A Cistanche poliszacharidok apoptotikus hatása a leukémiára
Apr 20, 2022
Szerző:
LI Yan,ZHANG Jin,ZHANG Jing-Nan,et al.
Belső-Mongólia, Kína
Az apoptotikus hatás vizsgálatáraCisztanche poliszacharidok( CDP) emberenakut leukémiasejtvonal Jurkat sejtek.MódMTT vizsgálatot alkalmaztunk a CDP sejtproliferációra gyakorolt hatásának kimutatására, Western blottingot használtunk a kaszpáz-9 és a kaszpáz-3 aktiválásának kimutatására., és az apoptotikus szignálmolekulákat is tesztelték.eredményekA T-sejt proliferációt 1 mg/ml és 2 mg/ml CDP gátolta, A T-sejtek apoptózisát 5 mg/ml CDP indukálta, ésa pro-kaszpáz-9 és a pro-kaszpáz-3 kifejeződése jelentősen csökkent. A CD45 és CD71 sejtfelszíni receptorok expresszióját 5 mg/ml CDP szignifikánsan gátolta, EＲK foszforilációt indukáltunk, és a JNK foszforilációja gátolt.
Következtetések
【Kulcsszavak】Cisztanche poliszacharidok; Apoptózis; Ｒreceptor; kaszpáz-9; kaszpáz-3
Az akut limfoblasztos leukémia (ALL) a nyirokrendszer rosszindulatú klonális betegsége, amely nagyfokú immunfenotípus heterogenitással jár. , könnyen visszaesik, és így tovább. Jelenleg a leggyakrabban alkalmazott kezelési módszerek közé tartozik a csontvelő-transzplantáció, az indukciós terápia, az immunterápia, a kombinált kemoterápia stb. Mivel a legtöbb kemoterápiás gyógyszer korlátozott mértékben képes megcélozni és elpusztítani a daganatokat, súlyos károsodást okozhat az emésztőrendszerben, a vérrendszerben, kardiovaszkuláris és agyi érrendszeri stb. A kezelés során gyakran súlyos mellékhatások kísérik, amelyek közül néhány akár halálos is lehet. A kemoterápia előrehaladtával a szervezet hajlamos toleranciát kialakítani a kemoterápiás gyógyszerekkel szemben, ami növeli a betegség kiújulásának kockázatát.
Ezért a rendkívül hatékony, alacsony toxicitású és célzott leukémiaterápia vagy adjuváns terápia keresése a jelenlegi figyelem középpontjába került.Cistanchemongolul Chagangaoyának hívják. A Ledangaceae családba és a Cistanche nemzetségbe tartozik. A sivatagi fák gyökerein élősködik, és a "sivatagi ginzeng" hírében áll.
A Cistanche fő hatóanyagai közé tartoznak a fenil-etanol-glikozidok, lignánok, betainok, szterolok, aminosavak és poliszacharidok. Gyulladáscsökkentő, vírusellenes, antioxidáns, immunszabályozó és egyéb hatások.
A tanulmányok azt találtákCisztanche poliszacharid (CDP),mint az egyik fő aktív összetevője,daganatellenes és immunmoduláló hatása van.A kutatók azt találták, hogy a CDP jelentős ölő hatást fejt ki a leukémia K562 és THP sejtekre-1, és azt javasolták, hogy a CDP bizonyos szerepet játszika leukémia megelőzése vagy kezelése. Ezen túlmenően, a hagyományos kínai orvoslás vegyület, a cistanche, kezelésére akutleukémia, Cistancheegyik fontos összetevőjeként is szerepet játszik. Azonban a konkrét hatásmechanizmusCistanchenem ismert. Ebben a cikkben az izolálás és a tisztításCistanche CDPtanulmányozták, valamint a CDP elpusztító hatását és kapcsolódó mechanizmusát a Jurkat humán akut leukémia sejtvonalon.
