A kromatin hozzáférhetősége és a mikroRNS expressziója a nephron progenitor sejtekben a vese fejlődése során

További információ:ali.ma@wecistanche.com

Andrew Clugston^1,2,3, Andrew Bodnar^2,3, Débora Malta Cerqueira^2,3, Yu Leng Phua^2,5,6,Alyssa Lawler^8,9,10, Kristy Boggs⁷, Andreas Pfenning^8,10,Jacqueline Ho^2,3*és Dennis Kostka^1,4*

¹Fejlődésbiológiai osztály, Pittsburgh Egyetem Orvostudományi Kar, Pittsburgh, PA, USA²Rangos Research Center, UPMC Children's Hospital of Pittsburgh, Pittsburgh, PA, USA³Gyermekgyógyászati ​​Osztály, Nefrológiai Osztály, Pittsburgh Egyetem Orvostudományi Kar, PA, USA⁴Számítástechnikai és Rendszerbiológiai Tanszék és Pittsburgh Evolúciós Biológiai és Orvostudományi Központ, Pittsburgh Egyetem Orvostudományi Kar, Pittsburgh, PA, USA⁵Genetikai és Genomikus Orvostudományi Osztály, Gyermekgyógyászati ​​Osztály, UPMC Children's Hospital of Pittsburgh, Pittsburgh, PA, USA⁶Patológiai osztály, Clinical Biochemical Genetics Laboratory, UPMC Children's Hospital of Pittsburgh, Pittsburgh, PA, USA⁷Gyermekgyógyászati ​​Osztály, Gasztroenterológiai, Hepatológiai és Táplálkozási Osztály, Pittsburgh Egyetem Orvostudományi Kara, Pittsburgh, PA, USA.⁸Számítási biológia,⁹Biológiai tudományok, és¹⁰Neuroscience Institute, Carnegie Mellon Egyetem, Pittsburgh, PA, USA

Absztrakt

Az emlős nefronok populációjából származnaknephron progenitor sejtek, és e sejtek transzkriptómáiban bekövetkező változások hozzájárulnak a nefrogenezis leállásához, amely a nefronszám fontos meghatározója. A mikroRNS (miRNS) expresszió jellemzésére és a feltételezett cisz-szabályozó régiók azonosítására egérből nephron progenitor sejteket gyűjtöttünkveseaz embrionális 14.5. napon és a születés utáni nulladik napon, és kismértékű RNS expressziót és transzpozázhoz hozzáférhető kromatint vizsgáltunk. 1104 miRNS expresszióját (114 expressziós változással), és 46 374 kromatinhoz hozzáférhető régiót (2103 megváltozott hozzáférhetetlenséggel) detektáltunk. A genomra kiterjedően adataink olyan folyamatokat emelnek ki, mint a sejtdifferenciálódás, a sejtmigráció, az extracelluláris mátrix kölcsönhatások és a fejlődési jelátviteli útvonalak. Ezenkívül új jelölt cisz-szabályozó elemeket azonosítanak az Eya1 és Pax8 számára, amelyek mindkét gén szerepet játszanak a nephron progenitor sejtek differenciálódásában. Végül kifejezésmódosító miRNS-eket társítunk, beleértve a let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p és miR{{ 20}}p, jelölt cisz-szabályozó elemekkel és célgénekkel. Ezek az elemzések új feltételezett cisz-szabályozó lókuszokat emelnek ki a miRNS számára a nephron progenitorokban.

Bevezetés

A funkcionális egység avesea nefron, amely a hulladék szűrésére és a víz, sav-bázis és elektrolitok normál homeosztázisának fenntartására szolgál a szervezetben. A nefronok száma az emberekben nagyon változó (jellemzően kétszázezer és több mint egymillió nefron között van (Hughson és mtsai, 2003)), és az emberben a születés előtt alakul ki (egereknél körülbelül a születés utáni napon 2-3) (Hartman et al. ., 2007; Hinchliffe et al., 1991)). A nefronok nem tudnak regenerálódni születés után, és a csökkent nephron-ellátottság a krónikus vesebetegség és a magas vérnyomás fokozott kockázatával jár (Bertram és mtsai, 2011). A nefronok számát viszont nagyrészt az úgynevezett sejtpopuláció határozza megnephron progenitor sejtek(Cebrian et al., 2014b). Az utóbbi szakaszokbanveseFejlődése során a nephron progenitorok növelik differenciálódási hajlamukat, ami fokozatosan kimeríti populációjukat, és a nefrogenezis végső leállását jelzi (Hartman et al., 2007; Rumballe et al., 2011; Volovelsky et al., 2018). A nefrogenezis leállását szabályozó mechanizmusok megértése jelentős hatással van a nefron-ellátottság és a későbbi vesebetegség kockázatának meghatározására.

Alattvesefejlődés, önmegújuló Cited1 plus /Six2 plus nephron progenitorok előidézett Cited1-/Six2 plus progenitorokká válnak, és ezt követően Wnt{5}}expresszáló vesevezikulákká differenciálódnak a Wnt9b/ -catenin hatására (McMahon). et al., 2016; Rumballe et al., 2011). A korai és késői nephron progenitorok belső transzkripciós változásai közé tartoznak az őssejtek öregedését befolyásoló gének és útvonalak, különösen az mTor és annak represszora hamartin (S. Chen és mtsai, 2015; Volovelsky és mtsai, 2018). Valójában úgy gondolják, hogy a hamartin deszenzitizálja a nephron progenitorokat az önmegújulás jeleire, és ily módon hozzájárul a nefrogenezis leállításához (S. Chen és mtsai, 2015). Azzal az elképzeléssel összhangban, hogy a korai nephron progenitorok hajlamosabbak az önmegújulásra, az a megfigyelés, hogy a kromatin hozzáférhetősége gazdagodik a mag nefron progenitor sejt transzkripciós faktorainak kötőhelyein, beleértve a Six2-t és a Wt1-et, összehasonlítva a késői nefron progenitorokkal (Hilliard et al. , 2019). Kimutatták, hogy ezek a transzkripciós faktorok megkötik a genom "szabályozási forró pontjain" elhelyezkedő enhanszer szekvenciákat (O'Brien et al., 2018). A nephron progenitorok indukciója az emelkedő -catenin szintnek köszönhető, ami a Lef1/Tcf7 komplexek aktiválódását eredményezi a nefrogenezis program aktiválására kész génekben (Park et al., 2012), és azt javasolták, hogy komplexet képezzenek Tcf7l1-gyel és Tcf7l2-vel. szabályozó kromatin hurkok létrehozására és fenntartására, amelyek elősegítik a génaktiválást (Guo et al., 2021).

Kattintson ideCistanche tubulosa por vesebetegségek kezelésére

A közelmúltban végzett tanulmányok a mikroRNS-eket (miRNS) a nefrogenezis megszűnésének szabályozásában érintették. A miRNS rövid, nem kódoló RNS-molekulák, amelyek a hírvivő-RNS transzkriptumokat (mRNS) veszik célba, hogy csökkentsék a transzlációt vagy fokozzák a degradációt az RNS-indukált csendesítő komplexen (RISC) keresztül (Bartel, 2009). A Lin28b fehérje a miRNS-ek let{5}családjának ismert represszora (Heo et al., 2008). A Lin28b expressziója csökken a nephron progenitorokban a nefrogenezis előrehaladtával, és ez egybeesik a let-7 miRNS-család expressziójának növekedésével (Yermalovich et al., 2019). Ezenkívül a Lin28b expressziójának feltételes indukciója a Wt1-vonalban a let-7 miRNS elnyomását eredményezi, ami elegendő a nefrogenezis meghosszabbításához (Yermalovich et al., 2019). Nem ismert, hogy más miRNS-ek szabályozzák-e a nefrogenezis időzítését. Ezen túlmenően, bár azonosítottak olyan enhanszereket, amelyek szabályozzák a hosszú, nem kódoló RNS-expressziót a nefrogenezis során (Nishikawa et al., 2019), egyikről sem sikerült kimutatni, hogy szabályozza a miRNS-expressziót a nephron progenitorokban.

