Absztrakt

Bevezetés: A propolisz egy gyantás természetes anyag, amelyet a mézelő méhek gyűjtenek össze különböző fák és növények rügyeiből és váladékaiból; széles körben elfogadott, hogy a propolisz összetétele a gyűjtés helyének növényföldrajzi jellemzőitől függ.

A cisztanche glikozidja növelheti az SOD aktivitását a szív- és májszövetekben, és jelentősen csökkentheti az egyes szövetek lipofuscin- és MDA-tartalmát, hatékonyan megkötve a különböző reaktív oxigéngyököket (OH-, H2O₂ stb.) és megvédheti a DNS-károsodást. OH-gyökök által. A Cistanche feniletanoid glikozidok erős szabad gyökfogó képességgel rendelkeznek, nagyobb redukáló képességgel rendelkeznek, mint a C-vitamin, javítják a SOD aktivitását a spermiumszuszpenzióban, csökkentik az MDA-tartalmat, és bizonyos védő hatást fejtenek ki a spermium membrán működésére. A cistanche poliszacharidok fokozhatják a SOD és a GSH-Px aktivitását a D-galaktóz által okozott kísérletileg öregedő egerek eritrocitáiban és tüdőszöveteiben, valamint csökkenthetik a tüdő és a plazma MDA- és kollagéntartalmát, valamint növelhetik az elasztintartalmat. jó eltávolító hatás a DPPH-ra, meghosszabbítja a hipoxia idejét öregedő egerekben, javítja a SOD aktivitását a szérumban, és késlelteti a tüdő fiziológiás degenerációját kísérletileg öregedő egerekben A sejtmorfológiai degenerációval a kísérletek kimutatták, hogy a Cistanche jó antioxidáns képességgel rendelkezik és potenciálisan gyógyszer lehet a bőröregedési betegségek megelőzésére és kezelésére. Ugyanakkor a Cistanche-ban található echinakozid jelentős mértékben képes megkötni a DPPH szabad gyököket, és képes megkötni a reaktív oxigénfajtákat, megakadályozza a szabad gyökök által kiváltott kollagén lebomlását, valamint jó javító hatással van a timin szabad gyökök anionjainak károsodására.

Kattintson a Cistanche Tubulosa Supplement elemre

【További információ: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Célok: Ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy meghatározza Benin (északi, középső és déli) és Kongó (Afrika) különböző régióiban gyűjtött nyolc propolisz-tételből származó etanolos kivonatok fitokémiai összetételét.

Anyag és módszerek:A propolisz minták jellemzését különböző kötőjeles kromatográfiás módszerekkel, szén-13 magmágneses rezonancia (13C NMR) dereplikációval kombinálva végeztük MixONat szoftverrel. Antioxidáns vagy anti-advanced glikációs végtermék (anti-AGE) aktivitásukat ezt követően difenil-pikril-hidrazil, illetve szarvasmarha szérumalbumin vizsgálattal értékelték.

Eredmények: A 13C NMR dereplikációval kombinált kromatográfiás analízis kimutatta, hogy két Benin központjából származó minta hatalmas mennyiségű pentaciklusos triterpéneken kívül metoxilált sztilbenoidokat vagy fenantréneket mutatott ki, amelyek az első esetben felelősek a kivonat antioxidáns aktivitásáért. Ezek közül a kombretasztatin citotoxikus lehet. A második esetben a Macaranga típusú propoliszban ismert prenilált flavanonok felelősek jelentős anti-AGE aktivitásukért. A Kongóból származó minta számos, a Mangifera indica fajhoz tartozó triterpén származékból állt.

Következtetés: Ezért úgy tűnik, hogy a Benin központjából származó propolisz különösen érdekes, antioxidáns és anti-AGE tulajdonságai miatt. Mindazonáltal, mivel a propolisz szabványosítása nehéz a trópusi övezetekben nagy kemodiverzitása miatt, szisztematikus fitokémiai elemzésre van szükség, mielőtt Afrikában népszerűsítenék a propolisz élelmiszerekben és egészségügyi termékekben való felhasználását.

KULCSSZAVAK

13C NMR dereplikáció, metoxilezett sztilbenoidok vagy fenantrének, pentaciklusos triterpének, prenilált flavanonok, propolisz

