A szitoglusid mint potenciális bőrpigmentációt csökkentő szer azonosítása hálózati farmakológián keresztül

Kapcsolatfelvétel: ali.ma@wecistanche.com

Haoran Guo, 1 Hongliang Zeng, 2 Chuhan Fu, 1 Jinhua Huang, 1 Jianyun Lu, 1 Yibo Hu, 1 Ying Zhou, 1 Liping Luo, 1 Yushan Zhang, 1 Lan Zhang, 1 Jing Chen, 1 és Qinghai Zeng 1

Sok hagyományos kínai gyógyszer (TCM) abőrfehérítéstulajdonságokat rögzítettek a Ben-Cao-Gang-Mu és az infolk receptekben, és néhány szakirodalom megerősíti, hogy kivonatai képesek gátolni.pigmentáció. Szisztematikus tanulmányok azonban nem azonosították a potenciális hatóanyagok specifikus szabályozási mechanizmusait. Ennek a tanulmánynak a célja a TCM-ek bőrt gátló összetevőinek szűrése voltpigmentációhálózatos farmakológiai rendszeren keresztül és a mögöttes mechanizmusok feltárására. 14 TCM-ből 148 potenciális hatóanyagot azonosítottunk, és a topológiai paraméterek átlagos "fokozata" alapján az első öt TCM-et (Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones és Paeoniae Radix) azonosítottuk. nagy valószínűséggel okoztakbőrfehérítésgyulladáscsökkentő folyamatokon keresztül választották ki. A szitoglusid, az első öt TCM leggyakoribb összetevője, gátolja a humán melanomasejtek (MNT1) és a rágcsáló melanomasejtek (B16F0) melanogenezisét, és csökkenti a bőrt.pigmentációEzen túlmenően a mechanikai kutatások kimutatták, hogy a szitoglusid képes leszabályoznitirozináz(TYR) expressziója az ERK és p38 útvonalak gátlásával és a TYR aktivitás gátlásával. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a hálózati farmakológia hatékony eszköz a bőrfehérítő tulajdonságokkal rendelkező természetes vegyületek felfedezésére és lehetséges mechanizmusaik meghatározására. A Sitogluside egy új bőrfehérítő hatóanyag, kettős szabályozó hatással, amely gátoljaTYRkifejezés és tevékenység.

Kattintson ideCistanche DHT kivonat a bőr fehérítésére

Bevezetés

A melanin nemcsak az emberi bőr, a szem és a haj színét határozza meg, hanem kulcsszerepet játszik az álcázásban, a mimikában, a társas kommunikációban és az ultraibolya sugarak elleni védelemben is. Ha azonban a melanin túltermelődik és abnormálisan eloszlik az epidermiszben, változatosságot okoz. olyan állapotok, mint a szeplők és a melasma, amelyek negatívan befolyásolhatják az egyén észlelt szépségét és társadalmi önbizalmát [1]. A melanin az L-tirozin végterméke több lépéses enzimes reakció után, és melanocita melanoszómákban szintetizálódik [2]. A bőrben a melanociták az epidermisz alaprétegében helyezkednek el, és érett melanoszómákat termelhetnek és keratinocitákba juttathatnak, ezáltal bőrt okozva.pigmentáció [3]. TYRa melanintermelés fő sebességkorlátozó enzime [4], és a mikroftalmiával összefüggő transzkripciós faktor (MITF) a fő transzkripciós faktor, amely szabályozza a TYR transzkripciós expresszióját [5].

A közelmúltban végzett tanulmányok azt találták, hogy a gyulladásos válaszok fontos szerepet játszanak a melanogenezis szabályozásában [6]. Például az IL-18, amelyet a Langerhans-sejtek, a dendritikus sejtek és a keratinociták termelnek az epidermiszben, fokozhatja a TRP{{2 expresszióját. }} (tirozinázzal rokon fehérje 1) és TRP-2 (tirozinázzal rokon fehérje 2) a p38/MAPK (mitogen-aktivált protein kináz) és PKA (protein kinase A) útvonalak aktiválásával, ezáltal elősegítve a melanogenezist[7, 8 ]. A TNF főként az NF-κB aktiválásával csökkenti a B16 melanin termelését [9]. A fibroblasztok és keratinociták által kiválasztott PGe2 (prosztaglandin e2) kimutatták, hogy a cAMP (ciklikus adenozin-monofoszfát) és Plc (foszfolipáz c) jelátviteli útvonalakon keresztül serkenti a dendritikus sejtek differenciálódását, és beindítja a TYR aktivitást melanocitákban [10]. A PIH (posztinflammatorikus hiperpigmentáció) a reaktív bőrmelanizáció egyik fajtája [11]. Különféle bőrbetegségek, traumák vagy kozmetikai műtétek gyakran vezetnekpigmentációaz érintett területen, különösen színes bőrűeknél [12]. A PIH-ban szenvedő betegek általában hatalmas pszichés stresszt viselnek, ami súlyos esetekben negatívan befolyásolja életminőségüket. Ezért bizonyos gyulladást szabályozó gyógyszereket alkalmaznak a PIH és más, hiperpigmentációt okozó betegségek kezelésére. Például a resveratrol, amely csökkentette a HaCaT-sejtek gyulladásos károsodását [13], gátolja a melaninszintézist a kináz1/2 extracelluláris jelszabályozásán és a jelátvitelen keresztül. foszfoinozitid 3-kináz/Akt [14].

FehérítésA pigmentfoltok kezelésére hagyományosan olyan szereket használnak, mint a hidrokinon (HQ) és a C-vitamin [15]. A HQ egy hidroxifenol, amely erősen gátló hatással van a melanogenezisre. Azonban a különböző mellékhatások miatt, mint például irritáló vagy allergiás kontakt dermatitisz, köröm elszíneződése és gyengült sebgyógyulás, a HQ használata korlátozott [16, 17]. A C-vitamin gátoljaTYRa TYR aktív helyein rézionokkal kölcsönhatásba lépve, ezáltal csökkentve a melanogenezist.A C-vitamin azonban instabil a késztermékekben. Ezenkívül, ha a C-vitamin koncentrációja meghaladja a 20 százalékot, bőrirritációt okozhat [18]. Ezért nagy a kereslet a sokféle forrásból származó, biztonságos, hatékony, rendkívül stabil és könnyen tárolható természetes összetevők iránt.