Ebben a tanulmányban arra törekedtünk, hogy egyidejűleg azonosítsuk az új miRNS-t, amely hozzájárul a nefrogenezis leállításához, valamint a lehetséges cisz-szabályozó jellemzőket. Ezért, hogy megfigyelhessük a miRNS expressziójában és a kromatin hozzáférhetőségében bekövetkező változásokat az embrionális 14.5. nap (E14.5) és a születés utáni nulladik nap (P0) között, egyező mRNS-seq és ATAC-seq adatkészleteket állítottunk elő elsődleges és nem passzált adatokból.nephron progenitor sejtekezen a két időpontban. 114 miRNS-t azonosítottunk, amelyek eltérően expresszálódnaknephron progenitor sejteke két időpont között, valamint 2103 változó kromatin-elérhetőségi régiót, amelyeket differenciálisan hozzáférhető régióknak (DAR) nevezünk. A szignifikánsan változó miRNS előrejelzett géncélpontjainak dúsítási analízise, ​​valamint a DAR-ok genomiális elhelyezkedése olyan útvonalakat von maga után, amelyek befolyásolják a hámsejtek differenciálódását, a sejtmigrációt, az extracelluláris mátrix kölcsönhatásokat és a kulcsfontosságú fejlődési jelátviteli útvonalakat, mint például a Wnt, Notch és TGF-jelátvitel. . Jelentős változásokat figyeltünk meg a kromatin hozzáférhetőségében, és számos bizonyítékot mutatunk be, amelyek két genomiális régiót feltételeznek az Eya1 és Pax8 gének feltételezett fokozójaként a nephron progenitor sejtekben. Végül konzisztens kromatin hozzáférhetőségi és miRNS-expressziós változásokat azonosítottunk 33 pár miRNS és DAR esetében, beleértve a let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a{ {11}}p és miR-9-3p, és feltételezett célgéneket mutatnak be, amelyek nephron progenitorokban expresszálódnak a differenciálisan expresszált miRNS-ekhez.

Eredmények

Nephron progenitor sejtpopulációk izolálása E14.5-ből és P0vese

Nephron progenitor sejtekItg 8-ra pozitív szelekcióval izoláltuk E14.5-nél vagy P0-nál, és minden mintát felosztottunk az mRNS-seq, ATAC-seq és minőség-ellenőrzés végrehajtására (1. AB kiegészítő ábra). A kvantitatív PCR (qRT-PCR) megerősítette, hogy a Six2 és Cited1 nephron progenitor marker gének (Huang és mtsai, 2016) az egészhez képest erősen expresszálódnak izolált nefron progenitor mintákbanvese, sokkal inkább, mint más sejttípusok markerei (beleértve az ureterbimbót (Caleb) (Cebrian és mtsai, 2{{10}}14a), az endoteliális sejteket (Pecan) (Kobayashi és mtsai, 2008), vese stroma (Pdgfr ) (S. Chen et al., 2015) és vesevezikula (Lhx1) (Brunskill és mtsai, 2014) (kiegészítő 1. C ábra). Az ivar tekintetében az E14.5 mintákhoz használt alom 27-50 százalék nőstény, és a P0 minták almainak száma 31 százalék és 75 százalék között mozgott. Az E14.5 minták átlagosan 38 százaléka nőstény, és a P0 minták 49 százaléka nőstény (kiegészítő 1D ábra). -páros nephron progenitor sejtpopulációi lehetővé tették számunkra az elemzésta kromatin hozzáférhetőségeés kismértékű RNS-expresszió a fejlődés azonos szakaszaiban két időpontban (E14.5 és P0).

A korai és késői nephron progenitorok eltérő miRNS transzkripciós profillal rendelkeznek

A kis-RNS szekvenálás 1,104 ismert miRNS-transzkriptumot és 114 miRNS-t azonosított, amelyek jelentős változást mutattak az expresszióban az E14.5 és a P{{10}} minták között (hamis felfedezési arány FDR)=0.05; 1. kiegészítő táblázat). A differenciálisan expresszált miRNS-ek fele fokozott expressziót mutat P0-nál az E14.5-höz képest, és a főkomponens-analízis rávilágít az E14.5-ös minták miRNS-expressziójának nagyobb homogenitására, mint a P0-re (1A. ábra). A hierarchikus klaszterezés a miRNS-ek egyértelmű csoportosítását mutatja az E14.5 és P0 között növekvő, illetve csökkenő expressziójú miRNS-ekbe (1B. ábra). A miRNS-ek let-7családjának tagjai a leginkább kimutatott miRNS-ek közé tartoznak, és megjegyezzük, hogy minden jelentős változást mutató családtag fokozott expressziót mutat P0-nál (az adatokat nem mutatjuk be). Ez összhangban van azokkal az eredményekkel, amelyek azt mutatják, hogy a Lin28b expressziójának csökkenése a let-7 család expressziójának jelentős növekedéséhez vezet a nefrogenezis során (Yermalovich et al., 2019). A P0-nál szignifikánsan magasabb expressziójú miRNS-ek közé tartozik a miR-429-3p, a miR-200 család egyik tagja, amelyről ismert, hogy befolyásolja a podocita differenciálódását (Z. Li et al., 2016), és mindkettő a miR{{30} }}a-5p és miR-125b-5p. Ezek közül az utóbbi kettőről ismert, hogy különböző sejtkörnyezetekben elnyomja a Lin28 transzkriptumokat (Chaudhuri et al., 2012; Potenza és mtsai, 2017). A P0-nál szignifikánsan alacsonyabb expressziójú miRNS magában foglalja az angiogenezist (S. Wang és mtsai, 2008) és a proliferációt elősegítő (Schober et al., 2014) miR-126.