1.1 Főbb reagensek és műszerek
A Cistanche port Szecsuánból vásárolták WecistancheGroup Co., Ltd., a Jurkat humán akut leukémia sejtvonalat a Shanghai Institute of Cell Biology sejtbankjától, a tiazolkéket (MTT) és a nátrium-dodecil-szulfátot (SDS) a Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd.-től vásároltuk. a magzati szarvasmarha szérumot (FBS) a Hangzhou Sijiqing Bioengineering Materials Co., Ltd.-től vásároltuk, ciszteintartalmú kaszpáz-3, kaszpáz-9, CD71, CD45, foszforilált c-Jun amino-terminális kináz (p) -JNK) és a foszforilált extracelluláris szignál-szabályozott kináz (p-ERK) antitesteket a Cell Signaling Technology, USA-tól, az aktin antitesteket pedig a Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.-től vásároltuk. Elektrokémiai A lumineszcencia (ECL) szubsztrátot a Thermo cégtől vásároltuk. Scientific Company of the United States és más reagensek hazai analitikai minőségűek voltak. Gel-View 6000 plus intelligens képmunkaállomás (a Guangzhou Boluteng Biotechnology Co., Ltd. terméke), Revolve FL fejjel lefelé fordított fluoreszcens mikroszkóp (az Echo Laboratories, USA terméke), EPOCH mikrolemez-olvasó (a Beijing Bo Teng Instrument Co. terméke, Kft.).
1.2 A CDP szétválasztása és tisztítása Vegyünk 500 g-otCistanche kivonat por, áztassa be 95 százalékos etanolba egy éjszakán át, szűrje le gézzel, gyűjtse össze a szűrőmaradványt, forralja fel 60 fokos forró vízzel 2 órán át, összesen 3 alkalommal. A vége után a szűrleteket háromszor egyesítjük, csökkentett nyomáson az eredeti térfogat 2/3-ára bepároljuk, háromszor 95%-os etanolt adunk hozzá, és egy éjszakán át 4 °C-on állni hagyjuk. Másnap centrifugáljon 4 000 fordulat/perc sebességgel 10 percig, gyűjtse össze a csapadékot, távolítsa el a fehérjét Sevag módszerrel, csapja ki abszolút etanollal, fagyasztva szárítsa meg a CDP előállításához.
1.3 Sejttenyésztés A humán akut leukémia sejtvonalat folyékony nitrogénben tároltuk a Jurkat laboratóriumban. Használatkor a sejteket gyorsan kinyertük 37 fokos vízfürdőben, és RPMI1640 tápközegben (100 U/ml penicillint és 100 U/ml sztreptomicint tartalmazó) tenyésztettük 10% FBS-sel. A sejteket 37 fokos, 5 százalékos CO2 sejtinkubátorban tenyésztettük, 2-3 naponként passzáltuk, és a kísérleteket akkor végeztük, amikor a sejtek beléptek a logaritmikus növekedési fázisba.
1.4 MTT kísérlet A logaritmikus növekedési fázisban lévő Jurkat sejteket kivettük, centrifugáltuk, hogy sejtpelletet kapjunk, és 5×105 sejt/ml-nél megszámláljuk. Vegyünk egy 96-lyukú sejttenyésztő lemezt, oltsunk be 100 ul sejtet mindegyik lyukba, majd adjunk hozzá 100 ul RP-MI1640 komplett táptalajt kontrollcsoportként; a kísérleti csoportot 3 csoportra osztottuk, először RPMI1640 táptalajt használva különböző koncentrációjú CDP előállítására, majd 100 ul RP-MI1640 táptalajt adtunk minden egyes lyukba. ul Jurkat sejteket és 100 ul CDP-oldatot használtunk a CDP 1, 2 és 5 mg/ml végső koncentrációjának meghatározásához. Mindegyik csoportot 5 párhuzamos lyukkal állítottuk fel, és 37 fokos sejtinkubátorban 48 órán át inkubáltuk. Az inkubálás után adjunk minden lyukba 20 ul MTT-t (a törzsoldat koncentrációja 5 mg/ml), tegyük vissza a sejtinkubátorba, és folytassuk az inkubálást 4 órán keresztül, végül adjunk hozzá 100 ul 20 százalékos oldatot. SDS a formazán feloldásához 37 fokon egy éjszakán át, és másnap használja fel. Az egyes csoportok 570 nm-en mért abszorbanciáját mikrolemez-leolvasóval detektáltuk, és képlettel számítottuk ki a különböző koncentrációjú CDP Jurkat sejtproliferáció gátlásának mértékét.