1. BEMUTATKOZÁS

A propolisz egy természetes gyantaszerű anyag, amelyet a méhek gyűjtenek össze különböző fák és növények rügyeiből és váladékaiból, méhviasszal és nyálenzimekkel keverve.1 A méhek arra használják, hogy megvédjék a bejáratot a behatolóktól, betömjék a lyukakat, simítsák a belső falakat, mumifikálják az elhullott állatokat. (kis rovarok) a kaptár belsejében, és kiegyensúlyozza a szélsőséges páratartalmat vagy aszályos körülményeket.2,3 A propoliszt a népi gyógyászatban az ősidők óta széles körben alkalmazzák terápiás tulajdonságainak széles köre miatt.4 A propolisz általában gyantából áll (50 százalék) , viasz (30 százalék ), olajok (10 százalék ), virágpor (5 százalék ), és további fenolos vegyületek, például flavonoidok.5,6 A propolisz kémiai összetétele összetett, és a kaptár körül növekvő növényfajok szerint változik. , amelyből a méhek a váladékot gyűjtik.7 Elfogadott, hogy több tényező, mint a terület florisztikai összetétele, a gyűjtés helye és ideje, évszak, a gyűjtő típusa, elérhetősége és magassága, valamint a során kialakult táplálkozási tevékenység. a propolisz kitermelése hatással van a propolisz kémiai összetételére.8,9 A propolisznak különböző fajtái vannak, a termőhelytől, a botanikai forrástól és a kémiai összetételtől függően. A propolisz leggyakoribb típusai a mérsékelt égövi, a nyírfa, a trópusi, a mediterrán és a csendes-óceáni.10 A mérsékelt éghajlati övezetekből, például Európából, Észak-Amerikából vagy Ázsia nem trópusi régióiból származó propolisz főként Populus fajok bimbóinak váladékából származik ( Salicaceae) és ezért gazdag flavonoidokban és fenolsavakban és észtereikben; azonban a trópusi propolisz, amely olyan régiókból származik, ahol sem nyár, sem nyír nem terem, gazdag p-kumársav prenilált származékaiban, benzofenonokban vagy terpenoidokban.11 A csendes-óceáni propolisz, amely jellemzően prenilált flavanonokban gazdag, egy másik fontos propolisztípus Tajvanon. , Japánban és a Salamon-szigeteken, a nyír propolisz pedig kifejezetten Oroszországban található.12 A trópusi ázsiai propolisz tanulmányozása a Macaranga denarius L. és a Mangifera indica L. felfedezéséhez vezetett, mint az indonéz propolisz növényi forrásai.13 másrészt a Cupressaceae család tűlevelű fajai a propolisz fő botanikai forrásai a mediterrán régiókban.14 A kémiai elemzések kimutatták, hogy a propolisz több mint 300 különböző természetes terméket (NP) tartalmaz, köztük fenolsav származékokat, kumarinokat, flavonoidokat, szeszkviterpéneket, diterpéneket, triterpének, szteroidok, lignánok vagy prenilált benzofenonok.15 A propolisz biológiai hatásait elsősorban nem csak az antioxidáns,16-18 anti-AGE (azaz az előrehaladott glikációs végtermék [AGE] képződésének gátlása),19 antioxidánsokról írták le. -gyulladásos,20 és daganatellenes hatásuk21–23, hanem antibakteriális,24–26 gombaellenes,15 vírusellenes,27 és parazitaellenes28 hatásuk is. A propoliszról az is ismert, hogy serkenti az antitestek termelését, ami arra utal, hogy vakcinákban adjuvánsként használható.29 Ennek a változatos összetételű természetes anyagnak a növekvő felhasználása, és ennek következtében változó biológiai aktivitása a gyógyszer-, kozmetikai és élelmiszeriparban különös érdeklődést vált ki. a tudományos kutatásban, különösen ha kémiai összetételének meghatározásáról van szó. A legtöbb vizsgálatot Európából19, 30–33 és Latin-Amerikából, pontosabban Brazíliából 20, 23, 34–36 származó mintákon végezték, míg Afrikában kevés vizsgálatot végeztek.37–41 A benini és kongói42 propoliszról kevés információ áll rendelkezésre.

Így ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy jellemezze a főbb vegyületeket Benin és Kongó (Afrika) különböző növényföldrajzi zónáiban gyűjtött propoliszmintákból 13C mágneses magrezonancia (NMR) dereplikációval MixONat szoftverrel.43,44 Előzetes vizsgálat egy adatbázis (DB) felhasználásával, amely tartalmazza A propoliszból korábban közölt NP-k, valamint a 13C előrejelzett kémiai eltolódásaik (δC) nem adtak használható adatot a növényi kivonatokkal általában kapott kielégítő eredményekhez képest.43–45 Ez a propolisz kémiai összetételével magyarázható, amely nagymértékben függ attól. a helyi flórán, lehetetlenné téve a kemotaxonómiai DB megalkotását. Így a benini és kongói propolisz főbb vegyületeinek megfejtésére jelen munkában ultraibolya és evaporatív fényszórás-detektáló tömegspektrometriával (HPLC-UV-ELSD-MS) párosított nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát és tömegspektrometriával párosított gázkromatográfiát végeztünk ( GC-MS) elemzi a nyers propolisz kivonatokat, hogy azonosítsa fő szerkezeti jellemzőit, és megfelelő DB-ket állítson elő a MixONat szoftverhez megfelelő NP-kből.46 Ezután a kémiai profiljuk szerint kiválasztott propoliszminták durva frakcionálása után lehetővé vált a 13C NMR-alapú dereplikáció. a főbb NP-k azonosítása további tisztítás nélkül. Antioxidáns és anti-AGE vizsgálatokat is végeztek.

2. KÍSÉRLETI ELJÁRÁSOK

2.1 Vegyszerek

Az 1,1-difenil-2-pikrilhidrazilt (DPPH), a Folin-Ciocalteu reagenst, a hangyasavat és a gallussavat a Sigma-Aldrich-től (St Quentin Fallavier, Franciaország) vásároltuk, mind analitikai minőségűek. 6-Hidroxi-2, - 5,7,8-tetrametilkromán-2-karbonsav (Trolox®) és 50 - koffeoil-kinsav (klorogénsav) az Acros Organics-tól (Geel, Belgium) szerezték be.

2.2 Propolisz minták

Nyolc benini propoliszmintát gyűjtöttünk kaptárakból kaparva három növényföldrajzi zónában (1. táblázat és SI-1 ábra). A Kongói propolisz mintáját a Kongói Köztársaság közepén, a Bateke-fennsíkon található mesterséges akácerdőben gyűjtöttük (1. táblázat).