A DIANA miRPath eszköz lehetővé teszi a miRNS KEGG-útvonal-elemzését a megfelelő géncélpontjaik alapján, a mikro-T-CDS előrejelzése szerint (Vlachos et al., 2015). Azt találtuk, hogy az E14.5 és P0 között (felfelé vagy lefelé) a legnagyobb expressziós változást mutató miRNS-ek azok, amelyek a nefrogenezisben kulcsszerepet játszó útvonalakat szabályozzák (1C. ábra, 2. kiegészítő ábra). Például a Tgf-t a környező stromasejtek választják ki, hogy elősegítsék a nephron progenitor differenciálódását (Rowan et al., 2{{50}}18), és azt tapasztaljuk, hogy a nephron progenitor miRNS-e csökkent expressziót céloz meg, amely a nephron progenitor effektorait célozza meg. a "TGF-jelátviteli útvonal" (KEGG útvonal mmu04350, p-érték 1,45e- 6). A „MAPK jelátviteli útvonal” (mmu04010) befolyásolja a nefron progenitorok szerveződését és aktiválását a differenciálódás érdekében, és szabályozza interakcióikat az extracelluláris mátrixszal (ECM) az Itg 8-on keresztül (Ihermann-Hella et al., 2018). Jelentős számú felfelé és lefelé szabályozott miRNS-t figyeltünk meg, amelyek különböző géneket céloznak meg ebben a MAPK jelátviteli útvonalban (p-értékek 3,5e- 6 és 3,0e- 4 a felfelé és lefelé mutató listáknál). . Végül, a KEGG útvonal "Extracelluláris mátrix (ECM) receptor interakció" (mmu04512) a legjelentősebben dúsított útvonal, amelyet azonosítottak, és az azt alkotó géneket sokkal jelentősebben célozza meg a miRNS, amelynek expressziója idővel növekszik (p-értéke 7,4e{ {32}} a növekvő miRNS között, szemben az 1,1e-vel-2 a csökkenőkkel). Az ECM-hez kapcsolódó gének célpontjai az általunk észlelt, leginkább kifejezett és jelentősen növekvő miRNS, ideértve a miR-196a-5p, miR-148a-3p, miR -125a-5p, és legyen-7f-5p. Pontosabban, a miR-196a-5p a legmagasabb expresszált miRNS a mintáinkban, és 8-szeres növekedést mutat E14.5 és P0 között. Azok a géntranszkriptumok, amelyek a miRNS megjósolt célpontjai voltak (TargetScan használatával (Agarwal és mtsai, 2015)), amelyek P0-nál fokozott expressziót mutattak, többek között a Bach2, amely egy javasolt molekuláris kapcsolat a MAPK/AP1 és a Six2/-catenin útvonalak között az önmegújulás és a differenciálódás érdekében. a nephron progenitorokban, illetve (Hilliard et al., 2019).

A differenciálisan expresszált miRNS-ek feltételezett célpontjainak azonosítására nephron progenitorokban a miRNS-ek számítási annotációját használtuk a miRDB-ben (Y. Chen & Wang, 2020), valamint a habarcsbázisból származó, annotált kísérleti miRNS-mRNS kölcsönhatásokat (HY). Huang és mtsai, 2020), a korábban generált E14.5 egysejtű RNS szekvenálási adatkészletünkkel kombinálva (Bais et al., 2020). Így elkészítettük a lehetséges miRNS-mRNS kölcsönhatások listáját a miR E14.5 és P0 közötti differenciált expressziója alapján nephron progenitorokban, a célgén expressziójának megfelelő változásával az önmegújuló és a primed nephron progenitorok között, valamint a primed és differenciáló nephron progenitorok (2. ábra). Elemzésünk azt sugallja, hogy a Meis2 és a Hmga2 potenciális célpontjai a let-7 miRNS-családnak a nephron progenitorokban (2. ábra), a Meis2 és Hmga2 csökkent expressziója pedig a let-7 családtagok fokozott expressziójához kapcsolódik. differenciálódó vagy öregedő nephron progenitorokban. A Meis2 transzkripciós faktor erősen expresszálódik a nephron progenitorokban és a vese stromábanvesefejlődés (Lam és mtsai, 2014), és a sejtproliferáció más összefüggésben történő szabályozásához kapcsolódik (Abruzzese et al., 2019). A Hmga2 egy nem hiszton kromatinkötő fehérje, nagymértékben expresszálódik az őssejtekben, és számos mesenchymális daganattal hozták kapcsolatba (Fusco és Fedele, 2007; Lam és mtsai, 2014). Hasonlóképpen, a Jag1 kifejeződés növekedése a miR-34b-5p, miR-983p és miR-200a-3p csökkenő kifejeződésével társul a megkülönböztetésben. vagy öregedő nephron progenitorok (2. ábra). A Jag1 a Notch jelátvitel kulcsligandja, amelynek expressziója a nephron progenitorok differenciálódásával növekszik (Chung et al., 2016). Az önmegújuló, primer és differenciáló nefron progenitorok közötti expressziós változást mutató gének összes megjósolt vagy annotált miRNS-célpontja elérhető a Supplemental-ban.

1. ábra: Jelentős változások a miRNS expressziójában az E14.5 és a P0 nephron progenitorok között.A) A főkomponens-analízis azt mutatja, hogy a fejlődési időpont a miRNS expressziós variációinak fő tényezője. B) Az összes jelentősen változó miRNS relatív expresszióját ábrázoló hőtérkép. A bal oldali E14.5 mintákat tartalmazó oszlopok világoszölddel, a jobb oldali P0 mintákat tartalmazó oszlopok pedig sötétzölddel vannak jelölve. C) A specifikus KEGG útvonalakból származó gének feldúsulása a felfelé és lefelé szabályozott miRNS előre jelzett géncélpontjai között (piros és kék sávok). A minimális p-érték 1e-5.

2. ábra: miRNS-mRNS kölcsönhatások, amelyek lehetséges szerepet játszhatnak a nephron progenitor sejtek öregedésében és differenciálódásában. MiRNS (körök) és mRNS (négyzetek) látható. Az E14.5 és P0 között megnövekedett expressziójú miRNS-ek pirossal, a csökkenő miRNS-ek kékkel láthatók. Annotált célgének (mirDB-ből és mir TarBase-ből) növekvő expresszióval az önmegújuló, az alapozó vagy a differenciálódás közöttnephron progenitor sejtek(Bais et al., 2020) piros színnel, az mRNS csökkenő expresszióval kék színnel látható. A mirDB és mirTarDB élei, amelyek nincsenek összhangban a megfigyelt kifejezési változásokkal, kimaradtak, de szerepelnek a 2. kiegészítő táblázatban.

A korai és késői nefron progenitorok eltérő kromatin környezettel rendelkeznek

Az E14.5 és P0 nephron progenitorokból származó ATAC-seq adatok lehetővé tették számunkra, hogy azonosítsuk a hozzáférhető kromatin 46 374 régióját (amely nem csökkenthető felfedezési arány (Boleu et al., 2015) küszöbértéke {{ 22}}.1, lásd (Kiegészítő ábra 3 C, Kiegészítő táblázat 3), minták és időpontok között kombinálva Megjegyezzük, hogy adataink megfelelnek az ENCODE projekt ATAC-seq irányelveinek (ENCODE, nd) (Kiegészítő ábra 3 A, B) és hogy az IDR-csúcsok között megnövekedett konzerválási arányt figyeltünk meg, mint a randomizált kontrollokban (3D kiegészítő ábra). Az általunk közölt IDR-ek közül 3576 tartalmaz a VISTA-ban dokumentált fokozókat (Visel et al., 2007) és/vagy A FANTOM5 (de Rie és mtsai, 2017) enhancer adatbázisok és 13 495 olyan DNS-szekvenciát tartalmaznak, amelyek előre jelzett szabályozó szereppel rendelkeznek legalább egy egérszövetben vagy sejttípusban az EnhancerAtlas 2.0 (Gao és Qian, 2020) szerint.

A főkomponens-analízis (a minták közötti nemi különbségekhez igazítva) a minták egyértelmű csoportosítását mutatta ki fejlődési időpontok szerint (3A. ábra). A kromatin hozzáférhetőség változásával járó genomiális lókuszok azonosításához összehasonlítottuk az ATAC-seq jelet az E14.5 és a P0 minták között. 2,103 DAR-t figyeltünk meg, amelyek az FDR-t 10 százalékon szabályozták. Ezek közül 1323 (55 százalék) nagyobb hozzáférhetőséget mutatott a P0-nál az E14.5-höz képest, és a hierarchikus klaszterezés egyértelmű különbséget mutatott az E14.5 és a P0 között nyíló és záródó DAR-ok között (3B. ábra).