Az utóbbi időben több TCM-összetevőről derült ki, hogy hatékonyan gátolja a bőrtpigmentáció, mint például az apigenin és a paeoniflorin [19–21]. A Ben-Cao-Gang-Mu-ban leírt fehérítő aktivitású TCM-eket széles körben használják titkos receptként Kínában, és manapság bebizonyosodott, hogy pigmentációt gátló hatásuk van. Például a Hedysarum multijugum Maxim (az Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge rizómája) kivonata az ERK útvonal gátlása révén bőrfehérítést okoz [22]. A Typhonii Rhizoma (a Sauromatum gigan-teum (Engl.) Cusimano és Hett. rizómája) száraz kivonata hatékonyan gátolja atirozinázaktivitás in vitro [23]. A bizonyítékokon alapuló orvoslás azt is megerősítette, hogy a SapindiMukorossi Semen (a Sapindus mukorossi Gaertn. termése) kivonata, amely gátolja a tirozináz aktivitást, gyógyszerként és kozmetikai adalékként is használható [24]. Egyes hagyományos népi előírásokat is széles körben alkalmaznak, bár nem gyűjtötték össze őket. A San-Bai-Tang (SBT) tipikus példa. Ye et al. kimutatták, hogy az SBT csökkentheti a melanintermelést a p38/MAPK jelátviteli útvonal és a TYR aktivitás gátlásával [25]. Kimutatták, hogy az egyes receptekben leírt egyéb TCM-ek is rendelkeznekbőrfehérítéshatások. A Coicis Semen (a Coix AquaticaRoxb. magja) kivonat gátolja a melanintermelést a MITF, TYR, TRP-1 és TRP-2 csökkentése révén [26]. Sőt, egy cellassay ofTYRkimutatták, hogy az Ampelopsis japonica (az Ampelopsis japonica (Thunb.) Makino rizómája) több mint 50 százalékkal gátolta a gomba TYR aktivitását [27]. Az ezekben az ősi receptekben rögzített fehérítő TCM-ek a modern kísérleti technikák eredményesnek bizonyultak, de legtöbbjük kivonat formájában igazolt, és a hatásos hatóanyagok nem tisztázottak. Ez felkeltette érdeklődésünket a rögzített fehérítő hatású TCM-ek hatóanyagai iránt. ősi előírásokban.

Emellett a TCM-ek vagy receptek összetett összetevőket, változatos hatásmódokat és ismeretlen hatóanyagokat tartalmaznak. Ezen túlmenően az olyan tényezők inkonzisztenciája, mint a nyersanyagok minősége, a feldolgozási módszerek, az előállítási technikák, a készítményben használt összetevők kompatibilitása és az adagolási formák nagyobb hatással vannak a TCM-ek hatékonyságára [19, 28]. Ezért bizonyos TCM-ek használata abőrfehérítéshatása korlátozott. Ezért sürgősen azonosítani kell azokat a hatóanyagokat, amelyek potenciálisan fehérítő hatással bírnak a bőrre, szisztematikus szűréssel, hogy biztosítsák ezen összetevők biztonságát, hatékonyságát és stabilitását.

Az elmúlt években a rendszerbiológia alkalmazása a TCM területén nagy előrelépést tett. A TCM hálózati farmakológiája egy új, több tudományág, amely a TCM-ek farmakológiáját a hálózattudományokkal, rendszerbiológiával, számítástechnikával és bioinformatikával ötvözi [29]. Teljesen megérti a gyógyszerek, betegségek és biológiai rendszerek közötti összetettséget a „komplex-fehérje/gén-betegség” hálózat szemszögéből [30]. A hálózati farmakológia egy hatékony és szisztematikus eszköz a gyógynövénygyógyászat, különösen a TCM farmakológiai hatásának, mechanizmusának, biztonságának és egyéb vonatkozásainak tanulmányozására, és értékes betekintést nyújt a jelenlegi gyógyszerkutatásokhoz [31, 32].

bőrfehérítő összetevők

2. Anyagok és módszerek

2.1. Hálózati farmakológiai folyamat

2.1.1. Vegyi összetevők adatbázis-építése

A vizsgált kísérleti program folyamatábrája az 1. ábrán látható. A Ben-Cao-Gang-Mu-ban és a népi receptekben leírt pigmentációt gátló hatású TCM-eket hálózati farmakológiai elemzéshez használták. A Ben-Cao-Gang-Mu-ban leírt Typhonii Rhizoma, Ricini Semen, Hedysarum multijugum Maxim., Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones és Sapindi MukorossiSemen.fehérítésés sárga csökkentő tulajdonságokkal rendelkezik, és eltávolíthatja az arcfoltokat és az anyajegyeket. A Poria cocos (Schw.) Wolf (a Smilax china L. szkleróciuma), a Paeoniae Radix Alba és az Atractylodes macrocephala Koidz (az Atractylodes macrocephalaKoidz. rizómája), amelyek az SBT alkotórészei, ismerten javítják a bőr textúráját és csökkentik a chloasmátpigmentáció. Egyéb hagyományosan feljegyzett gyógynövények, mint például a Bletilla striata (Thunb. Murray) Rchb.F. (a Bletilla striata(Thunb.) Rchb.F. rizómája), Ampelopsis japonica, A. dahurica (Fisch.)Benth. Et Hook (az Angelica dahurica (Hoffm.)Benth. és Hook.f. rizóma ex Franch. és Sav.), Atractylodes lancea (Thunb.) Dc. (az Atractylodes lancea (Thunb.)DC., a Fructus Ligustri Lucidi és a Coicis Semen rizómáját is bevonták ebbe a vizsgálatba. A tanulmányban szereplő nagyszámú TCM miatt a kínai orvoslás adatbázisainak többszöri átvilágítása zavart okoz az adatfeldolgozásban. Kizárólag a Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology (TCMSP) adatbázist használjuk, amely egy gyakrabban használt adatbázis a nyomon követési szűrésekhez. Ezeknek a TCM-eknek a kémiai összetevőit a TCMSP-ben keresték (frissítve: április 24, 2{5}}20) [33]. A gyógyszerszerűség (DL) és az orális biológiai hozzáférhetőség (OB) általánosan használt szűrési paraméterek. A bőrpigmentációs betegségek gyakori kezelése a helyi vagy szisztémás gyógyszerek; ezért csak a DL-t használtuk szűrési kritériumként. A DL > 0:18-as kiváló komplexeket választották ki, hogy növeljék a gyógyszerjelöltek találati arányát.

