A Lepisorus Thunbergianusból származó koffeoil-kinsavak és melanogenezist gátló hatásuk jellemzése

Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Hak Hyun Kim, Jae Kwon Kim, Jaehyun Kim, Se-Hui Jung* és Kooyeon Lee*

ABSZTRAKT:A tirozináz túlaktiválódásából eredő hiperpigmentáció sötétebb foltokhoz vagy foltokhoz vezet az emberi bőrön. Bár ezek a jelenségek ártalmatlanok, továbbra is nagy a kereslet a melanogenezis-gátlókra, amelyek megakadályozzák a hiperpigmentációt a tirozináz, a melanogenezis sebességkorlátozó enzimének gátlásával. Bár a Lepisorus thunbergianust népi gyógymódokban vízhajtóként és vérzéscsillapítóként használták, a melanogenezisre gyakorolt ​​hatásáról még nem számoltak be. Ebben a tanulmányban egy L. thunbergianus kivonatot és oldószeres frakcióit állítottuk elő, és értékeltük azok biológiai aktivitását a szabad gyökök és a melanin szintézis ellen. A L. thunbergianus kivonata hatékonyabban gátolta a gomba tirozináz aktivitását, mint az arbutin, és hasonló antioxidáns hatással in vitro. A L. thunbergianus oldószeres frakcióinak melanogenezis- és tirozináz-ellenes aktivitásának összehasonlító értékelése kimutatta, hogy a tirozináz aktivitás gátlása révén a butanolfrakció rendelkezik a legnagyobb potenciállal a melanogenesisin melanomasejtek gátlására. Nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) és NMR spektroszkópiával végzett szerkezeti analízissel megállapítottuk, hogy a butanolfrakció fő vegyületei három koffeoil-kinsav-származék. A három származék in vitro hasonló gyökfogó és anti-tirozináz aktivitást mutatott, míg csak a 5- koffeoil-kinsav volt gátló hatással az -MSH által kiváltott melanogenezisre. A 5-koffeoil-kinsav gátló hatását a sejtek kereskedelmi forgalomban kapható vegyülettel történő kezelését követően melanomában a melanintartalom és a tirozináz aktivitás meghatározása igazolta. Kiderült továbbá, hogy a 5-koffeoil-kinsav gátolta a melanogenezist azáltal, hogy egy réz-tirozináz komplexből egy rézkationt kelátozott. Így a L. thunbergianusból frakcionált 5-káffeoil-kinsav vagy butanol hasznos lehet a kozmetikumokban bőrfehérítő szerként.

Cistanche tubulosa: bőrfehérítő szer.

BEVEZETÉS

A melanin, a legtöbb szervezetben megtalálható természetes pigmentek csoportja, fontos szerepet játszik a gyümölcsök, gombák és zöldségek barnulásában, valamint az emberi bőr pigmentációjában.1 A melaninokat aminosav tirozinból állítják elő többlépcsős eljárással, amely magában foglalja az enzimes oxidációt és a polimerizációt. 2 Az embertelen emberekben a melanin pigmentet az epidermisz és a dermis találkozásánál elhelyezkedő speciális dendrites sejtek melanociták szintetizálják, amelyekben a szintézist az ultraibolya (UV) sugárzásnak való kitettség indítja be.3 A melanin pigmentet a keratinocitákba szállítják, hogy megvédjék a bőrt az UV sugárzástól és a szabad gyököktől; így a bőr színét a melanin pigment eloszlási mintája határozza meg.2 Szabályozási zavar Az inmelanin szintézis a hiperpigmentáció számos formájához vezet, mint például melasma, szeplők, öregségi foltok, szoláris lentigo, gyulladás utáni hiperpigmentáció és egyéb hiperpigmentációs szindrómák.4 Több mint egy száz fehérje kapcsolódik a tomelaninszintézishez, és ezek között a tirozináz az a sebességkorlátozó enzim, amelyről elismerten felelős a formelaninszintézisért.5 Így a hiperpigmentáció megelőzésére irányuló kutatások többsége az új hatásos anyagok azonosítására, izolálására, szintézisére és jellemzésére összpontosít. tirozináz inhibitorok a melanogenezis megelőzésére.1,6 Számos tirozináz inhibitort, mint például a kojsav, arbutin, hidrokinon, azelainsav, ellagsav és tranexámsav, népszerűen alkalmaznak a kozmetikai iparban melanogenezis elleni szerekként; azonban a kémiai gyógyszerek korlátai miatt, amelyek magukban foglalják a citotoxicitást és a mellékhatásokat, továbbra is igény van új anyagokra, amelyek jobb biztonsággal, stabilitással és hatékonysággal rendelkeznek.