A transzkripciós faktor lábnyomait a HINT segítségével azonosítottuk, és a HOCOMOCO 11 adatbázisból származó motívumok segítségével illesztették a DNS-kötő fehérjékhez (Kulakovskiy et al., 2018). A 431 tesztelt motívum közül a DAR-ok, amelyek számos, a nefrogenezishez kapcsolódó transzkripciós faktor fehérje lábnyomát tartalmazzák, az E14.5 és a P{7}} közötti hozzáférhetőség növekedését mutatják. Az átlagosan hozzáférhetőséget növelő DAR-okban található lábnyomok közül az első hat a Pax8-nak ({{10}.15), Six2-nek (0.14), Cebpd-nek megfelelő transzkripciós faktor lábnyomok közé tartozik. (0.13), Six4 (0.13), Jun (0.12) és Fos (0.11). A záró DAR-okban annotált lábnyomok közé tartoznak az E2F2 és E2F4 transzkripciós faktorok, amelyekről ismert, hogy befolyásolják a sejtciklus progresszióját (Gaudet és mtsai, 2011), és elősegítik a sejtproliferációt (D. Wang és mtsai, 2000) más sejtes összefüggésekben (kiegészítő ábra). 4).

A DAR-ok nyitásának és bezárásának biológiai kontextusának értékeléséhez a Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool (GREAT) eszközt (McLean et al., 2010) használtuk, hogy kiemeljük a kapcsolódó változó kromatin régiók dúsításával rendelkező génkészleteket. Ezzel a megközelítéssel azonosítjuk a génontológia (GO) biológiai folyamatait, amelyek szorosan kötődnek a nephron progenitor fejlődéséhez: különösen a nyitó DAR-ok közül a legdúsabb folyamat a "hámsejtek differenciálódásának szabályozása" (GO:0030856, Binomiális Q-érték {{3). }}.5e-5), és "Az epiteliális sejt differenciálódás pozitív szabályozása" (GO:0030858, binomiális Q-érték=5e-3) a 10 legjelentősebben gazdagodott ( Kiegészítő 5. ábra). Mindkettő összhangban van a nephron progenitorok azon hajlamának növekedésével, hogy differenciálódásuk során mezenchimális-epiteliális átmeneteken (MET) menjenek keresztül (S. Chen et al., 2015). További jelentősen gazdagodott útvonalak közé tartozik a "Notch Signaling útvonal pozitív szabályozása" (GO:0045747, binomiális Q-érték=2e-5), amely összhangban van a Notch-jelátvitel szerepével a nephron progenitorok differenciálódásában ( Chung et al., 2016). Az észlelt 10 083 záró DAR nem mutatott ki szignifikáns GO kifejezéseket a GREAT alapértelmezett szignifikanciakritériumai alapján (lásd az 5. kiegészítő ábrát).

3. ábra: A kromatin hozzáférhetőségében mutatkozó különbségek jellemzik az E14.5 és a P0nephron progenitor sejtek.A) Az ATAC-seq minták főkomponens-elemzése kiemeli a fejlődési időpontokat, mint a variációk fő forrását. B) Hőtérkép, amely jelentősen változó IDR régiókat mutat az ATAC-seq minták között. Az E14.5 minták/oszlopok világoszölddel, a P0 minták/oszlopok pedig sötétzölddel vannak jelölve. C) A GO Biological Process kifejezések olyan genomiális régiókra dúsítva, amelyek E14,5 és P0 között nyílnak meg a GREAT szerint, binomiális P-érték szerint rangsorolva, FDR Kisebb vagy egyenlő, mint 0,001.

Ezután felfedeztüka kromatin hozzáférhetőségea genom azon régióiban, amelyek a nephron progenitor sejtek differenciálódásában publikált szerepet játszó gének promótereit és enhanszereit tartalmazzák. Ezek közül a Six2 transzkripciós faktor kritikus fontosságú a multipotencia fenntartásábannephron progenitor sejtek(Self és mtsai, 2006), és minden mintában megfigyeltük a promóterét körülvevő hozzáférhető kromatint és a Six2 transzkripciós starthelytől (TSS) ~50 kb feljebb lévő ismert Six2 enhanszert (O'Brien et al., 2018) (ábra) 4A, B, kék árnyalatú területek). Megjegyezzük továbbá a promóteren hozzáférhető kromatin régiókat és a Gdnf fehérje közzétett enhanszerét (4D, E ábra), amelyet a nephron progenitorok választanak ki, hogy elősegítsék az ureterbimbó elágazását (Sanchez és mtsai, 1996; Vega és mtsai, 1996). ). Ez az enhanszer a génpromotertől kb. 113 kb felfelé található, és ismert, hogy reagál a Wnt jelátvitelre a nephron progenitorok fejlődésével összefüggésben (Park et al., 2012). Míg a Gdnf promoter nem változik jelentősen az idő múlásával, a megjegyzésekkel ellátott enhanszer jelentősen növeli a hozzáférhetetlenséget. Megjegyezzük továbbá a hozzáférhető kromatin régiókat, amelyek az Eya1 nephron progenitoraiban aktív, publikált enhanszert vesznek körül, amely a gén TSS-jétől ~325 kb felfelé található (Park et al., 2012) (6. kiegészítő ábra). Az Eya1 egy transzkripciós faktor, amely kölcsönhatásba lép a Six2-vel, hogy fenntartsa a nephron progenitor multipotenciáját (J. Xu et al., 2014).

Számos olyan DAR-t figyeltünk meg, amelyek nem fedik át az ismert szabályozási jellemzőket, de olyan régiókat foglalnak magukban, amelyekről az előrejelzések szerint specifikus gének fokozó aktivitása van számos egérsejttípusban, amint azt az EnhancerAtlas 2 jegyzetekkel látja el.0 (Gao és Qian, 2020). Az Eya1 közzétett enhanszerén (Park és mtsai, 2012) (6. kiegészítő ábra) kívül az Eya1 egyik intronjában található záró DAR (5A-B. ábra) magában foglal egy olyan régiót, amelyről azt jósolják, hogy az egér Eya1 génjére fokozó aktivitása van. idegi progenitor és granulocita-monocita progenitor sejtek (Gao & Qian, 2020). Az enhanszer aktivitás csökkenésével összhangban korábban megfigyeltük, hogy az Eya1 expressziója csökken a differenciáló nephron progenitorokban az E14.5 scRNS-seq adatok felhasználásával (7. kiegészítő ábra) (Bais et al., 2020). Ez összhangban van az elsődleges E16.5 nephron progenitorokban publikált ChIP-seq adatokkal, amelyek az aktív enhanszer jel, a H3K27ac hiányát, valamint a Ctnnb1, Lef1, Six2 és Tcf7 kötődésének hiányát mutatják (5. ábra) (Guo et al. ., 2021). Ez a potenciális fokozó a Hoxd10 transzkripciós faktor lábnyomait is tartalmazza a csúcson belül, egy olyan transzkripciós faktor, amely elengedhetetlen a nephron progenitorok differenciálódásához és integrációjához a mezenchimális-epiteliális átmenetek (MET) során (Yallowitz et al., 2011).