2.1.2. A TCM-ek célgénjei és a pigmentációval kapcsolatos gének metszéspontja.

A kapcsolódó génkészletpigmentációa GeneCards adatbázis (frissítve 2020. április 24-én) alapján került kiválasztásra, amelyből az 1-nél nagyobb agene-disease pontszámú célpontokat választották ki. Végül 6180 pigmentációval kapcsolatos célpontot azonosítottak. A TCM-ek célgénjei és a pigmentációval kapcsolatos gének metszéspontját Venn-diagram segítségével szemléltettük [34].

2.1.3. Egy Active Compound-Target-PathwayNetwork felépítése.

A hatóanyagokat és a szabályozott célgéneket a Venn diagram eredményei alapján szűrtük. A hálózatot Cytoscape szoftverrel [35] építettük fel, és a TCM-ek aktív vegyületei és a célgének közötti kapcsolat kimutatására használták.pigmentáció.Az aTCM-ben lévő hatóanyagok által szabályozott minden egyes célgént egy "fokkal" tekintettek. Az egyes TCM-ek átlagos "fokozatú" topológiai paramétereit használtuk a kiválasztott TCM-ek fontosságának értékelésére. A vegyületeket rangsorolták, és az öt legjobb TCM-et választották ki a kulcsfontosságú elemzésekhez. Ezenkívül részletes információkat elemeztek a pigmentációt szabályozó potenciális hatóanyagokról.

2.1.4. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome (KEGG) A potenciálisan hatékony TCM-ek által szabályozott célgének dúsítási elemzése.

Az öt legjobb TCM által szabályozott célgéneket választották ki, hogy meghatározzák a KEGG célútvonalait, és feltárják az ezekben a TCM-ekben található potenciálisan hatékony összetevők lehetséges mechanizmusait.pigmentációA .DAVID bioinformatikai erőforrások 6.8-at használták a KEGG célútvonalak gazdagodásának elemzésére. Felkerültek a hatékony hatóanyagok potenciális célpontjainak génszimbólumai. A kapott génazonosítókat ezután letöltöttük és bevittük a KOBAS3-ba. Azt a gént választottuk ki, amelyik 0.05-nél kisebb p értékeket állított be.

2.1.5. Molekuláris dokkoló szimuláció.

A szitoglusid, arbutin, nikotinamid, HQ, kojinsav és aszkorbinsav 2D szerkezetét a PubChem adatbázisból szereztük be. A kis molekulák mechanikai szerkezetét a ChemBio3D Ultra 14 segítségével optimalizáltuk.0. A gomba 3D kristályszerkezeteTYR(PDB azonosító: 2Y9X, dokkolási koordináták: X =−8:87, Y=−30:74 és Z=−41:52) a Protein Data Bankból származott ( EKT) adatbázis [36]. Hat membránreceptor 3D kristályszerkezete (opioid u receptor, PDB ID: 4DKI; melanocortin 1 receptor, PDB ID: 2L1J; endotelin B receptor, PDB ID: 5GLI; adrenerg receptor, PDB ID: 4GBR; prosztaglandin receptor, PDB ID: 6D26 őssejt faktor receptor, PDB ID: 2EC8) a PDB adatbázisból származnak. A fehérjeszerkezeteket az AutoDock Tools segítségével állítottuk elő vízmolekulák eltávolításával, hidrogének hozzáadásával, valamint nulladrendű kötések létrehozásával fémekhez és diszulfid kötésekhez. Végül az AutoDock Vina 1.1.2 [37] segítségével molekuláris dokkolás szimulációkat végeztünk, az eredményeket pedig a PyMoL 1.7.2.1 segítségével elemeztük.

2.2. Kísérleti validálás

2.2.1. Vegyszerek és antitestek.

A szitoglusidot (tisztaság 98 százalék vagy annál nagyobb) a ChemFaces-től vásároltuk (#CFN98, 713, Chem Faces). A dimetil-szulfoxidot (DMSO) a Sigma-Aldrich cégtől vásároltuk. A semleges paraformaldehidet (4%) a Biosharptól (Hefei, Kína) vásároltuk. A Kojic savat, a Fontana-Masson Stain Kit-et, a nátrium-dezoxikolátot és az L DOPA-t a Solarbio-tól (Peking, Kína) vásároltuk. A Dulbecco módosított Eagle táptalajt (DMEM) a Gibco-tól vásároltuk (#C11995500BT, Gibco). A magzati szarvasmarha szérumot (FBS) és a Cell Counting Kit{7}} (CCK8) a BI-tól (Kibbutz Beit-Haemek, Izrael) vásároltuk. A PMA-t (12-O-tetradekanoilforbol-13-acetát, az ERK/MAPK aktivátor) az APExBIO-tól vásárolták (#N2060, APExBIO). Az anizomicint (a p38/MAPK aktivátort) a MedChem Express-től (HY{15}}, MedChemExpress) vásároltuk. Elsődleges antitestek ras-rokon fehérje Rab-27A (RAB27A) (#69295,CST), extracelluláris szignál-szabályozott kináz (ERK) (#4695,CST), p-ERK (#4370, CST), c- Jun N-terminális kináz JNK (#9252, CST), p-JNK (#4668, CST), p38 (#8690, CST), p38 (#4511, CST), cAMP válaszelem-kötő fehérjeCREB ( #9107, CST) és p-CREB (#9198, CST) a Cell Signaling Technology cégtől vásároltuk. TRP1 (ab235447, Abcam), TRP2 (NBP1-56058, Novusbio), MITF (STJ94134, St. John's Laboratory) elleni elsődleges antitestek,TYR(BS1484, Bioworld) és a GAPDH-t (#AP0066, Bioworld) az Abcam, Novusbio, St. John's Laboratory és Bioworld cégtől vásárolták.