2.3 Propolisz extrakció

A propolisz etanolos kivonatait (EEP) kezdetben a következő extrakciós protokoll szerint állítottuk elő.19 A nyers propoliszt először folyékony nitrogén jelenlétében homogén porrá törték. Minden mintánál 1 g propoliszport 20 ml 95%-os etanolban maceráltunk. Szobahőmérsékleten 2 órán át tartó keverés után a keveréket zsugorított üveg tárcsás tölcsérszűrőn (16-40 μm pórusméret) szűrtük. A maradékot kétszer extraháltuk ugyanazon lépésekkel. Ezután a három összegyűjtött szűrletet egy éjszakán át 18 °C-on tartottuk, szűrtük a viasz eltávolítása érdekében, és csökkentett nyomáson (40 °C, 10 bar) bepároltuk, hogy megkapjuk az EEP-ket.

8.{1}} g BC1 (1) és BC2 (2) propoliszport vagy 10,3 g CG-t (3) ismét extraháltunk 95 százalékos EtOH-val (UAE, 4 x 80 ml, 15 perc) további ideig. flash kromatográfia.

2.4 Az összes fenoltartalom meghatározása

A teljes fenoltartalmat a Folin–Ciocalteu kolorimetriás módszerrel határoztuk meg, amint azt korábban leírtuk,19 és nemrégiben adaptálták a mikrolemezeken való közvetlen felhasználásra. Röviden, 10 ul mindegyik propoliszkivonat MeOH-ban (3,5 mg/ml a BC1-hez, 5 mg/ml a BN2-hez, BC2-hez és CG-hez, 7,5 mg/ml a BN1-hez, BS1a-hoz, BS1b-hez és BS2-hez, és 10 mg/ml a BS3-hoz) 20 ul desztillált vízzel és 10 ul Folin-Ciocalteu reagenssel egy 96-lyukú mikrolemezen kevertük össze. 3 perc elteltével 120 ul desztillált vizet és 40 ul 20%-os vizes nátrium-karbonát-oldatot adtunk hozzá. Az abszorbanciát TECAN® mikrolemezes spektrofotométeren (V6.5) mértük 760 nm-en, 30 percig sötétben, szobahőmérsékleten. Hasonló módon vakmintát készítettünk, az extraktumoldat helyett MeOH-t használva, és gallussavat használtunk a kalibrációs görbe kiszámításához (0,04–0,328 mg/ml; y=2,7241x 0,0039; r2=0 .9982). Minden mintát három párhuzamosban elemeztünk. A teljes fenoltartalmat galluszsav-ekvivalensben (mg) a kivonat grammjára vonatkoztatva (mg GAE/g) fejeztük ki.

2.5 Előzetes kromatográfiás elemzések

2.5.1 Analitikai TLC

Az analitikai vékonyréteg-kromatográfiát (TLC) TLC Alugram Xtra SIL G/UV254-en (Macherey-Nagel, Düren, Németország) hajtottuk végre, eluálószerként ciklohexán:AcOEt elegyet használva. A kromatogramon lévő foltokat először UV-fényben (254 nm), majd vanillin-kénsav reagenssel (2 ml tömény kénsav 98 ml 1:99 tömeg/térfogat arányú vanillin:95 százalékos etanol oldatban) permeteztük. a kromatogramokat 110 °C-ra melegítjük 5 percig.

2.5.2 GC-MS eljárás

A GC-MS analízist nem származékos mintákon végeztük Shimadzu gázkromatográf GCMS-QP2010 SE (Noisiel, Franciaország) segítségével, 70 eV ionizációs feszültséggel (elektronikus). Hatás). A mintákat diklór-metánban (DCM) készítettük 2 mg/ml koncentrációban a kivonatok és 1 mg/ml koncentrációjú frakciók esetében. Az elválasztásokat Phenomenex ZB5 oszlopon (30 m*0,250 mm belső átmérő 0,25 mm filmvastagsággal; Phenomenex, Le Pecq, Franciaország) végeztük. A hőmérsékletet a következőképpen programoztuk: 180 °C (3 perc), 180–280 °C 10 C/perc sebességgel és 280 °C (27 perc). Héliumot használtunk vivőgázként 2,0 ml/perc áramlási sebességgel. Az injektor és a detektor hőmérsékletét 250 C-ra, illetve 280 C-ra állítottuk be. A metabolitokat úgy azonosították, hogy összehasonlították retenciós idejüket (Rt), névleges tömegüket és/vagy fragmentációs mintázatukat az autentikus mintákéval és/vagy a berendezés fragmentációs mintázat-könyvtáraiban (NIST11, NIST11s és FFNSC2) lévőkkel.