A természetes termékek, beleértve a növényeket, baktériumokat és gombákat, a hatékony bőrfehérítő összetevők felfedezésének alternatív forrásaivá váltak, mivel kisebb toxicitásuk, jobb biológiai kompatibilitásuk és biológiai hozzáférhetőségük. vagy a fák kérge, és Kelet-Ázsia mérsékelt égövi régióiban, például Koreában, Japánban, Kínában, a Fülöp-szigeteken és Indokínában elterjedt. A L. thunbergianust vizelethajtóként, vérzéscsillapítóként használták, és köhögéscsillapító hatású a koreai népi gyógymódokban. Korábbi tanulmányok arról számoltak be, hogy egy L. thunbergianusextract lokális anti-lipid-peroxidációs aktivitással és antioxidáns aktivitással rendelkezik.9 Ezenkívül az L. thunbergianus kivonat jelentős koncentrációfüggő növekedésgátlást mutatott szájrákos és vastagbélráksejtekben.10 Az L. thunbergianusextract potenciálisan alkalmazható. a kozmetikai iparban, mert ez a növény különféle flavonoidvegyületeket és számos bioaktív molekulát tartalmaz, amelyek közé tartozik a kvercetin 3-metil-éter-glükozid, vitexin, keleti, periodikus-glükozid, izovitexin, orientin, korentin és koffeoil-kinicasav.9a A L. thunbergianus kivonat onmelanin szintézise melanocitákban még nem tisztázott.

1. ábra: A L. thunbergianus kivonat elemzése (A) ABTS gyökfogó, (B) anti-tirozináz és (C) intracelluláris ROS befogó aktivitás szempontjából

Ebben a tanulmányban sorozatfrakcionálással állítottuk elő a L. thunbergianus kivonatot és oldószeres frakcióit, és vizsgáltuk az oldószeres frakciók melaninbioszintézisre gyakorolt ​​gátló hatását B16F10 melanoma sejtekben. Azonosítottuk a butanol (n-BuOH) frakciót, mint a természetes inhibitort főként tartalmazó frakciót, és tovább jellemeztük a L. thunbergianus kivonatból izolált koffeoil-kinsav származékok melanin bioszintézis gátlására gyakorolt ​​hatását.

cistanche áttekintés: antioxidáció

EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS

L. thunbergianus etanolos kivonata megköti a 2,2′-Azinobis(3-etil-benzotiazolin-6-szulfonsav (ABTS) gyököt és gátolja a tirozináz aktivitást.

A kitermelés L. thunbergianust 70 százalékos etanollal (EtOH) végeztük, hogy felmérjük a növényben található természetes vegyületek potenciális gátló hatását. A L.thunbergianus kivonat gyökfogó aktivitását 2-200 ug/ml koncentráció tartományban határoztuk meg. Az etanolos kivonat koncentrációtól függő gyökfogó aktivitást mutatott maximális hatással 50 ug/ml-nél, ahol az eredmény összhangban volt a pozitív kontrollként használt arbutinnal (1A. ábra).

A kivonat gomba tirozináz aktivitására gyakorolt ​​gátló hatását a tirozináz által katalizált dopakróm szintézis sebességének mérésével is értékeltük. Az etanol-extraktum a tirozináz aktivitás 87 százalékát gátolta 500 ug/ml-nél, míg az arbutin a tirozináz aktivitásának csak 38 százalékát gátolta ugyanabban a koncentrációban (1B. ábra). Ezt követően értékeltük a kivonat 100 μM hidrogén-peroxiddal megnövekedett intracelluláris ROS-en kifejtett tisztító hatását. A hidrogén-peroxiddal végzett kezelés körülbelül 2,7-szeresére növelte a B16F10 sejtek intracelluláris ROS szintjét (1C. ábra). Megállapítottuk, hogy az intracelluláris ROS hidrogén-peroxid által közvetített növekedését a kivonat dózisfüggő módon megköti: a maximális megkötő aktivitás 100 ug/ml-nél 78% volt (1C. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a L. thunbergianus etanolos kivonata olyan bioaktív összetevőket tartalmaz, amelyek gátolják a tirozináz aktivitást, valamint megkötik az ABTS gyököket és az intracelluláris ROS-t.

cistanche deserticola kivonat: gátolja a tirozináz aktivitást.

A L. thunbergianus frakciók gátló potenciálja a melanogenezis ellen.