2.2.2. Sejttenyésztés és kezelés.

A melanoszómákban gazdag MNT1 és B16F{2}} széles körben használatos a melanogenezis tanulmányozására [38]. Következésképpen ezt a két sejtvonalat választottuk a következő kísérletekhez. Az MNT1 és B16F0 sejteket 20 vagy 10 százalékos magzati szarvasmarha-szérumban (BiologicalIndustries, Izrael) és 1 százalék penicillin-sztreptomicinben (Gibco) tenyésztettük DMEM-ben. Az összes sejtet nedves inkubátorban tenyésztettük 37 °C-on és 5% CO2-tartalom mellett. A szitoglusidot feloldottuk DMSO-ban, és a DMSO végső koncentrációja a következő volt<0.1%. pma="" and="" anisomycin="" were="" separately="" dissolved="" in="" dmso,="" and="" the="" final="" concentration="" of="" dmso="" was=""><>

2.2.3. Zebrahal tenyésztése és kezelése.

A zebrahal embriót és a tápközeget az EzeRinka Biotech-től (Nanjing, Kína) vásároltuk. A kísérleti protokollt a Közép-Dél Egyetem Harmadik Xiangya Kórházának Etikai Bizottsága hagyta jóvá (No. 2021-S137). A kikelés utáni első napon a zebrahalakat egy 12-lyukú tányérban (10 perwell) neveltük, fénytől védve, és 37 fokon tenyésztettük. A zebrahalat különböző koncentrációjú sitoglusiddal kezelték, és fordított mikroszkóppal 24 órás időközönként fényképeket készítettek, hogy rögzítsék a melanin változásait a zebrahal farkában. A képek elkészítése után különböző koncentrációjú szitoglusid oldatokat olvastunk le és egy héten keresztül folyamatosan rögzítettük.

2.2.4. Sejt életképesség.

A sejtek életképességét CCK8 segítségével értékeltük. MNT1 és B16F{3}} sejteket szélesztettünk 96-lyuk lemezekre 2000 sejt/lyuk vagy 500 sejt/lyuk adenzitással. A sejteket különböző koncentrációjú sitoglusiddal (25, 50, 100, 200, 400, 600 és 800 μM) kezeltük. 24 vagy 48 óra elteltével minden lyukba 10 µLof CCK8 reagenst adtunk, és a sejteket 37 fokon 1 órán át inkubáltuk. Amikor a tápközeg színe narancssárgára változott, a tenyésztést leállítottuk, és mikroplatereader-t (PerkinElmer EnVision Xcite, Egyesült Királyság) használtunk az abszorbancia mérésére 490 nm-en.

2.2.5. Fontana-Masson melanin festés.

A sejteket egy 6-lyukú lemezen tenyésztettük, és különböző koncentrációjú szitoglusiddal kezeltük 2 napon keresztül, és pozitív kontrollként kojsavat adtunk hozzá 200 μM-ban. A sejteket ezután 4%-os paraformaldehidbe helyeztük 15 percre. Vizes öblítés után a sejteket 24 órán át Fontana ammónia-ezüst oldattal inkubáltuk egy sötét kamrában, vízzel öblítettük, majd további 5 percre hiposzulfitba helyeztük. Fordított mikroszkóppal figyelték meg a melanint.

2.2.6. Funkció-helyreállítási kísérlet.

A PMA-t, mint az ERK/MAPK [39, 40] felismert aktivátorát, CCK8-kísérletekkel tesztelték citotoxicitásra különböző koncentrációkban (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 és Miután az MNT1 és B16F0 sejteket különböző koncentrációjú (25, 50 és 100 ng/mL) PMA-val kezeltük 2 órán keresztül, az ERK foszforilációs szintjét Westernblot kísérlettel detektáltuk. A kiválasztott koncentrációnál a sejteket 0, 1, 2, 4, 6 és 8 órával kezeltük, hogy meghatározzuk az aktiválás effektív idejét. Miután a sejteket 48 órán keresztül kezeltük szitoglusiddal (200 μM) és PMA-val (25 ng/ml) (8 óránként ismételten), a fehérjeszintTYRandp-ERK-t észleltek. A Fontana-Masson melaninfestés kimutatta a melanintartalmat. Az anizomicin [41] a p38/MAPK aktivátora, melynek feltárási koncentrációja 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 és 512 nM, a többi kísérleti módszer pedig megegyezik a PMA-val.

2.2.7. TYR aktivitásmérések.

A sejteket különböző koncentrációjú sitoglusiddal kezeltük 2 napon keresztül. Emésztés és centrifugálás után a sejteket megszámoltuk, és kétszer újraszuszpendáltuk foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS). Ezután 500 μl 0,5%-os nátrium-dezoxikolát-oldatot adtunk minden mintához. A mintákat 4 fokon 10 percig, majd 37 fokon 15 percig inkubáltuk. 1 ml 1 százalékos L-DOPA oldatot adtunk hozzá, majd 200 µl-t azonnal egy 96-lyukú lemezre pipettáztunk. Ezt követően egy multimódusú lemezolvasóval mértük az abszorbancia értékeket (A0) 475 nm-en, és a mérést 30 perc elteltével megismételtük (A30).TYRaz aktivitás kiszámítása (A{{0}}A0)/cellaszám.