A 24-es kromoszóma elérhetetlenségét növelő DAR átfed egy kromatin régiót a Pax8 transzkripciós faktor előrejelzett fokozó aktivitásával egérveséből, bélhámból és méhből tenyésztett sejtekben (Gao és Qian, 2020). A Pax8 részben redundáns a Pax2-vel, de e két transzkripciós faktor közül legalább egy szükséges a nephron progenitorokbanvesefejlesztése (Bouchard et al., 2002; Narlis et al., 2007). Korábban megfigyeltük, hogy a Pax8 expressziója növekszik a differenciálódó és differenciált nephron progenitorokban (7. kiegészítő ábra), és azt észleltük, hogy jelentős mértékben megnövekedett a hozzáférhetőség egy DAR-ban, amely magában foglalja ezt a szabályozó funkciót. Ez a régió egy aktív enhanszer jelöléssel, a H3K27ac-vel és a Ctnnb1, Lef1, Six2 és Tcf7 kötődésével is összefüggésbe hozható az elsődleges E16.5 nephron progenitorokból származó publikált ChIP-seq adatokban (5. ábra) (Guo et al., 2021). Számos olyan transzkripciós faktor lábnyomot figyeltünk meg, amelyek ennek a DAR-nak a rendkívül konzervált hozzáférhetőségi csúcsán belülre esnek, köztük kettőt a Sall1-re, egy nukleáris faktorra, amelyről ismert, hogy befolyásolja a nefrogenezist (Kanda et al., 2014), és hét szorosan csoportosított lábnyomot a MYC-hez kapcsolódó cinkujj esetében. protein (Maz), egy transzkripciós faktor, amelyről kimutatták, hogy dózisfüggő hatással van avesefejlődése emberekben és egerekben (Haller et al., 2018). A 3. kiegészítő táblázat tartalmazza az általunk talált elérhető régiók teljes listáját, valamint a hozzájuk tartozó differenciális hozzáférhetőségi statisztikát, a génekre, exonokra és promóterekre vonatkozó megjegyzéseket, amelyek átfedésben vannak, valamint a kulcsfontosságú nefrogenezishez kapcsolódó transzkripciós faktor lábnyomok listáját.

4. ábra: ATAC-seq profilok ismert és feltételezett szabályozási lókuszokban. Minden panelen felülről lefelé a fazetták a hajtások feldúsulását jelzik.a kromatin hozzáférhetőségeaz E14.5 és P0 mintákban, az IDR-eket és a DAR-okat kék (változatlan IDR) és zöld (nyitási DAR) kiemelésként azonosították. és piros (záró DAR). A következő oldal a génjegyzeteket, a nukleoszóma pozíciókat (szürke) és a nukleoszómamentes régiókat (piros) mutatja az egyesített E14.5 és P0 mintákban, valamint a PhastCon60 konzervációs pontszámokat (a fekete 1{{ 12}}0 százalékos konzerváció, fehér 0 százalék A) A Six2 transzkripciós faktor promótere és génteste. B) Enhancer for Six2, kiadó: Park et. al. C) Különbözően hozzáférhető javító a Gdnf számára, megnövelt elérhetőséggel P0-nál. D) Promoter a Gdnf számára.

5. ábra: A nefrogenezishez kapcsolt gének lehetséges új enhanszereit átfedő DAR-ok. A és C) A panelek a kérdéses gént körülvevő 1 MB-os régió térképét ábrázolják, a fehérjét kódoló gének zöld színűek, a javasolt enhanszer/promoter kölcsönhatás pedig fekete hurok formájában. . B és D) A panelek felülről lefelé a hajtás dúsítását ábrázoljáka kromatin hozzáférhetőségeE14.5 és P0 mintákban mérve, az IDR-ek zölddel (nyitás) és pirossal (zárás) vannak kiemelve, majd ChIP-seq mérések ezekben a régiókban Guo et. al. primer nephron progenitorbansejteket(Guo et al., 2021). A harmadik panel a génjegyzeteket (kék) és az Enhancer Atlas 2.0 (piros) előre jelzett szabályozóelemeit ábrázolja, a negyedik panel pedig az ATAC-seq adatokban azonosított transzkripciós faktor lábnyomait. Az ötödik panel a nukleoszómákat (szürke) és az NFR-eket (piros) ábrázolja, az alsó panel pedig a megőrzést. A) 1 MB régió, amely tartalmazza az Eya1 géntestét és egy potenciális Eya1 enhanszert, körülbelül 325 kb-ra felfelé. B) A potenciális Eya1 enhanszert tartalmazó 4,5 kb-os régió. C) 1 MB régió, amely a Pax8 génlókuszt és egy előre jelzett enhanszert tartalmazza. D) Egy 4,5 kb-os régió, amely tartalmazza a megjósolt enhanszert és annak átfedő DAR-ját.

A topológiailag asszociált domének segítenek azonosítani a potenciális fokozó-miRNS kapcsolatokat

A topológiailag asszociált domének (TAD) a magasabb rendű kromatin szerveződés megabázis-méretű régiói, amelyek a kromatin háromdimenziós térben a magba való becsomagolódásából származnak (Dixon et al., 2012), és az enhanszer-promoter kölcsönhatások jellemzően a következőkre korlátozódnak. elemek ugyanazon a TAD-n belül (Symmons et al., 2014). Egér embrionális őssejtekből (ESC) generált annotációk segítségével közelítettük a nephron progenitorokból származó TAD-okat (Y. Wang és mtsai, 2018). A miRNS lehetséges cisz-szabályozó régióinak szűréséhez korreláltuk a változásokata kromatin hozzáférhetőségeeltérően expresszált miRNS-sel ugyanazon a TAD-n belül. Összességében 42 778 egyedi elérhető régió (körülbelül 92 százaléka) található a megjegyzésekkel ellátott TAD-okon belül, és ezek közül 30 626 (körülbelül 72 százalék) nem fedi át ismert promótereket. Ez 2103 DAR-t tartalmaz, amelyekből 1180, illetve 923 nyit és zár az idő múlásával. Tizenöt nyitó DAR osztozik egy TAD-n egy vagy több miRNS-sel, amelyek expressziója megnövekedett E14.5 és P0 között, kilenc záró DAR pedig egy vagy több csökkent expressziójú miRNS-sel. A 6. ábra összefoglalja ezt a megközelítést, és szemlélteti a DAR-ok és a hozzájuk illő miRNS-ek közötti távolságokat, amelyek 27 kb-tól 1 mb-ig terjednek (átlag: 447 kb). Az 1. táblázat részletezi a lehetséges DAR-miRNS kapcsolatok készleteit, egy DAR-ral minden egyező miRNS-en.

A jegyzett miRNS-enhancer párok közül három különösen érdekeset jegyezünk meg. Először is, egy nyitó DAR-t azonosítottak a let-7c-5p-től 120 kb-tal és a miR-125b-5p-től 73 kb-val lefelé, amely egy Six2-hez kapcsolódik. kötőhely egy korábban publikált E16.5 nephron progenitor ChIP-seq adatkészletben (7A. ábra) (Guo et al., 2021). A Let-7c-5p az egyik legmagasabb expressziójú let-7 miRNS, amelyet észlelünk, és a let-7 családról ismert, hogy a Lin28b-átiratokat is elnyomja (Slack és Ruvkun, 1997; Zhu et al., 2011). Megjegyezzük, hogy a Hmga2 és a Meis2 a let-7 család potenciális új célpontjaként is azonosítható a nephron progenitorokban (2. ábra). A miR-125b-5p-ről kimutatták, hogy elnyomja a Lin28 transzkriptumokat egér vérképző- és progenitor sejttípusokban (Chaudhuri et al., 2012). Másodszor, a miR-9-3p a miR-9-3p fordított kiegészítése, egy miRNS, amelyről nemrégiben kimutatták, hogy megvédvesefibrózist a metabolikus útvonalak megcélzásával (Fierro‐Fernández et al., 2020). Több mint 10-szeres csökkenést észleltünk a miR-9-3ptranskriptumok számában az E14.5 és P0 nephron progenitorok között, és azonosítottunk egy potenciális szabályozó elemet körülbelül 249 kb távolságra (7B. ábra). Megfigyeltük a Snai1 és Snai2 transzkripciós faktor lábnyomait a kapcsolódó DAR-ban, amelyekről kimutatták, hogy elősegítik az epithelialis-mezenchimális átmeneteket (EMT) (Sundararajan et al., 2019). Végül párosítottuk a miR-181a-2-3p-t egy lehetséges intergenikus cisz-szabályozó lókuszhoz, amely a 2. kromoszómán található, 131 kb-al feljebb, ahol megfigyeltük a Wt1 transzkripciós faktor lábnyomát, amely a nephron progenitor kulcsfontosságú szabályozója. túlélés (Kreidberg et al., 1993), és Six2 kötődés egy publikált E16.5 nephron progenitor ChIP-seq adatkészletben (7C. ábra)) (Guo et al., 2021).