A crude EtOH extract was fractionated with various solvents including hexane (Hex), methylene chloride (CH2Cl2), ethyl acetate (EtOAc), and butanol to identify and characterize ingredients inhibiting melanogenesis. To identify which solvent fractions have the potential against melanin synthesis, we performed a comparative analysis of four different L. thunbergianus solvent fractions for the radical scavenging and anti-tyrosinase activities. First, to evaluate the antioxidant activity of the four solvent fractions of the L. thunbergianus extract, we determined the ABTS radical scavenging activities in the concentration range of 2−200 μg/ mL. All fractions showed a concentration-dependent increase in ABTS radical scavenging activity (Figure 2A). In particular, EtOAc and n-BuOH fractions completely scavenged the ABTS radical at a 50 μg/mL concentration. The ABTS radical scavenging activity was in the order of n-BuOH > EtOAc >CH2Cl2 > Hex, ami összhangban van az előző jelentéssel.10bTovábbá a különböző oldószerfrakciók tirozináz aktivitásra gyakorolt ​​gátló hatása koncentrációfüggő módon nőtt: az n-Hex és CH2Cl2 frakciók maximális gátló hatása 65 százalék alatt volt, az EtOAc ill. Az n-BuOH-frakciók 70% felettiek voltak (2B. ábra). A gátló aktivitás n-BuOH > EtOAc > CH2Cl2 > n-Hex. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy több hidrofil frakció, beleértve az n-BuOH és EtOAc frakciókat is, nagyobb gyökfogó aktivitást és jobb gátló aktivitást mutatott, mint a lipofil n-Hex és CH2Cl2 frakciók. .

Ezt követően az L. thunbergianus oldószerfrakciók melanoma sejtproliferációra gyakorolt ​​hatását vizsgálták úgy, hogy a B16F10 sejteket 200 ug/ml különböző frakciókkal vagy 2 mg/ml arbutinnal kezelték. egy -melanocita-stimuláló hormon (-MSH) jelenléte, amelyről köztudottan elősegíti a melanogenezist a mikroftalmia-asszociált transzkripciós faktor (MITF) indukcióján keresztül.11 Az eredmények azt mutatták, hogy egyik frakciónak sem volt jelentős hatása a melanoma sejtproliferációra (2C. ábra). Ezt követően megvizsgáltuk az oldószerfrakciók gátló hatását a -MSH által stimulált melanogenezisre melanomasejtekben. Az -MSH-kezelés a B16F10 sejtek intracelluláris melanintartalmának körülbelül 2,{13}}szeresét indukálta (2D. ábra). Azt találtuk, hogy az -MSH által közvetített melanogenezist teljesen gátolta az n-BuOH frakció (p < 0,01),="" részben="" pedig="" az="" etoacfrakció="" (40="" százalék,="" p="">< 0,01),="" míg="" az="" -msh="" által="" közvetített="" melanogenezist="" az="" n-hex="" nem="" változtatta="" meg="" szignifikánsan.="" és="" ch2cl2-frakciók="" (2d.="" ábra).="" meghatározták="" továbbá="" az="" oldószerfrakciók="" gátló="" hatását="" a="" -msh="" által="" közvetített="" tirozináz="" aktivációra,="" mivel="" a="" tirozináz="" kulcsszerepet="" játszik="" a="" melanogenezisben.="" az="" n-buoh="" (95="" százalék,="" p="">< 0,001)="" és="" az="" etoac="" (66="" százalék,="" p="">< 0,001)="" tirozinázzal="" aktivált="" frakciói="" megfordulnak.="" -msh-val,="" míg="" az="" n-hex="" és="" ch2cl2="" frakciók="" nem,="" amint="" az="" a="" 2e.="" ábrán="" látható.="" ezen="" túlmenően="" a="" hidrogén-peroxid="" stimulálta="" a="" különböző="" oldószerfrakciók="" tisztító="" hatását="" az="" intracelluláris="" ros="" növekedésére.="" az="" összes="" oldószeres="" frakció="" megfordította="" a="" hidrogén-peroxid="" által="" közvetített="" intracelluláris="" ros="" növekedést,="" amint="" az="" a="" 2f="" ábrán="" látható.="" ezek="" az="" eredmények="" azt="" mutatják,="" hogy="" a="" l.="" thunbergianus="" buoh-frakciója="" gátolta="" az="" -msh-indukált="" melaninszintézist="" azáltal,="" hogy="" gátolta="" az="" intracelluláris="" tirozináz="" aktivitást="" b16f10="" sejtekben.="" ezen="" túlmenően="" ezek="" az="" eredmények="" arra="" utalnak,="" hogy="" a="" melanin="" szintézist="" gátló="" bioaktív="" összetevők="" hidrofilek="" voltak,="" és="" főként="" az="" n-buoh="" frakcióban="">

2. ábra: Oldószerfrakciók hatása az ABTS gyökfogó, anti-tirozináz és anti-melanogenezis aktivitására.

Az L. thunbergianus kivonat bioaktív vegyületeinek azonosítása és jellemzése.