2.5.3 HPLC-DAD-ELSD eljárás

A kromatográfiás elemzéseket egy diódasorral felszerelt Shimadzu 2030C 3D folyadékkromatográf (Noisiel, Franciaország) segítségével végeztük.detektor (DAD) és ELSD (Sedere®) Lichrospher® oszloppal 1{{10}}0 RP-18 (125 mm * 4 mm belső átmérő, 5 μm, Merck, Darmstadt, Németország ) Lichrocart® 4–4 védőpatronnal védett (4 mm*4 mm belső), 1 ml/perc áramlási sebesség mellett. A mozgófázis 0,1 százalék hangyasavat tartalmazott vízben (A oldószer) és metanolt (B oldószer), az elválasztást a következő lineáris gradienssel végeztük: 25-100 százalék B (0-40 perc), 100 százalék (40-45 perc). min). Az UV-vis spektrumot 190-600 nm tartományban vettük fel, a kromatogramokat 254 és 280 nm-en vettük fel. Az ELSD-t 30 °C-ra melegítettükfokozatC, és 4-es erősítést alkalmaztunk a jelre. A mintákat 10 mg/ml koncentrációban állítottuk elő MeOH-ban, és 13, 000 g-vel centrifugáltuk 10 percig az injekciózás előtt (10 ul), hogy eltávolítsuk a szuszpendált anyagok nyomait.

2.5.4 HPLC-UV-MS eljárás

A HPLC-UV-MS elemzéseket Dual λ 2487 Waters detektorral felszerelt 2795 Waters elválasztó modullal (Guyancourt, Franciaország) végeztük. Az oszlop, a mozgófázisok és a gradiens megegyezett a HPLC-DAD-ELSD-nél leírtakkal. A kromatogramokat 254 és 28{16}} nm-en vettük fel. A tömegelemzéseket egy Bruker (Bréma, Németország) elektrospray ionizációs/atmoszférikus nyomású kémiai ionizációs (ESI/APCI) Ion Trap Esquire 3000 plus készüléken végeztük, mind pozitív, mind negatív módban, az alábbiak szerint: ütközési gáz, He; ütközési energia amplitúdója, 1,3 V; porlasztó és szárítógáz, N2, 7 L/perc; a porlasztógáz nyomása, 30 psi; száraz hőmérséklet 340 C; áramlási sebesség, 1,0 ml/perc; oldószerelosztási arány, 1:9; pásztázási tartomány, m/z 100–1, 000. A mintákat 10 mg/ml koncentrációban készítettük elő MeOH-ban, centrifugáltuk 13 000 g-vel 10 percig, majd injekciózás előtt (20 ul) 0,{27}} μm-es politetrafluoretilén (PTFE) membrános fecskendőszűrőn szűrtük át a nyomok eltávolítására. felfüggesztett anyagokból.

2.6 EEP frakcionálás gyorskromatográfiával

Először 3,8 g BC1-et (1), 3,5 g BC2-t (2) vagy 4.{9}} g CG (3) EEP-t oldottunk fel minimális térfogatú DCM-ben és acetonban, és összekevertük szilikagéllel (szilikagél). gél:kivonat arány, 2:1). Mindegyiknél az oldószert hagytuk elpárologni, amíg finom száraz port nem kaptunk. Minden egyes EEP esetében a frakcionálást CombiFlash Teledyne ISCO készülékkel (Lincoln, NE, USA) szilikagél oszlopon (Chromabond® Flash RS 4{{20}} SiOH, 4{{83}) végeztük. } g, Macherey-Nagel, Hoerdt, Franciaország) 25 ml/perc áramlási sebességgel ciklohexánnal (A oldószer) és etil-acetáttal (EtOAc) (B oldószer) a következő gradienselúcióval: (1) BC1 EEP esetén, 5 százalék B (0-10 perc), 5-20 százalék B (10-30 perc), 20-30 százalék B (30-60 perc), 30-50 százalék B (60-85 perc) és 50-100 százalék B (85–110 perc); 160 db 20 ml-es csövet gyűjtöttünk össze, és 14 frakcióra (BC1_F1-BC1_F14) egyesítettük a vékonyréteg-kromatográfiás profiljuk alapján (ciklohexán:EtOAc arány, 90:10-50:50). ); (2) BC2 EEP esetén 5 százalék B (0–10 perc), 5–10 százalék B (10–20 perc), 10–30 százalék B (20–40 perc), 30–40 százalék B (40–55 perc) min), és 40–100 százalék B (55–70 perc); 100 db 20 ml-es csövet gyűjtöttünk össze, és 8 frakcióra egyesítettük (BC2_F1-BC2_F8) a vékonyréteg-kromatográfiás profiljuk alapján (ciklohexán:EtOAc arány, 90:10-60:40). ); (3) CG EEP esetén 5 százalék B (0–10 perc), 5–10 százalék B (10–30 perc), 10–20 százalék B (30–50 perc), 20–40 százalék B (50–70 perc) min), 40–60 százalék B (70–80 perc) és 60–100 százalék B (80–90 perc); 135 db 20 ml-es csövet gyűjtöttünk össze, és 23 frakcióra (CG_}F1-CG_F23) egyesítettük a vékonyréteg-kromatográfiás profiljuk alapján (ciklohexán:EtOAc arány, 80:20-60:40). ).

Egy további frakcionálási lépést végeztünk a BC{{0}}F7 frakción: 200 mg-ot feloldottunk minimális térfogatú MeOH-ban, és összekevertük C18-szilikagéllel (C18-szilikagél). gél:kivonat arány, 2:1). Az elválasztást C18 oszlopon (Interchim® PF-C18HP, 4 g, Montluçon, Franciaország) végeztük 15 ml/perc áramlási sebességgel vízzel (A oldószer) és MeOH-val (B oldószer) a következő gradiens elúcióval: 50- 70 százalék B (0–30 perc) és 70–100 százalék B (30–40 perc); 80 db 8 ml-es csövet gyűjtöttünk össze, és 5 frakcióra egyesítettük (BC2_F7-1 - BC2_F7-5) a HPLC-UV (280 nm) profiljuk alapján. .