1. táblázat: miRNS expressziós változások, egy vagy több DAR-hoz illeszkedve ugyanabban a TAD-ban.

6. ábra: Enhanszerjelölt keresése – cél-miRNS párok.A) Folyamatábra, amely bemutatja, hogy a hozzáférhető régiók hogyan kerültek előtérbe a miRNS-expresszió lehetséges szabályozásához. B) Minden egyes szűrt miRNS genomiális elhelyezkedése a jelölt enhanszerhez viszonyítva (narancssárga függőleges csík). Az y-tengelyen log2-szeres változásuk léptéke látható, a növekvő vagy csökkenő expressziójú miRNS-ek pedig zölddel, illetve pirossal vannak kiemelve.

7. ábra: Négy potenciális fokozó – cél miRNS-pár. A TAD-ok szürkével vannak kiemelve, a kiindulási pontokhoz igazítva, és ugyanabban a skálában rajzolva a relatív méret szemléltetésére. Az Ensembl ismert génjei lilával láthatók, a sötétebb régiók pedig exonokat jeleznek. A relatív elérhetőség E14.5-nél és P0-nál oszlopdiagramokként láthatók a vízszintes fekete vonal felett, illetve alatt, valamint a megadott DAR-ban a halmozódást illusztráló beillesztett diagramokban a Guo et által közzétett ChIP-seq adatokkal együtt . al. (Guo et al., 2021). A HINT által azonosított transzkripciós faktor lábnyomok narancssárga szalaggal vannak felsorolva. A jobb oldali különálló paneleken lévő oszlopdiagramok a miRNS expresszióját (zöld) és a normalizált Tn5 inszerciós eseményeket jelzik a javasolt enhanszer régiókban (narancs). A) A let-7 családtag let-7c-5p nagyon erősen kifejeződiknephron progenitor sejtekés egy intergénikus régióban 119 kb távolságra lévő "peak_54636"-nek felel meg. B) A miR-9-3p egy 249 kb távolságra lévő DAR-nak felel meg. C) A miR-181a 2-3p 131 kb-nyi távolságra található a "csúcstól_5887", amely egy lehetséges intergénikus fokozó.

Vita

Ebben a tanulmányban arra törekedtünk, hogy egyidejűleg azonosítsuk az új miRNS-t, amely hozzájárul a nefrogenezis leállításához, valamint a lehetséges cisz-szabályozó jellemzőket. 114 miRNS-t azonosítottunk, amelyek eltérően expresszálódnak a nephron progenitor sejtekben, valamint 2,103 DAR-t az E14.5-ben a P0-hoz képestvese. Számos olyan jellemzőt figyeltünk meg, amelyek az Eya1 és Pax8 gének új feltételezett fokozóit jósoljáknephron progenitor sejtek. Végül megállapítottuk, hogy következetesa kromatin hozzáférhetőségeés miRNS expressziós változásai 33 pár miRNS és DAR esetében, beleértve a let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3 p és miR-9-3p, és bemutatja a nephron progenitorokban expresszálódó feltételezett célgéneket a differenciálisan expresszált miRNS-ekhez. Adataink együttesen azt mutatják, hogy a nephron progenitorokkal kapcsolatos és a nefrogenezis stádiumától függő változások tükröződnek a progenitor sejt kromatin környezetében és miRNS transzkriptumában.

A nephron progenitor miRNS-transzkriptomában megfigyelt változások között megfigyelhető az expresszió széles körű növekedése a let{{0}} családban, ahogy a progenitorok öregednek. Ez összhangban van a korábbi jelentésekkel: a Lin28b fehérje és a miRNS let{2}} családja kölcsönösen antagonisztikus, és egy bistabil kapcsolót alkotnak, amely szabályozza a let-7 expresszióját emlősökben (Zhu et al., 2011). nephron progenitorok esetében, a megnövekedett let{5}} expresszió felé történő váltás közvetlenül befolyásolja a nefrogenezis leállásának időpontját (Yermalovich et al., 2019). Megfigyeltük a miR-125b-5p fokozott expresszióját is, amelyről ismert, hogy más sejtkontextusban is elnyomja a Lin28b expresszióját (Chaudhuri et al., 2012; Potenza és mtsai, 2017). A let-7 család és a miR-125b-5p a 114 miRNS közé tartozik, amelyek E14.5 és P0 között eltérően expresszálódnak a nephron progenitorokban, ami a miRNS-ek szerepére utal a nephron progenitor fejlődésében nem korlátozódik a let-7/Lin28b-re. Például az expressziót csökkentő miRNS-ek közé tartozik a miR-200 család két tagja, amely a jelentések szerint szerepet játszik a podocita differenciálódásban (Z. Li et al., 2016): miR-200b -3p és miR-429-3p. A továbbiakban megfigyelhető a miR-126a 5p expressziójának csökkenése, amelyről ismert, hogy elősegíti a vaszkulogenezist (Schober et al., 2014; S. Wang és mtsai, 2008). Ez tükrözheti a vasculogen és nephron progenitorok közös mezenchimális származását, és e sejtek egy részhalmazának elkötelezettségét a nephron progenitorokká válás iránt.

A változó miRNS-ek megjósolt géncélpontjainak DIANA miRPath segítségével végzett elemzései (Vlachos és mtsai, 2015) dúsító MAPK- és TGF-jelátvitelt mutatnak, amelyek a nephron progenitorok kulcsfontosságú szabályozói (Hilliard et al., 2019; Ihermann-Hella és mtsai, 2018). ). Számos más KEGG-útvonal is felülreprezentált a felszabályozott miRNS-ek megjósolt géncélpontjai között, beleértve az extracelluláris mátrixhoz, az aktin citoszkeletonhoz és a fokális adhézióhoz kapcsolódó útvonalakat: a sejtmigráció, a differenciálódás, az elágazás, a kötődés, a polarizáció és a proliferáció minden kulcsfontosságú aspektusa. (Rozario és Desimone, 2010). Az ECM-hez kapcsolódó gének célpontjai az általunk leginkább expresszált és szignifikánsan növekvő miRNS-ek, köztük az általunk észlelt legmagasabb expressziós transzkriptum: miR-196a-5p. A miR-196a-5p köztudottan a Col1a1, Col1a2 és Col3a1 géneket célozza meg – a Pax2-hiányos nephron progenitorokban fokozottan szabályozott géneket, amelyek transzdifferenciálódnak a vese strómájába (Naiman et al., 2017). Így a megnövekedett miR-196a-5pexpresszió szerepet játszhat a leszármazási határok megerősítésében, ahogy az elődök öregszenek. Ezen túlmenően új lehetséges miRNS-mRNS célinterakciókat azonosítunk, amelyek hozzájárulhatnak a nefrogenezis leállításához, beleértve a let-7 család felpörgetését, amelyek a Hmga2-t és a Meis2-t célozhatják (a sejtproliferációval összefüggésben) (Abruzzese et al. ., 2019; Fusco és Fedele, 2007; Lam és mtsai, 2014; Mugford és mtsai, 2009), mivel a nephron progenitorok elöregednek. A Hmga2-nek nincs ismert szerepevesefejlődés. Azonban úgy gondolják, hogy a Meis2 funkcionális átfedésben van a kapcsolódó Meis1 transzkripciós faktorral, amelyről ismert, hogy a vesefejlődéshez szükséges (Hisa et al., 2004). Megfigyeljük a miR-ek (miR-34b-5p, miR-983p és miR-200a-3p) leszabályozását is, amelyek célozhatnak Jag1, amelyről ismert, hogy fokozottan szabályozott és fontos a nefronok differenciálódásában (Chung et al., 2016).