A melanogenezist gátló összetevők azonosítására és jellemzésére nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC) analízist végeztünk az összes oldószeres frakcióra. Az oldószerfrakciók HPLC-analízise azt mutatta, hogy minden frakció három fő vegyületet tartalmaz 21, 28 és 29 perces retenciós időkkel az 1., 2. és 3. vegyület esetében (3A-D ábra). Ezt a három fő vegyületet preparatív HPLC-tisztítással tovább izoláltuk. A három fő vegyület mennyiségét az n-BuOH-frakcióban a kereskedelmi forgalomban kapható koffeoil-kinsav-származékok, mint belső standardmolekulák felhasználásával határoztuk meg, az előző jelentés szerint.12

Az izolált vegyületeket ezután azonosítottuk 1H és 13C NMR adataik összehasonlításával az irodalomban, és megállapítottuk, hogy megegyeznek a javasolt szerkezetekkel (4. ábra).13 A 3E ábra a három vegyület molekulaszerkezetét mutatja. Az 1. vegyületet (hozam: 3,2 ± 0,1 mg/100 mg n BuOH-frakció) halványsárga por formájában kapjuk. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8: 9,66 (1H, széles s), 9,20 (1H, széles s), 7,49 (1H, d, J=15,9 Hz), 7,04 (1H, s), 6,99 ( 1H, d, J=8,2 Hz), 6,78 (1H, d, J=8,1 Hz), 6,23 (1H, d, J=15,9 Hz), 5,20( 1H, m), 5,08 (1H, széles s), 4,89 (1H, széles s), 4,13 (1H, m), 3,84 (1H, m), 3,56 (1H, s), 3,35 (1H, s), 1,99 (1H, m). m), 1,92 (1H,m), 1,89 (1H,m), 1,79 (1H,m). 13C{1H}-NMR (100 MHz, DMSO-d6) 8 (176,42, 168,10, 148,14, 145,53, 144,75, 125,65, 121,07, 115,75, 121,07, 115,75, 121,07, 115,75, 121,07, 115,75, 114,71). Az 1. vegyületet 3-káffeoil-kinsavként azonosították NMR-analízissel és az előző irodalommal való összehasonlítással.13b

A 2. vegyületet (hozam: 14,1 ± 0,1 mg/100 mg n-BuOH-frakció) halványsárga por formájában kapjuk. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 9,64 (1H, széles s), 9,20 (1H, széles s), 7,52 (1H, d, J=15,9 Hz), 7,06 (1H, s), 7,02 ( 1H, d, J=8,1 Hz) 6,79 (1H, d, J=7,9 Hz), 6,30 (1H, d, J=15,9 Hz), 4,85 ( 1H, széles s), 4,70 (1H, d, J=4,9 Hz), 4,12 (1H, széles s), 3,95 (1H, m), 1,97 (2H, m), 1,88 (1H, m), 1,83 (1H, m). 13C{1H}-NMR (100 MHz, DMSO-d6) 8 (176,02, 166,27, 148,28, 145,55, 144,77, 125,54, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 115,76, 114,76, 114,68, 114,68, 114,66. A 2. vegyületet 5-koffeoil-kinsavként azonosították az NMR-analízis és a korábbi irodalommal való összehasonlítás alapján.13c

A 3. vegyületet (hozam: 3,9 ± 0,2 mg/100 mg n-BuOH-frakció) kaptuk halványsárga por formájában. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 9,64 (1H, széles s), 9,20 (1H, széles s), 7,52 (1H, d, J=15,9 Hz), 7,06 (1H, s), 7,02 ( 1H, d, J=8,1 Hz) 6,79 (1H, d, J=7,9 Hz), 6,30 (1H, d, J=15,9 Hz), 4,85 ( 1H, széles s), 4,70 (1H, d, J=4,9 Hz), 4,12 (1H, széles s), 3,95 (1H, m), 1,97 (2H, m), 1,88 (1H, m), 1,83 (1H, m). 13C{1H}-NMR (100 MHz, DMSO-d6) 8 (176,02, 166,27, 148,28, 145,55, 144,77, 125,54, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 115,76, 114,76, 114,68, 114,68, 114,66. A 3. vegyületet 4-koffeoil-kinsavként azonosították az NMR-analízissel és a korábbi irodalommal való összehasonlítással.13a

3. ábra: A L. thunbergianus (A) n-Hex, (B) CH2Cl2, (C) EtOAc és (D) n-BuOH frakcióinak HPLC kromatogramja és a három fő vegyület (E) szerkezete.

A L. thunbergianusból izolált koffeoil-kinsav-származékok melanogenezis elleni gátló hatása.