1.5 Western-blot A logaritmikus növekedési fázisban lévő Jurkat sejteket vettük, és egy 6-lyukú lemezre oltottuk 2 × 105 sejt/ml sűrűséggel, 500 ul/lyuk, és 500 ul RPMI1640 komplett táptalajt adtunk a kontrollhoz. csoport. Állítson fel 3 kísérleti csoportot, 1, 2 és 5 mg/ml poliszacharid kezelési csoportot, CDP
Az RPMI1640 komplett tápközegben előzetesen feloldva 500 ul sejtet és 500 ul különböző koncentrációjú CDP-oldatot adtunk a 6-lyuklemezre, és 37 fokon 48 órán át inkubáltuk. A tenyésztés után az egyes csoportok sejtszuszpenzióit összegyűjtöttük, centrifugáltuk 1 500 fordulat/perc sebességgel 5 percig, hogy sejtpelleteket kapjunk, és kétszer mossuk előhűtött foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS). Mosás után 20 ul sejtlízis puffert adtunk mindegyik csoporthoz, és a sejteket jégen lizáltuk 30 percig. A teljes fehérjét extraháltuk, és a sejtkoncentrációt Bradford módszerével állítottuk be. Mindegyik csoportból 20 ug fehérjét vettünk SDS-poliakrilamid gélelektroforézishez (PAGE), és a fehérjét elektroporációval polivinilidén-fluorid (PVDF) membránra vittük át. Zsírmentes tejporral blokkolva szobahőmérsékleten 1 órán át, hozzáadva nyúl anti-humán kaszpáz-3 és kaszpáz-9 antitesteket 1:1 000 hígítási arányban, szobahőmérsékleten 1 órán át inkubálva. h, foszfát Tween puffer (PBST) rázógéppel háromszor öblítjük (10 perc/idő), adjunk hozzá torma-peroxidázzal (HRP) jelölt másodlagos antitestet (1:1 000), inkubáljuk 1 órán át szobahőmérsékleten, öblítsük le 3-szor PBST-vel, 1-szer öblítés PBS-sel, ECL szubsztrát hozzáadása és használat A képalkotáshoz intelligens képmunkaállomást használtunk, és az egyes csoportok sávváltozásait összehasonlítottuk a Jurkat sejtek CDP által indukált apoptózisának vizsgálatára. Az apoptózis úthoz kapcsolódó fehérjék kimutatásához a sejttenyésztés és a CDP kezelés feltételei megegyeztek a fentiekkel. A reakció után a sejteket lizáltuk a fehérje mennyiségi meghatározásához. A fehérjét SDS-PAGE-val és elektroporációval PVDF membránra vittük át. A sovány tejporral való 1 órás blokkolást követően anti-CD71, CD45, p-JNK és p-ERK antitesteket (1:1 000) adtunk hozzá, és szobahőmérsékleten 1 órán át inkubáltuk. A HRP-vel jelölt másodlagos antitestet (1:1 000) 1 órán át inkubáltuk, majd az intelligens képalkotó munkaállomást a CDP-indukált Jurkat-sejt apoptózishoz kapcsolódó jelátviteli molekulák tanulmányozására használtuk a képalkotáshoz. Az eredményül kapott kísérleti sávokat az Image J (1.8.0) segítségével szürkeárnyalatosra állítottuk.
1.6 Statisztikai elemzés Az SPSS21.{3}} szoftvert használtuk a t-teszthez és a varianciaanalízishez
A Cistanche funkció 2 eredménye bekapcsolvaleukémia
2.1 Sejtburjánzási szint
A CDP-t sikeresen izolálták, több mint 9{{20}} százalékos cukortartalommal és kevesebb mint 5 százalékos fehérjetartalommal. A sejtproliferáció gátlási aránya az 1 mg/ml-es CDP-csoportban (19,1±2,1) százalék volt, míg a 2 mg/ml-es és 5 mg/ml-es CDP-csoportban (44,2±5,2) ) ) százalék és (47,8 ± 4,4) százalék, ami azt jelzi, hogy a CDP dózisfüggő módon jelentősen gátolja a Jurkat-sejtek proliferációját. 2.2 Összehasonlítva a kontrollcsoporttal (0,62±0.04, 0,56±{{40}}).{49 }}7), az 5 mg/ml CDP-vel kezelt Jurkat sejtekben az apoptózis mértéke a kaszpáz-9 és a kaszpáz{{30}} enzimeket eredményezte. Pro-form pro-kaszpáz-9 ( 0. 09 ± 0. 02) és pro-kaszpáz-3 ( {{ 63}}. 12 ± 0. 01) szignifikánsan csökkentek, és az 1 mg/ml és 2 mg/ml CDP csoportok szignifikánsan kevésbé voltak hatékonyak a prokaszpáz-3 tekintetében a sejtekben. A kaszpáz-9 (0,58±0,04, 0,51±0,01) és a pro-kaszpáz-3-tartalom (0,48±0,04, 0,44±0,05) nem mutatott szignifikáns hatást, azaz alacsony A CDP koncentrációja nem indukált Jurkat sejtek apoptózisát, de főként a sejtproliferációt gátolta, amint azt az 1. ábra mutatja.