2.2.8. TYR aktivitásszonda.

Egy közeli infravörös fluoreszcens szonda aTYRA rezorufinon alapuló aktivitást az élő sejtek aktivitásának vizualizálására használták, a korábban leírtak szerint [42]. Röviden, az MNT1 és B16F0 sejteket 6-lyuklemezen tenyésztjük, és különböző koncentrációjú sitogluziddal kezeljük 2 napon keresztül. . 10 μM fluoreszcens próbát adtunk hozzá, és 4 óra múlva a sejteket PBS-re cseréltük. Miután a vörös fény izgató volt, azonnal fluoreszcens inverz mikroszkópot használtak a képek készítéséhez.

2.2.9. Fehérje extrakció és Western blottolás.

Miután a sejteket 2 napig különböző koncentrációjú sitoglusiddal kezeltük, a teljes sejtfehérjét RIPA lízispufferrel (Thermo Fisher) és Proteáz Inhibitor és Fosphatase Inhibitor koktélokkal (Roche) extraháltuk. A fehérjekoncentrációt BCA protein assaykit (KeyGEN Biotec) segítségével határoztuk meg. 1 százalékos BSA-val való blokkolást követően az elsődleges antitestek ellenTYR, MITF, TRP1, TRP2, RAB27A, CREB, p-CREB, ERK, p-ERK, JUK, p-JUK, p38 és p-p38 inkubáltuk a membránokkal egy éjszakán át 4 fokon 1:1000-nél és GAPDH-val 1:3000-nél. A membránokat TBS-T-vel mostuk, és 1 órán át 1:3000 arányban kecske nyúl elleni másodlagos antitesttel inkubáltuk. A kötő antitestet elektrokemilumineszcenciával (ECL) detektáltuk.

2.2.10. Statisztikai analízis.

A statisztikai elemzéshez az SPSS22.{1}} szoftvert, a több csoportos összehasonlításhoz Student-féle t-próbát vagy egytényezős varianciaanalízist (ANOVA) használtunk. A Mann-Whitney U tesztet nem paraméteres adatokhoz használtuk. p < 0:05="" minden="" esetben="" statisztikailag="" szignifikánsnak="" számított.="" ∗∗∗p="">< 0:001,="" ∗∗p="">< 0:01="" és="" ∗p=""><>

3. Eredmények

3.1. TCM-ek összetett összetevői.

Tizennégy TCM-et vizsgáltak, amelyek a Ben-Cao-Gang-Mu-ban és a népi receptekben szerepelnek, és amelyek pigmentáció-ellenes hatással rendelkeznek. A 14 TCM-ből összesen 372 kínai orvoslás összetevőt vettek le a TCMSP adatbázisból (kiegészítő S1 táblázat).

3.2. A TCM-ek és a kapcsolódó pigmentációs gének által szabályozott célgének.

A TCMSP adatbázisban szereplő cél-előrejelzési rendszer szerint összesen 834 célgént kaptunk a 14 TCM-ből. Összesen 9431 gén kapcsolódik ehhezpigmentációa GeneCards adatbázisból lettek lekérve, amelyek közül 6180-at választottak ki, amelyek relevanciapontszáma > 1.

3.3. A 14 TCM és a Disease-Compound-TargetNetwork rangsorolása.

A Cytoscape szoftver segítségével felvettük az egyes TCM és a pigmentációval kapcsolatos gének szabályozó génjeinek metszéspontját, és megkaptuk a potenciális hatóanyagokat és a közös célgéneket. Ezután a betegség-összetevő célhálózat a TCM és apigmentációépült. Ez alapján megkaptuk az egyes hatóanyagok átlagos "fokát", és a TCM-eket pontszámuk szerint rangsoroltuk. A rangsorok alapján az első 5 gyógynövény a Fructus Ligustri Lucidi, a Hedysarum multijugum Maxim., az Ampelopsis japonica, a Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones és a Paeoniae Radix Alba volt (2(a) ábra). Az első 5 TCM 220 célgénjének KEGG-elemzése alapján a gének 19,3 százaléka volt gazdag a PI3K-Akt jelátviteli útvonalban, a gének 13,6 százaléka volt kapcsolatban a TNF jelátviteli útvonallal, és a gének körülbelül 12,3 százaléka kapcsolódott IL-hez. 12}}. Ezenkívül 37 gén vett részt a MAPK útvonalban, és 28 gén a HIF{15}} útvonalban. Ezek az útvonalak szorosan összefüggenek a melanin metabolizmus szabályozásával és a bőrfotózással. A 20 legjobban dúsított jelátviteli útvonal között ezek egynegyedét a gyulladással összefüggő útvonalak tették ki (2(c) ábra). A 2(d)–2(h) ábrák a Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones, Paeoniae Radix Alba és pigmentáció közötti betegségvegyület-célhálózatot mutatják be. Az első öt TCM összetevőinek Venn-diagramja szerint azt találtuk, hogy négy TCM szitoglusidot és béta-szitoszterint tartalmazott (2(b) ábra, S2 kiegészítő táblázat).

3.4. Potenciális hatóanyagok a pigmentáció gátlásában.

A betegség-vegyület-célhálózat szerint 148 összetevő kapcsolódik apigmentáció14TCM-ből szerezték be. Egy irodalmi kutatás során a 148 összetevő közül 25-ről számoltak be, hogy gátolja a melanogenezist. Négy hatóanyagot jelentettek növényi kivonatként, amelyek gátolják a melanogenezist. Tizennégy hatóanyagot tanulmányoztak, és származékairól számoltak be, hogy szabályozzák a pigmentációt. Érdekes módon négy összetevőről kimutatták, hogy elősegíti a melanogenezist, míg hat összetevő mechanizmusa a melanogenezis szabályozásában még mindig nem tisztázott. A fennmaradó 95 lehetséges kínai gyógyászati ​​összetevőt még nem tárták fel a pigmentáció szabályozására. Ezekre az összetevőkre vonatkozó részletes információkat az S3 kiegészítő táblázat tartalmazza.