Ezt követően, a hatékony anti-melanogenezis mögött meghúzódó biológiailag aktív összetevő azonosítására, meghatároztuk a L. thunbergianusból izolált három koffeoil-kinsav-származék gátló hatását a melaninszintézisben részt vevő inmelanoma sejtekkel szemben. Először a három származék ABTS gyökfogásra gyakorolt ​​hatását vizsgáltuk. Az eredmények azt mutatták, hogy a három származéknak hasonló ABTS gyökfogó aktivitása volt (5A. ábra). Ezután megvizsgáltuk a L. thunbergianus ontirozináz aktivitásából izolált három származék gátló hatását. A három származék a tirozináz aktivitás koncentrációfüggő gátlását mutatta, 200 μM koncentrációnál a maximális gátlást (5B. ábra). Továbbá vizsgáltuk a három származék gátló hatását a -MSH által kiváltott melaninszintézisre B16F10 sejtekben. Az -MSH-val végzett kezelés a B16F10 sejtek intracelluláris melanintartalmának körülbelül 2{11}}szeresét idézte elő (5C. ábra). Érdekes módon az 1-es (3-koffeoil-kinsav) és a 3-as vegyület (4-koffeoil-kinsav) szignifikánsan, 25, illetve 23 százalékkal növelte a melaninszintézist (5C. ábra, p.< 0.001),="" while="" compound="" 2="" (5-caffeoylquinic="" acid)="" completely="" reversed="" α-msh-induced="" melanogenesis="" (p="" <="" 0.001).="" these="" results="" suggest="" that="" the="" three="" caffeoylquinic="" acid="" derivatives="" with="" similar="" structures="" but="" different="" substitution="" sites="" have="" different="" biological="" activities="" on="" melanogenesis.="" furthermore,="" 5-caffeoylquinic="" acid="" has="" potent="" inhibitory="" activity="" against="">

4. ábra: (A) 3- koffeoil-kinsav, (B) 4- koffeoil-kinsav és (C) 5- koffeoil-kinsav 1H NMR-spektruma és (D) {{13C NMR spektruma 6}}koffeoil-kinsav, (E) 4-koffeoil-kinsav és (F) 5-koffeoil-kinsav

A 5-koffeoil-kinsav melanogenezis elleni hatékonyságának ellenőrzése.

A {{0}}koffeoil-kinsav melanogenezis elleni gátló hatásának igazolására meghatároztuk a kereskedelmi forgalomban lévő 5-koffeoil-kinsav onmelaninszintézis gátló hatását, amelyet az -MSH közvetít. Az alacsonyabb koncentrációjú 0,1 és 0,2 mM 5- koffeoil-kinicasavval végzett kezelés kismértékben növelte a melaninszintézist és az intracelluláris tirozináz aktivitást, míg a vegyület magasabb, 0,5 és 1 mm-es koncentrációi megfordították az -MSH által közvetített melanogenezist. és az intracelluláris tirozináz aktivitást (6A, B ábra), amiben az eredmények összhangban vannak az előző jelentéssel.14

A koffeoil-kinsav egy fenolos vegyület, amely a kávésav és az L-kinsav közötti észterkötés révén jön létre. A koffeoil-kinsav-származékokról ismert, hogy anti-melanogenezis és anti-tirozináz aktivitással, valamint ROS-megkötő aktivitással rendelkeznek. A tirozináz egy többfunkciós réztartalmú metalloenzim kétértékű rézkationokkal.1 A koffeoil-kinsav-származékok gátolhatják a tirozinázaktivitást azáltal, hogy kelátot képeznek a tirozináz aktív állapotának fenntartásáért felelős rézkationon. A 5-koffeoil-kinsav és a tirozináz közötti kölcsönhatás előrejelzésére a Maestroprogram segítségével számítógépes molekuláris dokkolási vizsgálatot végeztek. A vegyület, a dokkolt totirozináz legjobb pózát a 6C, D. ábra mutatja. A molekuláris dokkolási vizsgálat kimutatta, hogy a 5-koffeoil-kinsav kölcsönhatásba lép a rézzel 2,43 Å távolságban, és π-π halmozási sorozatot hoz létre a His-szel. 259, Asn 260, His 85 és His 263 maradékok és egy H-kötés Arg 268-cal. Továbbá a tirozináz és a 5-koffeoil-kinsav közötti kötési energia –4,425 kJ/mol volt. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a 5-koffeoil-kinsav gátolhatja a tirozináz aktivitást a rézkeláció révén. A melanogenezis 5-koffeoil-kinsav általi gátló mechanizmusának igazolására meghatároztuk a 5-koffeoil-kinsav rézkelátképző képességét. A 5-koffeoil-kinsav rézkelátképző képessége koncentrációfüggő módon nőtt (6E. ábra). Ez az eredmény azt sugallja, hogy a 5-kávé-kinicasav gátolja a melanin szintézisét azáltal, hogy kelátot képez a tirozinázzal kölcsönhatásba lépő rézkationon.