2.{1}} H és 13C NMR elemzések

A propoliszfrakciók (7–58 mg) vagy néha NP-k NMR-spektrumait (1D és 2D) deuterált kloroformban (CDCl3) vagy deuterált metanolban (CD3OD) (500 ul) vettük fel JEOL NMR-spektrométeren 400 MHz-en 1 H és 100 óra között. MHz 13C esetén. Az NMR-kísérleteket (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT-135, DEPT-90 és 2D NMR) frakciókon és tiszta NP-ken 298 K-en végeztük JEOL 400 MHz H spektrométeren (JEOL Europe, Croissy). -sur-Seine, Franciaország) inverz 5-mm-es szondával (ROYAL RO5). A kémiai eltolódásokat (δH és δC) ppm-ben, a J értékeket Hz-ben fejezzük ki.

A 13C NMR (100 MHz) spektrumokhoz WALTZ-16 szétcsatolási szekvenciát használtunk 1,04 s gyűjtési idővel (32 768 összetett adatpont) és 2 s relaxációs késleltetéssel. 1500 és 11 között 000 szkennelést gyűjtöttünk össze, hogy kielégítő S/N arányt kapjunk. A Fourier-transzformáció előtt minden szabad indukciós lecsengésre (FID) egy 1 Hz-es exponenciális vonaltágító szűrőt alkalmaztunk. A spektrumokat manuálisan fázisozták és az alapvonal-korrekciót a MestReNova szoftverrel (Mestrelab Research, Santiago de Compostela, Spanyolország) végeztük, és a deuterált oldószer központi rezonanciájára vonatkoztatva δC 77,16 ppm (CDCl3) és δC 49,00 ppm (CD3OD) értéknél. A torzításmentes polarizációs átviteli (DEPT) kísérletekhez 512 és 5500 közötti pásztázásra volt szükség, és a 13C spektrumokhoz igazítást végeztünk egy adott δC használatával. Ezután egy minimális intenzitási küszöbértéket alkalmaztak a pozitív 13C NMR és DEPT-90 jelek, valamint a pozitív és negatív DEPT-135 jelek manuális gyűjtésére, miközben elkerülték a lehetséges zajműtermékeket.

A propolisz DB1-et először a propoliszban leírt vegyületek SciFindern segítségével 47 építettük fel, ami 1471 NP-s DB-t eredményezett; A δC értékeket Advanced Chemistry Development (ACD) NMR prediktorok (C, H) segítségével jósoltuk meg. Az ilyen NP-ket és azok δC-SDF értékeit tartalmazó DB-kből a MixONat-ban szereplő CTypeGen rutin megfelelő DB-t hozott létre: beolvassa a térbeli adatfájlt (SDF), és széntípusok szerint rendezte a kémiai eltolódásokat. Ezután létrejött a szükséges c-típusú SDF, azaz a c-típusú Propolis DB1.43,44

Stilbenoids{0}}Phenantrenoids DB2 létrejött. A 276 518 NP-t48 tartalmazó LOTUS DB-ben (LOTUS, 2022) a stilbenoids és phenantrenes kulcsszavak használatával végzett anyagok keresése lehetővé tette, hogy SDF-ként 2681 NP-t tartalmazó Stilbenoids_Phenantrenoids DB2-t kapjunk. Ezután létrehozták a Flavanones DB3-at: A SciFindern47-en végzett keresés a 2-fenilkroman-4-egy alstruktúrával lehetővé tette 56 679 molekula kiválasztását. Tovább csökkentették 2893-ra a "természetes termékek előfordulására" hivatkozva, az anyagok elemzése alapján a SciFindern által javasolt "Referenciaszerep" szűrővel. A várt molekulatömeg (MW) (azaz 340-424 Da) alapján végzett szűrési lépéssel végzett további finomítás után az összes releváns flavanont SDF-ként exportálták, hogy a Flavanones DB3-tól nyerjék el az NP-ket (684 NP). A DB2 és DB3 minden egyes NP-jére a δC-SDF értékeket ACD NMR prediktorok (C, H) szoftverrel, valamint a Nuzillard46 által korábban leírt módszerrel jósoltuk meg, hogy közvetlenül megkapjuk a MixONat általi használatra kész c-típusú SDF-et. Ez utóbbi tartalmazza a DB minden egyes vegyületére a megjósolt δC értékeket metil-, metilén-, metin- vagy kvaterner szénatomok formájában.

A Triterpenes DB4 a PNMRNP3 DB49,50-ből épült fel, amelyet SDF-ként importáltak az ACD NMR prediktorok (C, H) szoftverébe, 100 és 500 Da közötti MW-értékű triterpének keresésével (vagyis keresési adatok: triterpének; keresési MW: 100 és 500 között). hogy közvetlenül megkapja a 6623 triterpénből álló DB-t a szükséges c-típusú fájlformátumban.

Alk(en)il-rezorcin és fenolszármazékok A DB5 a PNMRNP3 DB49,50-ből épült, amelyet SDF-ként importáltak az ACD NMR-prediktorok (C, H) szoftverbe úgy, hogy m-alk(en)il-fenol vázzal NP-ket kerestek, és fenolok közé soroltak. (pl. 3-(hexadec-8-en-1-yl)phenol Alstruktúra keresés; Classyfire osztály keresése: fenol), hogy közvetlenül megkapja a 44 NP-ből álló DB-t a szükséges c-típusú fájlformátumban.