3.5. A szitoglusid in vitro és in vivo hatásai a melanogenezisre.

A fenti szűrési folyamat után azt találtuk, hogy a felső TCM-ekben négy TCM tartalmazott szitoglusidot és -szitoszterolt. - Beszámoltak róla, hogy a szitoszterol gátolja az alfa-melanocita-stimuláló hormont (-MSH), amely a p38 jelátviteli útvonalon keresztül serkenti a melanogenezist a B16F10 melanomasejtekben [43]. A sitoglusid pigmentáció-ellenes hatásáról és specifikus mechanizmusáról azonban nem számoltak be. Ezért ezekhez a vizsgálatokhoz a szitoglusidot választottuk gyógyszerjelöltnek. A CCK8 vizsgálatot a sitoglusid potenciális toxikus koncentrációinak feltárására végezték MNT1 és B16F0 sejtekben. Az eredmények azt mutatták, hogy a szitoglusidnak nincs nyilvánvaló hatása a sejtek proliferációjára (3(a) és 3(b) ábra) 400 µM alatti koncentrációknál. A 25, 50, 100 és 200 µM szitoglusiddal végzett melaninfestés azt mutatta, hogy a szitoglusid csökkentheti melanintartalom az MNT1 és B16F0 sejtekben dózisfüggő módon (3(c) ábra). Ezenkívül a sitoglusid kezelés jelentősen gátolta a bőrtpigmentációzebrahalban idő- és dózisfüggő módon (3(d) ábra). Ezek az eredmények azt sugallták, hogy a szitoglusid gátolta a melanogenezist in vitro és in vivo.

3.6. A Sitoglusid hatása a TYR expresszióra.

A korábbi eredmények alapján a sitoglusid hatékonyan csökkentheti a melanintartalmat, de még nem ismert, hogyan szabályozza ezt a folyamatot, ezért érdekes. Western blottingot végeztünk a melanogenezishez kapcsolódó gének (TYR, MITF, TRP1, TRP2 és RAB27A) fehérjeszintű expressziójának kimutatására. Az elemzések eredményei azt mutatták, hogy a TYR expresszió szignifikánsan, a MITF és TRP1 expressziója pedig mérsékelten csökkent a sitoglusid-kezelés után. (4(a) ábra). Mivel a MAPK és a PKA a TYR-t szabályozó kulcs-upstream jelátviteli útvonalak, tovább vizsgáltuk a kulcsfontosságú fehérjék változásait ebben a két útvonalban. Miután az MNT1 és B16F0 sejteket 2 napig sitoglusiddal kezeltük, az ERK és P38 foszforilációs szintje jelentősen lecsökkent. , míg nem volt jelentős változás a CREB, ERK, JNK és p38 fehérjék összszintjében, illetve a JNK és CREB foszforilációs szintjében (4(b) ábra, S1A ábra). A CCK8-kísérlet eredményei szerint azt találtuk, hogy az 100 ng/mL alatti PMA nem toxikus mindkét sejtre (S1B ábra), 25 ng/mL PMA pedig nyilvánvalóan növeli az ERK foszforilációs szintjét. Az ERK foszforilációs szintje 4 óra elteltével fokozatosan csökkent (S1C-D ábra). Fontana-Masson melanfestéssel azt találtuk, hogy a PMA jelentősen növelheti az MNT1 és B16F0 sejtek themelanin tartalmát. A Westernblot eredmények azt is sugallják, hogy a PMA növelheti az ERK foszforilációs szintjét, a sitoglusid pedig csökkentheti az ERK PMA által fokozott foszforilációs szintjét. Az ERK foszforilációs szintjének gátlása és az ERK fehérjeszintjének csökkentéseTYR, a sitoglusid csökkenti a PMA által megnövelt melanintartalmat (4(c) és 4(e) ábra, S2A ábra). Ugyanakkor azt találtuk, hogy az anizomicin hasonló eredményeket mutat. A 8 nM alatti anisomicin nem toxikus mindkét sejtre, és 2 nM anisomicin jelentősen megnövelheti a p38 foszforilációs szintjét. 8 óra elteltével a p38 foszforilációs szintje még mindig magas (S1B ábra, S1E-F ábra). A Fontana-Masson melanfestés és a Western blot eredményei arra is utalnak, hogy a sitogluzidán gátolja az anisomicin által felszabályozott p38 foszforilációs szintjét, csökkenti a TYR fehérje tartalmát és gátolja.pigmentáció(4(d) és 4(f) ábra, S2B ábra). Ezért a sitogluzid csökkentheti a TYR expresszióját az ERK/MAPK és a p38/MAPK útvonalak gátlásával. Azonban a mechanizmus, amellyel a sitoglusid gátolja ezeket a jelátviteli útvonalakat, továbbra is tisztázatlan. Nyomon követtük ezen jelátviteli utak upstream membránreceptorait, és molekuláris dokkolást alkalmaztunk a downstream útvonalak szabályozásának mechanizmusának feltárására. A sitoglusid és a hat membránreceptor, azaz az opioid u, a melanocortin 1, az őssejt-faktor, az endotelinB, az adrenerg és a prosztaglandin receptorok közötti kötési energiák -7.8,-5.8, {{9 }},5, -5,4, -3,4 és 0 kal/mol. A molekuláris dokkolás során azt találtuk, hogy a hatmembrán receptorok közül a sitoglusid nagyon nagy affinitással rendelkezik az opioid u, a melanocortin 1 és az őssejt növekedési faktor receptorokhoz (4(g) ábra). Feltételezzük, hogy a sitogluside gátolhatja az ERK/MAPK és a p38/MAPK útvonalakat a fent említett membránreceptorokhoz kötődve, ezáltal csökkentve a TYR expresszióját.

3.7. A Sitoglusid hatása a TYR aktivitásra.

MivelTYRa melaninszintézis kulcsenzime, a melanogenezis gátlásának legkiemelkedőbb célpontja. A legtöbb kereskedelemben kapható kozmetikum vagy bőrvilágosító szer, mint például a HQ, az arbutin és a kojsav, TYR-gátló. Sitoglusidot és néhányat klinikailag használtunkbőrfehérítésszerek (arbutin, nikotinamid, kojinsav, HQ és aszkorbinsav) a TYR molekuláris dokkoláshoz. A szitoglusid és a fent említett szerek közötti részletes kölcsönhatásokTYRaz 5(a) ábrán láthatók. Ennek a hat vegyületnek a kötési energiája: -6,2, -6,4, -5,6, -5,7, -5,4 és{{ 11}},4 kcal/mol, ill. Általában úgy gondolják, hogy ha az affinitási energia -4, az kötőerőt jelez, ha pedig nagyobb vagy egyenlő, mint -7.0, akkor erős kötőerőt jelez. A Sitoglu oldal a második helyen végzett affinitásban, valamivel gyengébb, mint az arbutin, viszonylag kiemelkedő kombinációs képességet mutatva.