1-4: referenciacsoport,
1 mg/ml CDP csoport, 2 mg/ml CDP csoport, 5 mg/ml CDP csoport; ugyanaz, mint az alábbi ábrán
1. ábra A CDP hatása a kaszpázra-9 és a kaszpázra-3 Jurkat sejtekben
A Cistanche poliszacharidok hatása Leukémiára gyakorolt hatás
2.3 A CD71 és CD45 relatív expressziós szintje az apoptózis receptor kontroll csoportban 1.00±0.04, {{10}},54±54± 0.{{20}}2. Az 5 mg/ml CDP csoport szignifikánsan gátolhatja a CD71-et (0.05±0.02). 01) és CD45 (0. 13 ± {{40}}. 03); Az 1 mg/ml és 2 mg/ml CDP csoportok bizonyos mértékig gátolhatták a CD71 expresszióját (0,52 ± 0,06, 0,43 ± 0,07) A CD45 expressziójára nem volt szignifikáns hatás (0,51). ±0,01, 0,48±0,02). Lásd a 2. ábrát.
2. ábra A CDP hatása a sejtmembrán felszínén lévő receptorok expressziójára
2.4 Apoptózissal kapcsolatos utak
A p-JNK és p-ERK relatív expressziós szintje a referenciacsoportban 1,20±0.08 és 0,21±0 .03, ill. Az 5 mg/ml CDP csoport apoptózist indukált és szignifikánsan csökkentette a JNK foszforilációs szintjét. (0. 32 ± 0. 04) szignifikánsan megnövelte az ERK foszforilációs szintjét (1,13 ± 0. 05); 1 mg/ml, 2 mg/ml CDP növelte a JNK foszforilációs szintjét (1.12 ± 0. 06 , 1.06 ± 0.06) nem volt szignifikáns hatása, de így is növelte az ERK foszforilációs szintjét (0, 54 ± 0, 04, 0, 63 ± 0, 02). Lásd a 3. ábrát.
3. ábra A CDP hatása a JNK és az ERK foszforilációjára
3 Vita
Az elmúlt években végzett vizsgálatok azt találták, hogy a CDP bizonyos gátló hatással bír a leukémia sejtvonalakra, de a konkrét hatásmechanizmus még nem ismert.
Az apoptózis folyamatában a kaszpáz-9 a kaszpázfüggő apoptózis folyamat egyik upstream jelzőmolekulája. A jelstimulációt követően a pro-kaszpáz-9 nagymértékben hidrolizálódik, és a hasított kaszpáz-9 aktivált formája keletkezik, amely továbbra is apoptotikus jeleket továbbít lefelé, hogy elősegítse az apoptózis folyamatát. A kaszpáz-3 egy effektor típusú kaszpázmolekula, és kulcsfontosságú jelzőmolekula a celluláris kaszpázfüggő apoptózis folyamatában. Normál körülmények között proenzim (pro-kaszpáz-3) formájában is létezik. Ha hidrolízissel aktiválják, nagy mennyiségű hasított kaszpáz keletkezik. -3, számos kulcsfontosságú fehérjemolekulát lizál a sejtekben, és végül apoptózist indukál. A CDP a biológiai makromolekulák aktív poliszacharidjai közé tartozik, és a sejtmembránon keresztül nem tud szabadon bejutni a sejtekbe. Ezért a CDP apoptózist indukál azáltal, hogy befolyásolja a receptorok expresszióját és eloszlását a Jurkat sejtmembránok felszínén, ezáltal jeleket továbbít a sejtek belsejébe, és végül aktiválja a kaszpázcsaládot. fehérje, ami sejt apoptózishoz vezet. Ez a tanulmány azt mutatja, hogy a CDP alacsony koncentrációja nem indukálja a Jurkat sejtek apoptózisát, de főként a sejtproliferációt gátolja. A CD71, más néven transzferrin receptor, egy II-es típusú transzmembrán glikoprotein receptor, amely részt vesz a vas felszívódásában, valamint a sejtek növekedésének és fejlődésének szabályozásában. A CD71 erősen expresszálódik akut leukémiában szenvedő betegekben, és elsődleges gyógyszerrezisztenciával, azaz a CD71 expressziójával társul. Minél