontjaként MC-kben. Továbbá az IPA adatbázis és a SUMOsp szoftver segítségével megállapítottuk, hogy a P53 a SUMO1 közvetlen szubsztrátja. In vitro és in vivo kísérletek megerősítették, hogy a KLF15 elősegítheti a SUMO1 expresszióját és a P53 SUMOilációját, majd gátolja az MC-k proliferációját (S2 ábra). Ezek az eredmények hozzájárulnak a KLF15 szabályozó szerepének megértéséhez az MC proliferációban, és elméleti alapot adnak az MC proliferációval összefüggő vesebetegségek új kezelésének megtalálásához.