5. ábra: A három koffeoil-kinsav-származék hatása a gyökfogó, in vitro anti-tirozináz és anti-melanogenezis aktivitásra B16F10 sejtekben.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Anyagok

A L. thunbergianust a www.jirisangol.com (Korea) online piacról vásároltuk, és környezeti körülmények között szárítottuk, mielőtt ebben a vizsgálatban felhasználtuk volna. Reagensek, például 2,2'-cink-bisz(3-etil-benzotiazolin-6-szulfonsav (ABTS) és 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-) il)-2,5-difenil-tetrazólium-bromidot (MTT), melanocita-stimuláló hormont (-MSH) és enzimeket, például a gomba tirozinázt a Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO, A kálium-szulfátot (K2S2O8), a pirokatekol ibolát és a 3,{20}}dihidroxi-L-fenilalanint (L-DOPA) az Alfa Aesartól (Haverhill, MA, USA) vásároltuk.

L. thunbergianus extrakciója és frakcionálása.

A szárított L. thunbergianust (80 g) porítóberendezéssel (HBL-3500S, Samyang Electronics, Korea) porrá törjük, és háromszor 70 százalékos EtOH-val extraháljuk (mindegyik alkalommal 800 ml). ) 70 fokon 3 napig. A kapott extraktumot vákuumban szűrtük Advantecfilter 3. sz. 1. és 2. ábrán (Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokió, Japán) és Hei-Vap Advantage rotációs bepárlóval (Heidolph, Németország) bepároljuk, így 17,2 g nyers EtOH-kivonatot kapunk. Ezt a nyers extraktumot dH20-ban (180 ml) szuszpendáltuk, és egymást követően hexszel, CH2Cl2-vel, EtOAc-vel és n-BuOH-val frakcionáltuk, így Hexet (1,51 g, 8,8%), CH2Cl2-t (0,88 g, 5,1%) és EtOAc-ot (3,95 g) kaptunk. százalék ) és n-BuOH (3,02 g, 17,6 százalék), a korábban leírtak szerint.15 A kapott kivonatokat és frakciókat liofilizáltuk, és felhasználás előtt -80 °C-on tároltuk.

Az ABTS szabadgyökfogó aktivitásának meghatározása.

A L. thunbergianus kivonatok és oldószeres frakcióinak antioxidáns aktivitásának értékeléséhez a korábban leírtak szerint meghatároztuk az ABTS-gyökfogó aktivitást.16 Az ABTS gyök létrehozásához 10 ml 7 mMABTS-t összekevertünk 176 µl 140 mM-os oldattal. kálium-peroxi-diszulfátot dH2O-ban, és sötétben, szobahőmérsékleten (RT) 16 órán át inkubáltuk felhasználás előtt. Az ABTS gyökös oldatot abszolút metanollal hígítottuk, hogy 734 nm-en közel 0,7 abszorbanciát kapjunk. Mindegyik kivonatból vagy frakciókból 100 μl-es alikvotokat adtunk a jelzett 2-200 ug/ml koncentrációtartományban 100 µl hígított ABTS gyökös oldathoz, és 10 percig inkubáltuk sötétben szobahőmérsékleten. Az abszorbanciát ezután 732 nm-en mértük SpectraMaxM5 multimódusú mikrolemez-leolvasóval (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Az ABTS gyökfogó aktivitását a következőképpen számítottuk ki

ABTS gyökfogó tevékenység ( százalék ) =1−(Asample/Acontrol)×100 (1)

In vitro tirozináz gátlás.

A L. thunbergianus kivonatok és oldószeres frakcióinak a tirozináz aktivitásra kifejtett gátló hatását a tirozináz katalitikus reakciójából szintetizált dopakrom mennyiségével határoztuk meg.2a,17Röviden, a megadott koncentrációtartományban lévő kivonatokból vagy frakciókból 50 μl-t kevertünk össze 50 50 μl-rel. U/mL gomba tirozináz 50 mM foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS; 8,1 mM Na2HPO4, 1,2 mM KH2PO4, pH 6,8, 2,7 mMCl és 138 mM NaCl) egy 96- lyukú lemezben, és inkubáljuk 30 percig szobahőmérsékleten. Ezután 100 μl 1 mM L-DOPA-t adtunk minden egyes lyukhoz, majd további 10 percig 37 °C-on inkubáltuk. A kapott oldat abszorbanciáját 475 nm-en mértük SpectraMax M5 multimódusú mikroplatereader segítségével.

Sejtkultúra.

A B16F10 egér melanoma sejteket Dulbecco módosított Eagle táptalajban (DMEM) (Gibco, Gaithersburg, USA) tenyésztettük, amelyet 10 százalék hővel inaktivált magzati szarvasmarha szérummal (Gibco), 100 egység/ml penicillinnel és 100 ug/ml 3 streptomycinnel (Gib7 fokon) egészítettünk ki. 5 százalékos párásított CO2 alatt.

Sejt életképesség.