2.{1}}C NMR-alapú replikáció a MixONat szoftverrel

Az egyes kísérleti spektrumokból (13C NMR, DEPT-135 és DEPT-90) kapott csúcslista és intenzitásadatokat . csv fájl Microsoft Excel (Microsoft 16.45) szoftverrel, és bemeneti fájlként használható a MixONat szoftverben. Az ilyen fájlok a δC értékek listáját tartalmazzák, csökkenő sorrendben az intenzitásukhoz társítva, ugyanazon a sorban, vesszővel elválasztva.

Data were then processed using MixONat, which exploits any dataset that provides molecular structures in the previously described SDF (i.e., c-type DB1–5 file format). Based on this information, MixONat was used to compare the experimental δC values of the fractions to the predicted δC-SDF values from the DB and made suggestions for specific NPs potentially present in the analyzed sample. In the end, MixONat provided NP proposals with scores ranging from 0 to 1, i.e., from 0% to 100% (where 1 corresponds to a perfect match and 0 indicates no similarity for a given compound from the used DB). Acceptable values for putative identification were >0.70. Ezt követően a legjobb pontszámot elért NP-k kísérleti adatait összehasonlítottuk az irodalommal.

2.9 Tisztítás

2.9.1 Preparatív HPLC

A BC{{0}}F6 és BC1_F8 (40 mg 2 ml MeOH-ban) frakciók tisztítását Shimadzu LC-20AP preparatív segítségével végeztük. folyadékkromatográf SPD-40 UV-vis detektorral (Noisiel, Franciaország), 2 ml-es injekciós hurokkal és FRC-10A frakciógyűjtővel, C18 (25{{39) preparatív oszlop használatával }} mm 21,2 mm belső átmérőjű, 5 μm) (Pursuit XRs 5, Agilent, Les Ulis, Franciaország) 21,24 ml/perc áramlási sebesség mellett. A mozgófázis 0,1% hangyasavat tartalmazott vízben (A oldószer) és metanolban (B oldószer), és az elválasztást a következő gradiens alkalmazásával végeztük: (1) BC1_F6 esetén 40% B (0-5) min), 40–70 százalék B (5–20 perc) és 70–90 százalék (20–30 perc); (2) BC1_F8 esetén 40–70 százalék B (0–15 perc) és 70–90 százalék (15-25 perc). A kromatogramokat 254 és 280 nm-en vettük fel.

2.9.2 Szilárd fázisú extrakció (SPE)

A BC2-EPP legpolárisabb frakciójának (200 mg 5 ml MeOH-ban, 350 mg C18-szilikagéllel keverve bepárlás után) előállításához a tisztítást C18 szilárd fázisú extrakciós oszlopon végeztük. (2 g/15 ml, Thermo Scientific™, Villebon-sur-Yvette, Franciaország) vízzel: MeOH 7:3 (10 ml) és víz: MeOH 6:4 (10 ml). A 4–10. csöveket egyesítettük, hogy a HPLC-UV (330 nm) profiljuk alapján a BC2 poláris frakcióját (BC2_SPE) hozzuk létre.

2.10 Antioxidáns és anti-AGE vizsgálatok

2.10.1 A DPPH gyökök eltávolítása

A benini EEP-ek DPPH gyökfogó kiértékelését a korábban leírtak szerint végeztük.51 Röviden, a vizsgált mintákat abszolút EtOH-val hígítottuk 0.02 mg/ml 1 mg/ml-es dimetil-szulfoxidos törzsoldatokból. (DMSO). Ezeknek a hígított oldatoknak alikvotjait (100 ul) 96-lyukú lemezekre helyeztük három párhuzamosban. Körülbelül 25 ul frissen készített DPPH-oldatot (1 mM) adtunk 75 ul abszolút EtOH-hoz mikrolemez-leolvasó injektorral (Infinite® 200, Tecan, Franciaország), hogy lyukanként 200 ul végső térfogatot kapjunk. Sötétben, környezeti hőmérsékleten 30 percet követően az abszorbanciát 517 nm-en határoztuk meg. Vakmintaként EtOH-t használtunk, míg a kalibrációs görbéhez Trolox (hidrofil -tokoferol analóg) 10, 25, 50 és 75 μM oldatait használtuk. Minőség-ellenőrzési standardként klorogénsav-etanolos oldatot (0,02 mg/ml) használtunk. Az eredményeket Trolox-ekvivalensben fejeztük ki (mikromol TE/g kivonat).