Ugyanakkor egy L-DOPA konverziós kísérletet alkalmaztunk a TYR aktivitásának kimutatására, pozitív kontrollként kojsav felhasználásával. Az eredmények azt mutatták, hogy a sitoglusid koncentrációfüggő módon gátolta a TYR aktivitást MNT1 és B16F0 sejtekben, és a magas koncentrációjú csoport (200 μM) a 200 μM kojic-val egyenértékű gátló hatást mutatott. sav (5(b) és 5(c) ábra). Ezenkívül a TYR szonda kísérlet eredményei azt mutatták, hogy a szitoglusid koncentrációjának növekedésével a fluoreszcencia intenzitása fokozatosan csökkent a sejtekben, és a magas koncentrációjú csoport fluoreszcenciaintenzitása megközelítette a 200 μM kojinsavét MNT1 és B16F0 sejtekben (5(d) ábra). S2C ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a szitoglusid hatékonyan gátoljaTYRaktivitást az MNT1 és B16F0 sejtekben. Ezen túlmenően azt feltételezzük, hogy a szitoglusid, mint természetes szterinvegyület, közvetlenül behatolhat a sejtmembránon, és kötődhet a TYR-hez, és gátolja annak aktivitását, ezáltal gátolja a melanogenezist.

4. Megbeszélés

Ebben a tanulmányban hálózati farmakológiát használtunk a potenciális mechanizmusok feltárásárabőrfehérítésA 14 TCM-ben található összetevők, amelyeket a Ben-Cao-Gang-Mu és az infolk előírásai dokumentálnak,pigmentáció. A tanulmány egy innovatív módszert is javasolt, amely az egyes hatóanyagok átlagos "fokozatú" topológiai paramétereit használja a gyógynövények potenciális hatékonyságának értékelésére. Az átlagos "fokozat" szerint a Fructus Ligustri Lucidi, a Hedysarummultijugum Maxim., az Ampelopsis japonica, a PseudobulbusCremastrae Seu Pleiones és a Paeoniae Radix Alba került kiválasztásra, és a KEGG által szabályozott gének váratlan dúsítási analízise révén5 ez az öt dúsított TCM2 százalék. A jelátviteli utak a gyulladáshoz kapcsolódnak, beleértve az IL-17, TNF, HIF-1, PI3K-Akt és MAPK jelátviteli útvonalakat.

A közelmúltban számos gyulladásos mediátorról kimutatták, hogy aktiválják vagy gátolják a melanogenezishez kapcsolódó jelátviteli utakat, amelyek elősegítik vagy gátolják a bőrt.pigmentáció[6]. Tenyésztett B16F10 melanoma sejtek, a TNF- csökkentette aTYRvalamint a TRP1 és TYR aktivitás dózisfüggő módon [44]. Az IL-17 és a TNF- csökkentheti a melanogenezishez kapcsolódó gének expresszióját a melanocitákban, az IL-17 pedig jelentősen fokozhatja a TNF- melanogenezisre gyakorolt ​​gátló hatását. Az etanercepttel (anti-TNF) végzett kezelést követően a melanogenezishez kapcsolódó gének szignifikánsan felszabályozták a pikkelysömörben szenvedő betegek bőrelváltozásait[45]. A HIF-1, a gyulladásos választ szabályozó erőteljes transzkripciós faktor a jelentések szerint részt vesz az olyan faktorok szabályozásában, mint az IL-17 és a TNF- [46–48]. Ezért a HIF-1 valószínűleg részt vesz a melanogenezis szabályozásában azáltal, hogy befolyásolja a gyulladást. Más citokinek, például IL-18, IL-33, GM-CSF és IL-1 elősegítheti a melanogenezist a PKA, MAPK vagy más jelátviteli útvonalak aktiválásával, míg az IFN-, IL-1, IL-4 és IL-6 csökkenti a melanogenezist a STAT1, NF-κB gátlásával, és JAK2-STAT6 jelátviteli útvonalak [6]. Eredményeink azt sugallják, hogy az első öt TCM (Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones és Paeoniae Radix Alba) elsősorban gyulladáscsökkentő utakon keresztül fejthet ki pigmentáció-ellenes hatást. A korábbi irodalom azt is megemlítette, hogy ez az öt legjobb TCM erős gyulladásgátló és öregedésgátló hatással rendelkezik [49, 50]. Ez is alátámasztja azt a feltételezésünket, hogy a TCM-ek nem elhanyagolható szerepet játszhatnak a gyulladás utáni pigmentációban.

A 14 TCM-ben található 148 összetevő szakirodalmának áttanulmányozása során azt is megállapítottuk, hogy a közölt összetevők közül 35 közül közel 70 százalékuk bizonyítottan csökkenti a melanintartalmat vagy gátolja a TYR aktivitását. Ez nem csak azt erősíti meg, hogy az ókori könyvekben szereplő bőrfehérítő receptek nagyrészt megbízhatóak, hanem azt is mutatja, hogy az ókori irodalomra való hivatkozás megbízható módszer a TCM-ekkel kapcsolatos ismeretek megszerzésére. Még mindig 95 olyan vegyület van feltáratlan, amelyek képesek ellenállnipigmentáció. Az öt legfontosabb TCM Venn-diagramjának elemzésével 13 közös összetevőt kaptak. Ezek között in vitro kísérletek igazolták, hogy a daidzein, a rutin és a (plusz)-katekin csökkentheti a melanintartalmat [51–53]. A szacharóz megzavarja a melanoszóma megfelelő érését. ozmotikus stressz indukálásával és a PI3 kináz útvonal gátlásával, ezáltal megzavarva a melanogenezist [54]. A kvercetin csökkenti az oxidatív stressz által kiváltott melanogenezist [55]. Ezenkívül kémiai és fizikai módszerek, például spektroszkópiai és szerkezet-aktivitás-elemzések megerősítették, hogy a lupeoland kaempferol gátolhatjaTYRés csökkenti a melanogenezist[56, 57]. Ez azt jelzi, hogy a hálózati farmakológia lehetséges módszer a kiásásrafehérítésösszetevőket. Az első öt TCM-ből négy TCM tartalmazott sitoglusidot, és nincsenek jelentések arról, hogy a sitoglusid szabályozza-e a pigmentációt vagy a kapcsolódó mechanizmusát. Ezért a szitoglusidot választottuk ezekhez a vizsgálatokhoz.