A B16F10 sejtek életképességét MTT vizsgálattal határoztuk meg, a korábban leírtak szerint.18 Röviden, a B16F10 sejteket 24-lyukú lemezekre oltottuk 1 × 104 sejt/lyuk sűrűséggel. 24 óra elteltével a sejteket a jelzett koncentrációjú L. thunbergianus kivonatokkal vagy frakciókkal kezeltük 48 órán keresztül. A sejteket ezután 4 órán át MTT-oldattal inkubáltuk, és a redukált formazánkristályokat DMSO-ban oldottuk. A kapott oldatot 96-lyuklemezekre vittük át, és az abszorbanciát 540 nm-en mértük a SpectraMax M5multimode mikrolemez-leolvasóval.

Az intracelluláris reaktív oxigénfajták (ROS) meghatározása.

Az intracelluláris ROS szintet egy DCF/H2DCFDA celluláris ROS vizsgálati készlettel (ab113851, Abcam) mértük a gyártó utasításai szerint. Röviden, a B16F10 sejteket 48-lyukú lemezekre oltottuk 2 × 104 sejt/lyuk sűrűséggel. 24 órás tenyésztés után a sejteket 1 órán át kezeltük a L. thunbergianus extraktum-oldószer frakcióinak jelzett koncentrációival 0,1% szarvasmarha szérumalbumint (BSA) tartalmazó, fenolvöröst nem tartalmazó tápközegben. A sejteket ezután 100 µM hidrogén-peroxiddal 30 percig inkubáltuk. PBS-sel történő mosás után a sejteket 25 µMH2DCFDA-val kezeltük PBS-ben 45 percig. A ROS szintet fluoreszcens szűrővel felszerelt mikrolemez-leolvasóval (Synergy H1, Biotek, Vermont, USA) analizáltuk 485/545 nm-en (gerjesztési/emissziós hullámhosszon). A kontroll átlagos relatív fluoreszcencia intenzitása 100 százalék volt, a kezelési feltételeket arányosan számítottuk.

Melanintartalom meghatározása.

A melanintartalmat a korábban leírtak szerint, némi módosítással határoztuk meg.19 A melanomasejteket hatlyukú lemezen tenyésztettük 24 órán át. A jelzett koncentrációjú L. thunbergianus kivonattal vagy oldószerfrakcióival további 48 órán át kezeltük 100 nM -MSH jelenlétében. Hűtött Dulbecco foszfáttal pufferolt sóoldattal, kalcium-kloriddal és magnézium-kloriddal (D-PBS, Gibco), a kapott sejteket tripszin-EDTA oldattal végzett inkubálással választottuk le. 1000 rpm-en 3 percig végzett centrifugálás után a sejtpelletet 150 μl 1 M NaOH-ban, amely 10% DMSO-t tartalmazott, 1 órán át 60 fokon 1 órán át feloldottuk. A melanintartalmat a 405 nm-en mért abszorbanciával határoztuk meg mikrolemez-leolvasóval.

A Cistanche kivonat gátolja a melanint.

A celluláris tirozináz aktivitás meghatározása melanoma sejtekben.

A B16F10 sejtekben a tirozináz aktivitást az intracelluláris tirozináz katalitikus reakciójából származó dopakrom mennyisége alapján vizsgáltuk.20 Röviden, a melanoma sejteket hatlyukú lemezen tenyésztettük 24 órán át, majd különböző koncentrációjú L. thunbergianus kivonattal vagy oldószerével kezeltük. frakciók további 48 hin-ig 100 nM -MSH jelenlétében. Jéghideg D-PBS-sel kétszeri mosás után a sejteket 200 μl radioimmunprecipitációs vizsgálati (RIPA) pufferben (Sigma-Aldrich), amely proteázt és foszfatáz inhibitorokat tartalmazott, lizáltuk. Az egyes üregekből összegyűjtött sejtlizátum 15,{13}}g-n 15 percig tartó centrifugálása után 100 μL felülúszót 100 μl 1 mM L-DOPA-val PBS-ben (pH 6,8) kevertünk össze, majd 30 percig 37 fokon inkubáltuk. . A dopakrom abszorbanciáját 475 nm-en mértük mikroplatereader segítségével. Az adatokat a bicinkoninsav vizsgálattal meghatározott fehérjekoncentrációval normalizáltuk.

Bioaktív vegyületek izolálása és jellemzése HPLC segítségével.