A változó miRNS transzkriptom mellett egyidejűleg mértük a nephron progenitor sejt kromatin környezetének változásait is E14.5 és P0 között. Leírunk két feltételezett új enhanszert az Eya1-hez és a Pax8-hoz, (i) ezeknek a génpromoterekhez való közelségüknek, (ii) a megfelelő változásaik alapján.a kromatin hozzáférhetőségea fejlődés során összhangban van a pszeudoidejű génexpresszió változásaival a differenciálódás során, (iii) lábnyomok avesefejlődési transzkripciós faktorok, (iv) szekvencia megőrzése, (v) az Enhancer Atlas2-ből származó más szövetekben/sejttípusokban az enhanszer funkcióra utaló bizonyítékok.0 (Gao és Qian, 2020), és (vi) ChIP-seq adatok az E16-ban 0,5 nephron progenitor az aktív enhanszer (H3K27ac) és a Ctnnb1, Lef1, Six2 és Tcf7 transzkripciós faktor kötődésének jelzésére. Megfigyeltük az Eya1 fokozó kromatin hozzáférhetőségének csökkenését, ami összhangban van az Eya1 szerepével a nephron progenitor multipotencia előmozdításában, valamint azokkal a jelentésekkel, amelyek szerint az Eya1 elvesztése a progenitor populáció korai epithelializációját eredményezi (J. Xu et al., 2014; PX Xu et al., 1999). A Pax8 és homológja Pax2 hozzájárul a nephron progenitorok leszármazási vonalának meghatározásához (Bouchard és mtsai, 2002), és a legalább egy ilyen gént nem tartalmazó nefron progenitorok nem esnek át MET-en (Narlis et al., 2007). A megnövekedett kromatin hozzáférhetőség, amelyet a feltételezett Pax8 fokozó esetében észlelünk, összhangban van a Pax8 fokozott expressziójával a vese epitéliumában, ahogy a nefronok differenciálódnak.

A DAR-ok dúsítási analízise (McLean és mtsai, 2010) a „hámdifferenciálódás szabályozása” kifejezést tárta fel a legjelentősebben gazdagodott kifejezésként a nyitó kromatin régiók között, ami azt jelzi, hogy az általunk észlelt DAR-ok olyan szabályozási jellemzőket tartalmazhatnak, amelyek a differenciálódás és fejlődés jeleit vezetik, vagy reagálnak azokra.nephron progenitor sejtekhámsejttípusokba. A Notch jelátvitel az egyik legjelentősebben gazdagodott GO kifejezés a nyitó DAR-ok között, és a nephron progenitorokban ez az út köztudottan elnyomja a Six2 expressziót és elősegíti a nephron progenitor sejtek differenciálódását (Chung et al., 2016). Ennek az útvonalnak az érintett génjei közé tartozik a Jag1, a Notch jelátvitel kulcsfontosságú liganduma, amelynek expressziója a jelentések szerint fordítottan korrelál a Six2 és a Hes1 expressziójával (Chung et al., 2016). Megjegyezzük, hogy a Jag1 annotált célpontja három növekvő expressziójú miRNS-nek (miR34b-5p, miR98-3p és miR200a-3p, 2. ábra). Végül megfigyeljük a véredények átalakításával és morfogenezisével kapcsolatos gének feldúsulását a nyitó DAR-okban, bár úgy tűnik, hogy ez a fejlődési utak és a hámsejtek differenciálódása között megosztott gének következménye, beleértve a Jag1-et, Eya1-et, Hes1-et, Foxc1-et és Hey2-t.

Változások aa kromatin hozzáférhetőségeközöttnephron progenitor sejtekkorábbi tanulmányokban (Guo et al., 2021; Hilliard et al., 2019) mérték.

Összességében eredményeink összhangban vannak ezekkel a korábbi tanulmányokkal, kiemelve a Notchsignaling és a Pax{0}}kapcsolódó géneket. Figyelemre méltó azonban, hogy van néhány kísérleti különbség ezekben a korábbi tanulmányokban, összehasonlítva ezzel a jelentéssel. A GFP-t expresszáló nephron progenitorok izolálása fluoreszcenciával aktivált sejttel a Six2-TGC transzgén riporter egérből potenciálisan megzavarta az a felfedezés, hogy ennek az allélnek a nefronszáma körülbelül 45 százalékkal csökkent (Hilliard et al. , 2019; Volovelsky et al., 2018). Ezenkívül kimutatták, hogy a tenyésztett nephron progenitorok (amelyeket akár alacsony, akár nagy dózisú CHIR-rel termesztenek) az elsődleges nephron progenitoroktól eltérő transzkriptomokkal rendelkeznek, ami arra utal, hogy a kromatinhoz való hozzáférésük is eltérő lesz (Guo et al., 2021; Hilliard et al., 2019). Mivel vizsgálatunk célja annak megértése volt, hogy a kromatin táj változásai hogyan befolyásolják a miRNS expresszióját a korai és késői nefron progenitorokban, szükséges volt az elsődleges nephron progenitorok elemzése.

A Cistanche jobb a vese számára

A kromatin környezetben megfigyelt változásokat kombinálva a miRNS-expresszió megfelelő változásaival, több új feltételezett miRNS-enhancer-párt vonunk be a nefrogenezis leállításába további tanulmányozás céljából. A miR-125a-5p és a let-7c-5p miRNS-ek például jelentős expressziónövekedést tapasztalnak E14.5 és P{7}} között. , és ezt összefoglalja a DAR (chr16:77,719,058 77,720,407) növekvő elérhetetlensége ugyanabban a TAD-ban. Ez a DAR egy Six2 kötőhelyhez is kapcsolódik (Guo et al., 2021), és egy enhanszert jelölhet, amely befolyásolja a miR-125a-5p és/vagy let{{18} expresszióját. }c-5p, ami viszont elősegítheti a differenciálódást a Lin28b elnyomása révén. Hasonlóképpen megfigyeltük a miR 181a lehetséges fokozóját, amelyről ismert, hogy modulálja a renin expresszióját emberekben (Marques és mtsai, 2015), és a BIRC6-ot és az apoptózist elnyomó képessége miatt terápiás célpontnak tekintik a nefrotoxicitás csökkentésében (Liu et al., 2015). al., 2018). Végül megfigyelünk egy záró DAR-t, amely a miR-9-3p-hez kapcsolódik, amely transzkripciós faktor lábnyomokkal rendelkezik a Snai1 és Snai2.miR-9-3p reverz komplementjéhez, a miR-9-5p-hez, a Wnt jelátvitelre reagáló fehérjékhez. ellen ismert, hogy védvesefibrózis (Fierro‐Fernández és mtsai, 2020), Snai1 és Snai2 kimutatták, hogy elősegítik a karcinóma metasztázisát egér bőrrák sejtjeiben (Olmeda et al., 2008), és elősegítik az epithelialis-mezenchimális átmenetet (EMT) rákos betegekben (Sundararajan et al., 2019), míg a miR-9 ismerten elősegíti az angiogenezist és a tumor endoteliális sejtek migrációját (Zhuang et al., 2012). Létezhet egy olyan mechanizmus, amelyben a megnövekedett Wnt jelátvitel a Snai1 és Snai2 csökkent expresszióját eredményezi, ami viszont csökkenti a miR-9-3p expressziót, hogy támogassa a nephron progenitor differenciálódását.