2.10.2 Anti-AGE vizsgálat

A propolisz kivonatok és az öt fő izolált naringenin származék AGE képződésre gyakorolt ​​hatását a korábban leírtak szerint határoztuk meg.51 Röviden, a szarvasmarha szérumalbumint (BSA) (10 mg/ml) D-ribózzal ({{) inkubáltuk. 13}},5 M) a vizsgált vegyülettel (3 µM-3 mM) vagy kivonattal (1 ug-1 mg) együtt 50 mM foszfátpufferben 7,4 pH-n (NaN3, 0,02 százalék). Az oldatokat 96-lyuk mikrotiter lemezeken inkubáltuk 37 °C-on 24 órán keresztül zárt rendszerben, mielőtt az AGE fluoreszcencia mérést elvégeztük. Az azonos körülmények között, D-ribóz nélkül inkubált mintából származó fluoreszcenciát minden mérésnél levontuk. A pentozidinszerű (gerjesztés 335 nm-en, emisszió 385 nm-en) AGE fluoreszcenciát fluorometriával mértünk.52 IC50 értékeket úgy határoztunk meg, mint a kivonat (ug/ml) vagy a pozitív kontroll (μM) mennyiségét, amely az AGE képződés 50%-os csökkentéséhez szükséges. a negatív kontrollhoz képest. A statisztikai validációs vizsgálat53 szerint egyetlen elemzés elegendő a pontos IC50 meghatározásához.

3. EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS

3.1 Kromatográfiás profilalkotás

A nyolc benini és kongói EPP általános LC-profilozása a kvázi univerzális ELSD detektor segítségével azt mutatta, hogy minden minta nem poláris vegyületeket tartalmazott, amelyek a kromatogramok végén eluálódnak (1. ábra). A BC1 nagy mennyiségű polárisabb vegyületet is bemutatott, a BC2 pedig néhány közepesen poláris vegyületet mutatott ki kisebb mennyiségben. Úgy tűnt, hogy a CG EEP-ben a nem poláris vegyületek meglehetősen különböznek a benini vegyületektől.

Így az ELSD profilalkotás három különböző és eredeti mintához vezetett, amelyek összetételét tovább vizsgálták: BC1, BC2 és CG.

Először is GC-MS elemzéseket végeztek, összehasonlítva az MS fragmentációt a NIST DB-vel, hogy jellemezzék a kémiai osztályokat, és lehetőség szerint azonosítsák az összetevőket. A feltételezett azonosítást (a NIST DB-vel való egyezés százalékos aránya alapján) és a vegyületek kémiai osztályait a 2. táblázat mutatja be (a GC-teljes ionáram [TIC] profilozási adatai az SI-2 ábrán láthatók).

Minden benini EEP ugyanazt a nem poláris vegyületek profilját mutatta be, amelyeket A-tól F betűig jelöltek, de mennyiségük változhat. Feltételezhetően - vagy -amrinon (A), -amirin (B), lupenon (C), -amirin (D), - vagy -amirin-acetát (E) és lupeol-acetát (F) néven azonosították őket (vö. SI ábra). -3), a mexikói propolisz fő NP-jeként már leírták.54 Zhang et al. (2014) és Tamfu et al. (2020) a triterpenoidokat amirin/lupeolként és amirin/lupeol-acetátként írták le különböző afrikai propolisz mintákban.41,55 Csak a BC1 mutatott be további NP-ket, amelyek Rt 10 és 15 perc között eluálódnak, melyeket fragmentációs mintázataik alapján metoxilált sztilbenoidoknak vagy fenantréneknek neveztek. A kongói EEP a beniniekétől eltérő profilt mutatott: a C16 és C18 sav-etil-észterek illékonyabb vegyületek, amelyek jó, 94 százalékos egyezési pontszámmal, fenol-származék Rt 13,1 percnél, három rezorcin-származék a 14-14-es tartományban. 17 perc, a különböző típusú triterpén származékok pedig Rt 21 perc után.

Ezenkívül az EPP-ket HPLC-DAD-MS-sel elemeztük a nem illékony NP-k megjelenítésére (vö. SI-4 ábra). A különböző profilalkotások azt mutatták, hogy a BC1 EEP nagy mennyiségű közepes poláris vegyületet mutatott 280 nm-en elnyelő kromoforokkal, valamint kisebb arányban a BC2, és a CG nagyon gyenge UV-profilt mutatott 280 nm-en.

3.2 A BC1 és BC2 kémiai összetétele

A főbb NP-ik azonosításához a MixONat és a megfelelő DB-k alapján végzett 13C NMR dereplikáció segítségével a BC1 és BC2 EEP durva frakcionálását gyorskromatográfiával sikerült elérni. Valójában a BC1 esetében a GC-MS analízis feltárta a metoxilált sztilbenoidok vagy fenantrének jelenlétét, amelyek a specifikus sztilbenoidok_fenantrenoidok DB2 megalkotásához vezettek bennünket. A BC2 esetében, kivéve a polárisabb vegyületeket 3,8 perc Rt-nél, minden vegyület flavanon-dihidroflavonolok UV-spektrumát mutatta, ami a Flavanones DB3 létrehozását javasolta.

A 3. táblázatban látható módon a BC1 EEP-ben az 1. és 3–5. dihidrofenantrént, a 2. és 6. fenantrént, valamint a 7. dihidro-stilbént (2. ábra) javasolta a MixONat, és az irodalmi adatokkal összehasonlítva validálta (vö. alátámasztó információk). Szükség esetén MW szűrőt használtunk a HPLC-MS adatok alapján.