magasabb az érték, annál rosszabb az első kemoterápia hatása. Ezért a CD71 a kiegészítő diagnózis egyik markere. A CD45 a leukociták minden típusának felszínén expresszálódik, más néven leukocita közös antigén. Az I. típusú transzmembrán glikoproteinhez tartozik, és szorosan összefügg a T-sejtek fejlődésével és differenciálódásával. A CD45-nek különböző expressziós szintje és alloszterikus típusa van a leukémia különböző típusaiban, így a leukémia differenciáldiagnózisának és immunfenotipizálásának egyik markereként használható. A CD45 monoklonális antitestet széles körben alkalmazzák a leukémia, különösen a gyógyszerrezisztens leukémia kezelésében. Friesen et al. megállapította, hogy radionuklidok
A megjelölt CD45 mAb apoptózist indukálhat gyógyszerrezisztens leukémia sejtvonalakban a kaszpázcsalád fehérjéinek aktiválásával (beleértve a kaszpázt-3, kaszpázt-8 és kaszpázt-9). A CDP a Jurkat sejtek apoptózisát indukálja, először is a sejtmembrán felszíni CD45 és CD71 receptoraira hatva, befolyásolja a kettő expresszióját és eloszlását, apoptózis jeleket továbbít a sejtekbe, végül aktiválja a kaszpázt-9 és a kaszpázt{{8 }}, apoptózist vált ki. Mindazonáltal mind a kaszpáz-9, mind a kaszpáz-3 az apoptotikus útvonal lefelé található, és az upstream jelátviteli molekulákat tovább kell vizsgálni. Ebben a vizsgálatban a CDP 5 mg/ml koncentrációban a Jurkat sejtek apoptózisát indukálta, miközben gátolta a CD45 expresszióját, ami hasonló volt a fent leírt CD45 monoklonális antitestéhez. Ezért az apoptózissal összefüggő CD45 és CD71 receptorok szempontjából,Cistanchebizonyos potenciállal rendelkezik a leukémia kezelésére vagy adjuváns kezelésére.A mitogén aktivált protein kináz rendszerek (MAPK-k) minden eukarióta sejtben expresszálódnak.
Cistanche tabletták a leukémia kezelésének immunrendszerének javítására
Ez egy nagyon fontos információátviteli útvonal, amely az extracelluláris stimulációs jelátvitelt végzi az intracelluláris felé, és szerin/treonin protein kinázokból áll, beleértve az ERK-t, a JNK-t és a p38MAPK-t. Foszforilációja és defoszforilációja a sejtek élettevékenységének kapcsolói, és részt vesznek a sejtnövekedés, proliferáció, differenciálódás, aktiváció és apoptózis folyamatában. Ez a tanulmány arra utal, hogy a JNK defoszforilációja részt vesz a CDP által kiváltott T-sejt apoptózisban, míg az ERK foszforiláció részt vesz a két folyamatban, mivel a CDP gátolja a sejtproliferációt és indukálja az apoptózist.
Összefoglalva,Cistanche CDPcitotoxikus hatást fejt ki a Jurkat T-limfocita leukémia sejtvonalra, ami azt mutatja, hogy alacsony koncentrációk (2 mg/ml alatt) gátolják a sejtproliferációt, míg magas koncentrációk (5 mg/ml) apoptózist indukálnak.Cistanche CDPapoptózist indukál Jurkat sejtekben, főleg a sejtek befolyásolásával és megváltoztatásával.
Az apoptózissal összefüggő CD71 és CD45 receptorok expressziója a membrán felszínén jeleket továbbít a sejtek belsejébe, ami tovább idézi elő az ERK foszforilációját és a JNK defoszforilációját, végül pedig a kaszpáz aktiválását-9, ami viszont aktiválja a kaszpázt{{4} } apoptózis kiváltására.