A HPLC-t YL{{0}}-on (Young Lin Instrument, Korea) TC-C18 oszloppal (4,6 mm, 250 mm és 5 μm, Agilent, USA) szerelték fel. A oldószerből (0,2 százalék hangyasav) és B oldószerből (MeOH) álló gradiens rendszerrel. A lejtős oldószert 0-5 percre állítottuk, 15 százalék B; 5–10 perc, 15–20 százalék B; 10-15 perc, 20-30 százalék B; 15-30 perc, 30-40 százalék B; 30-37 perc, 40-60 százalék B; 37-40 perc, 60-100 százalék B; 40-45 perc, 100 százalék B; 45-50 perc, 100-15 százalék B; és 50-55 perc, 15% B. Az oldószerfrakciókban lévő összetevők azonosításához a mozgó fázist 1 ml/perc áramlási sebességgel adtuk be, és az eluálás detektálását 330 nm-en végeztük. A bioaktív összetevők insolvens frakcióinak összegyűjtéséhez a mozgó fázist 15,0 ml/perc áramlási sebességgel adtuk be, és az eluálás kimutatását 330 nm-en prep-HPLC-vel (YL-9100 s, Young Lin Instrument, Korea) végeztük. ), prep-C18 oszloppal (4,6 mm, 212 mm, 10 μm, Agilent, USA), egy A oldószerből (0,2% hangyasavból) és B oldószerből (MeOH) álló gradiens rendszerrel együtt. A meredekség oldószerarányát 0–10 percre, 10 százalék B; 10–20 percre, 10–15 százalékra B; 20-40 perc, 15 százalék B; 40-60 perc, 15-20 százalék B; és 60-70 perc, 30 százalék B.

Molekuláris modellezés.

A molekuláris modellezéshez a gomba-tirozináz kristályszerkezete a Protein DataBank-ból (PDB) kapott Agaricustyrosinase (PDB: 2Y9X) volt. Az enzimet a Maestroprogramba (Maestro, 11.9.011, Schrödinger, LLC, NewYork, NY, USA, 2019) beágyazott proteinvarázsló előkészítési munkafolyamat segítségével állítottuk elő. A vizet és az összes többi molekulát, amely a PDB-fájlokban jelen volt, eltávolították. A molekuláris dokkolást az indukált illeszkedő dokkoló (IFD) protokoll (Schrödinger Suite 2019 Induced Fit Docking protocol) segítségével végezték, amint azt korábban közölték.21

Réz kelátképző képesség.

A L. thunbergianusból izolált vegyületek rézkelátképző képességét az előző jelentés szerint határoztuk meg.22 Mindegyik koffeoil-kinsav-származékot (1{5}} μL) a jelzett koncentrációban 280 µl 50 mM nátrium-acetát pufferrel (pH 6,0) kevertünk össze. 6 μL 4 mM pirokatekol ibolya oldatot ugyanabban a pufferben, és 10 μL 1 ug/μL CuSO4·5H2O-t. A kék szín eltűnését úgy figyeltük meg, hogy az abszorbanciát 632 nm-en mértük a SpectraMax M5 multimódusú mikrolemez-leolvasóval. A minta helyett vizet használtunk kontrollként. A százalékos rézkelátképző aktivitást a 632 nm-en mért abszorbanciából számítottuk ki, ami a következő:

rézkelátképző képesség( százalék)=1− (Egy minta/egy vezérlő)×100 (2)

Statisztikai analízis.

Ebben a vizsgálatban az összes adatot három független kísérlet átlag ± standard deviációja (SD) formájában fejeztük ki. A statisztikai elemzéseket a GraphPad Prism 8.{1}} (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) segítségével végeztük. A kontroll és a kitett csoportok átlagértékei közötti különbségeket egyutas varianciaanalízissel (ANOVA) elemeztük, majd Dunnett-féle post hocteszttel. A statisztikai szignifikancia küszöbértéke minden elemzésnél p < 0,05="">

KÖVETKEZTETÉSEK

Ebben a vizsgálatban kimutattuk, hogy az L. thunbergianus kivonat megköti az ABTS gyököket, és jelentős citotoxicitás nélkül erős gátló hatást fejt ki a melanin bioszintézisére. Az n-BuOH-frakcióban a L. thunbergianusban található, a melanogenezist gátló abioaktív összetevőt izoláltuk. Továbbá azt találtuk, hogy a három koffeoil-kinsav-származék az n-BuOH-frakcióban található fő vegyület, és hogy a 5-koffeoil-kinsav fontos összetevője gátolja a melanogenezist a melanoma sejtekben a celluláris tirozináz aktivitás gátlásával. Itt a természetes vegyület inhibitor 5-káffeoil-kinsavat izoláltuk a L.thunbergianus kivonatból, hogy megakadályozzuk a hiperpigmentációt, és felfedjük annak gátlási mechanizmusát, amely a melanogenezis hátterében áll. Eredményeink tehát arra utalnak, hogy a 5-káffeoil-kinsav és a L. thunbergianusból izolált n-BuOH-frakció hasznos lehet a kozmetikumokban bőrfehérítő szerként.

cistanche szeletek