Pontosabban, a DB2-ben található 2681 NP közül a 9,10-dihidrofenantrén-származék közül a MixONat a 6-metoxicoelonint (2,7-dihidroxi-3,5-dimetoxi{) javasolta. {10}}, dihidrofenantrén; 3, 1. helyezés, pontszám 0,75, SI-13 és SI-14) Kr.e.{{ 18}}F5 és jelenlétét a publikált NMR adatokkal összehasonlítva igazoltuk. A Combretaceae fajokból56 és a Bulbophyllum vaginatum orchideából még azonosították; 57 és 2,7-dihidroxi-3,4,6-trimetoxi- 9,10-dihidrofenantrén (4, 1. helyezés, 0,88 pont, SI{{33) }} és SI-16) BC1_F2-ben feltételezték. A 4. vegyületet már leírták a szenegáli propoliszban58, és jelenlétét Pettit és munkatársai által közölt adatok alapján validálták. az afrikai Combretum caffrum fáról59 és Lu et al. a Dioscorea nipponica Makino.60

A 13C NMR-alapú dereplikációs folyamat 2,6-dihidroxi-3,4,7-trimetoxi-9,10-dihidrofenantrént is jósolt (5, 8. helyezés, pontszám 0.76, SI-15 és SI-16) ábra BC1_F2 és 2,6,7-trihidroxi{{20 }},4-dimetoxi-9,10-dihidrofenantrén (1, 2. helyezett, pontszám 0,5, SI-5 és SI-6 ). Az 1-es pontszám meglehetősen alacsony volt (0,5); ezért további 2D NMR-kísérleteket (heteronukleáris többszörös kvantumkorrelációk [HMQC], heteronukleáris többszörös kötéses kapcsolat [HMBC], nukleáris Overhauser-effektus-spektroszkópia [NOESY], vö. SI-7–SI-10 ábrákat) végeztünk. a szerkezet megerősítése érdekében; 5-nél a pontszám 0,76 volt, azaz magasabb, mint 0,70. Ezt a két NP-t (1 és 5) először Letcher és munkatársai említették. a Combretum fajokban61,62 és 1-et a szenegáli propoliszban már találtak.58

A fenantrén-származékok közül a MixONat 2,6,7-trihidroxi-3,4-dimetoxifenantrént feltételezett (2, 1. helyezett, pontszám 0.88, SI-11 ábra és SI{{10}}) a BC1_F8-1-ban, amit a Letcher és munkatársai által leírt spektrális adatokkal való összehasonlítás igazolt. a Combretum apiculatumban. 61 2,7-Dihidroxi-3,4,6-trimetoxifenantrén (6, 5. helyezés, 0,94 pontszám, SI-17 és SI-18 ábra) A korábban Photolida Chinensis63-ból izolált vírust a Kr.e.1_F4-ben javasolták.

A kombretasztatin B{{0}} (7), egy dihidro-stilbén, a MixONat javasolta az első helyen (pontszám: 1,0, SI-17 és SI-19 ábra) a BC1 EPP-ben. MW szűrő (MW 304 Da), és a Pettit és munkatársai által leírt NMR adatokkal való összehasonlítással validáltuk. in Combretum caffrum. 59

A 2., 6. és 7. számú vegyületet a szenegáli propoliszban már azonosították.58

Az 1-7 közötti 1H- és 13C-NMR-adatok az alátámasztó információk között találhatók.

A BC2 esetében hét vegyületet azonosítottak, amelyek a polifenolok két szerkezeti osztályába tartoznak, a kromon-C-glükozid és a prenilflavanon származékok (8–14), amelyek közül néhányat először írtak le propoliszban (3. ábra).

A 13C NMR-alapú folyamat a MixONat és a DB1 to DB5 használatával nem adott releváns eredményeket, amelyek eredeti NP-kre utalnának. Két fő terméket (8–9) teljesen keverékként jellemeztek tömegspektrumok, valamint 1D és 2D NMR adatok (1H, 13C, HMQC, HMBC, vö. SI-20–SI-23) segítségével. és florinként (8) és izobiflorinként (9) azonosították, két kromanon-Cglükozidot, amelyet újonnan írtak le a propoliszban, korábban a Pancratium biflorum64-ben és az Eugenia caryophyllata szegfűszegben.65

Ami a flavanonszármazékokat illeti, a DB3-ban a 688 NP közül a MixONat a 6-prenilnaringenint javasolta (10, 1. helyezés, 0.95 pontszám, SI- 24 és SI{{8. ábra). }}) már leírták a nigériai vörös propoliszban66 Kr.e.{{10}}F7-1. 6,8-Diprenylaromadendrin (12, 1. helyezés, 1. pontszám.0, SI-28 és SI-29 ábra) és 6,8-diprenilnaringenin (lonchocarpol A) ) (13, rang 10, pontszám 0,84, SI-30 és SI-31 ábra), amelyet korábban kameruni propolisz mintákban találtak,42 a Kr.e.2_F{ {30}} és BC2_F5. 6-A korábban a Salamon-szigetekről származó propoliszban leírt geranilnaringenint (14, rang 1, pontszám 0,84, SI-32 és SI-33)67 feltételezték és megerősítették Kr. e.{{41 }}F7-5. Végül a 6-dimetilallil-naringenint (11) javasolta a MixONat a második helyen a BC2_F6-ban (2. helyezett, 0,65 pontszám, SI-26 és SI- 27 ábra). A 8. pozícióban lévő izomert javasolták az első pozícióban, de a 68, 69 irodalmi adatokkal való összehasonlítás azt mutatta, hogy ez a 6. pozícióban lévő izomer. A 11. vegyület új volt a propoliszban, de már leírták a Monotes africanus szerves kivonataiban. 70 1 A 8–14 H- és 13C-NMR-adatok az alátámasztó információk között találhatók.

【További információ: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】