A szitoglusidról, egy szterin-glikozidról, amely széles körben előfordul a növényekben, daganatellenes, antioxidáns és neuroprotektív hatást fejt ki [58–60]. Ebben a tanulmányban felfedeztük, hogy a sitoglusid hatékonyan csökkentette a melanintartalmat in vitro és in vivo. A későbbi kísérletek bebizonyították, hogy jelentősen csökkentheti a TYR expresszióját. A kojic savat pozitív kontrollként használták, és a melanogenezishez kapcsolódó gének, például a TYR, MITF és TYRP1 fehérjeszintjét is gátolja -MSH stimuláció alatt, amelyről Jeon és munkatársai számoltak be. [61]. Tekintettel az exogén stimuláció hiányára, a 200 μM kojicsavnak csak mérsékelten gátló hatása volt a génexpresszióra vizsgálatunkban, de mivel a kojicacid nagy tirozináz gátló hatással rendelkezik, továbbra is pozitív kontrollként használjuk ebben a vizsgálatban. A TYR expresszióját a MAPKor PKA útvonalak közvetlenül vagy közvetve szabályozzák. Egyre több összetevőről igazolták, hogy fehérítő hatással bír a bőrre azáltal, hogy gátolja a MAPK jelátviteli útvonalat. Például a fargezin csökkenti aTYRa P38/MAPK útvonal gátlásával [62]. A Ganoderma lucidum poliszacharidok képesek ellenállni az UVB-indukált melanogenezisnek azáltal, hogy csökkentik a MAPK útvonalat [63]. Vizsgálatunk szerint a sitoglusid 200 μM koncentrációban csökkentheti a TYR expressziót az ERK/-MAPK és a P38/MAPK jelátviteli útvonalak gátlásával. Ezt a MAPK útvonalak [64] felfelé irányuló membránreceptorai és a sitoglusid közötti molekuláris dokkoláson keresztül jelentették. Azt találtuk, hogy a sitoglusid erősen kötődik az opioid u, a melanocortin 1 és az őssejt növekedési faktor receptorokhoz. Ezért feltételezzük, hogy a sitoglusid kölcsönhatásba léphet ezekkel a membránreceptorokkal, gátolja az ERK/MAPK és P38/MAPK jelátviteli útvonalakat, és csökkenti a TYR expresszióját.

Mivel a TYR a kulcsenzim a melaninrészecskék szintézisében a melanocitákban, a TYR katalitikus helyének aktivitásának gátlása elengedhetetlen a bőr csökkentéséhez.pigmentáció[65]. A piacon számos bőrvilágosító szer TYRactivity inhibitor, mint például a HQ, az arbutin és a kojinsav. Ebben a tanulmányban molekuláris dokkolást alkalmaztunk a sitoglusid és öt gyakori kötőhatás feltárásárabőrfehérítésaktív összetevők (arbutin, nikotinamid, kojsav, HQ, andaszkorbinsav) [66]TYR. Az eredmények azt mutatták, hogy a szitoglusid erős kötődési affinitást mutat a TYR-hez, gyengébb, mint az arbutin, de erősebb, mint a kojsav, a nikotinamid, a HQ és az aszkorbinsav. Az arbutin a HQ prodrugja és egy természetes termék, amely a TYR gátlásával csökkentheti vagy gátolja a melanin szintézisét. Az arbutin természetes formája azonban iszkémiailag instabil, és HQ-vé alakulhat, amely katalizálódik, és benzol metabolitokká metabolizálódik, amelyek potenciálisan toxicithatnak a csontvelőt [67]. A kojinsav kozmetikumok használata korlátozott, mert rákkeltő és a tárolás során fennálló instabilitása miatt [68]. Ezért a szitoglusid, egy természetes szterinvegyület, amely különféle növényekből származik, várhatóan hatásos bőrvilágosító szerként hat. A szitoglusid DMSO-ban való oldhatósága azonban alacsony, ami szintén ennek a természetes összetevőnek a hiányossága. A későbbi kísérleti ellenőrzések kimutatták, hogy a sitoglusid biztonságos az MNT1 és B16F0 sejtvonalakban, és az alacsony koncentrációjú csoport jól gátló hatással volt a TYR aktivitására, míg a magas koncentrációjú csoport ugyanolyan hatást fejtett ki, mint az azonos koncentrációjú kojsav. Ezért a sitoglusid terápiásan alkalmazható bőrfehérítő szabályozóként, amely nemcsak csökkenti a TYR expresszióját, hanem gátolja annak aktivitását is (6. ábra).

5. Következtetések

A hálózati farmakológia talán hatékony eszköz a természetes bőrpigmentációt csökkentő hatóanyagok és lehetséges mechanizmusaik felfedezésére. A Fructus LigustriLucidi, a Hedysarum multijugum maxim., az Ampelopsis japonica, a Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones és a PaeoniaeRadix Alba potenciálisbőrfehérítéstulajdonságai és gátolhatjákpigmentációa gyulladás szabályozásával. A Sitogluside egy regénybőrfehérítéskettős szabályozó hatású hatóanyag, ti. gátlóTYRkifejezés és tevékenység.

cistanche tabletták