Vizsgálatunk átfogóan azonosította a nephron progenitorok kromatin tájképében és miRNS-transzkriptumában bekövetkezett változásokat az embrionális fejlődés során, és azonosítottuk azokat a cisz-szabályozó régiókat és miRNS-t, amelyek szerepet játszhatnak a nefrogenezis leállásában. Mind az mRNS-seq, mind az ATAC-seq adatok dúsítási analízise csábító támpontokat ad az esetlegesen érintett mechanizmusokra, például a nephron progenitor differenciálódását szabályozó útvonalakra, beleértve a Notch-ot és a TGF-et is. Két új feltételezett szabályozó elemről is beszámolunk az Eya1 és Pax8 számára, amelyekről ismert, hogy fontosakvesefejlődését és a kulcsfontosságú miRNS lehetséges szabályozó szekvenciáit, amelyek szerepet játszanak a nefrogenezis leállításában.

Mód

Egér törzsek

A vad típusú CD{0}} időben párosított vemhes nőstényeket a Charles River Laboratories, Inc.-től (Wilmington, MA, USA, RRID: MGI:5659424) szereztük be.veseE14.5 vagy P0 embrionális napon gyűjtöttük be. Az összes állatot a Pittsburgh-i UPMC Gyermekkórház Rangos Kutatóközpontjában (Pittsburgh, PA, USA) helyezték el a viváriumban, és minden állatkísérletet a University of the University of Institutional Animal Care and Use Committee irányelveivel összhangban végeztek. Pittsburgh. Az egyes embriók vagy kölykök nemét a farokvágásból izolált genomi DNS-en végzett PCR-rel azonosítottuk az Sry Y-kromoszóma gén következő primereivel: SryF 5ʹ-GATGATTTGAGTGGAAATGTGAGGTA-3ʹ és SryR 5ʹ-CTTATGTTTATAGGCAT,{{GCACCATGTA', korábban publikált (McFarlane et al., 2013).

Kis RNS szekvenálás és elemzés

A teljes RNS izolált anephron progenitor sejtekAz ATAC-seq sejtfrakció eltávolítása után megmaradt anyagot benyújtották a pittsburghi UPMC Children's Hospital Health Sciences Sequencing Core-jához könyvtár-előkészítés céljából a QIAseq miRNS könyvtár-előkészítő készlettel (Qiagen 3315{{10}}2). Az mRNS-seq könyvtárak egyvégű szekvenálását Illumina NextSeq500 eszközön végeztük, és a könyvtárakat körülbelül 50 millió egyvégű olvasási mélységig szekvenáltuk könyvtáronként. A szekvenált leolvasásokat ezután az Rsubread csomag (Liao et al., 2019) (2.0.1-es verzió) segítségével az egér mm10 genomjához igazították, és a miRBase-ben (22-es verzió) felsorolt ​​ismert miRNS-hez annotáltuk (Kozomara és Griffiths-Jones, 2014). az Rsubread csomag featureCounts funkciójával. Az ismert miRNS differenciális expresszióját a DESeq2 R csomaggal (1.26.0 verzió) mértük (Love et al., 2014). A DESeq2-nek benyújtott tesztmodellben kofaktorként szerepelt az ismert miRNS-hez annotált összehangolt leolvasások, valamint a női embriók mintánkénti frakciója. Ezután azonosítottuk a differenciálisan expresszált miRNS-t, miközben a hamis felfedezési arányt 5 százalékon szabályoztuk, és változási irányukat (növekvő vs. csökkenés) határoztuk meg a szorzós változási értékük alapján (a „növekedés”, ami magasabb expressziót jelez P0-nál az E14.5-höz képest). . A szignifikánsan növekvő és csökkenő expressziójú miRNS előre jelzett géncélpontjai között a szabályozó utak feldúsulását a DIANA eszközök miRPath 3.0 verziójával számítottuk ki (Vlachos et al., 2015). A miRNS megjósolt céltranszkriptumait a TargetScan (Agarwal és mtsai, 2015) és a miRDB (Y. Chen és Wang, 2020) tárolókból nyertük ki.

Nephron progenitor izolálása

Vese{{0}} E14.5 embriókból vagy P0 kölykökből álló almokból boncolták ki, és minden almot egy mintának tekintettünk. Mintánként egy vesét használtunk a teljes RNS-izolációhoz, hogy „teljes vese kontrollként” használjuk a következő elemzésekben (lásd alább). Minden időpontban összesen három mintát gyűjtöttünk. Ezután minden egyes mintából a kérgi sejteket izoláltuk mágnesesen aktivált sejtválogatással (MACS) a korábban publikált módon (Brown et al., 2011). Röviden, a vesék részleges emésztésen mentek keresztül 2 mM kollagenáz A-val (Roche 11088793001) és 3,5 mM pankreatinnal (Sigma P1625) foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) 15 percig 37 °C-on. Az emésztési reakciót hideg, 100%-os magzati borjúszérum (FBS) alkalmazásával leállítottuk, a sejtszuszpenziót összegyűjtöttük, és hideg Dulbecco-féle foszfáttal pufferolt sóoldatban (DPBS) 1 mM fenil-metil-szulfonil-fluorid (PMSF) proteáz-inhibitorral (Sigma-Aldrich 108031) (Sigma-Aldrich 108031) tartalmazó oldatban reszuszpendáltuk. A sejteket mostuk és jéghideg izolációs pufferben szuszpendáltuk, amely 2% FBS-t tartalmazott PBS-ben, majd mágneses gyöngyökkel (Dynabeads FlowComp Flexi kit, ThermoFisher 11061D) inkubáltuk, amelyek az Integrin alpha 8, AF R&Itg68 (AF4 R&Itg68) ellenanyagaira biotiniláltak. a DSB-X Biotin Protein Labeling Kit (ThermoFisher D-20655) segítségével. Az ezekhez a gyöngyökhöz kötött nephron progenitorokat a korábban publikált módon izoláltuk (Hemker és mtsai, 2020), és minden minta esetében egyesítettük a vesékben. 50,{29}} nephron progenitor sejtből álló alikvot részt azonnal feldolgoztunk aa kromatin hozzáférhetőségekönyvtár-előkészítési protokollt (lásd alább), és a maradék sejtszuszpenzióból a teljes RNS-t a Qiagen miRNeasy Mini Kit (Qiagen 217004) segítségével extraháltuk.

A dúsítás megerősítésérenephron progenitor sejtekmás sejttípusokhoz képest a teljes RNS-t a nephron progenitorokból, valamint az egészből izoláltukvese(teljes vesekontroll, lásd fent), és kvantitatív reverz transzkripciós PCR-t (qRT-PCR) végeztünk a következő markerekre: nephron progenitor markerek Six2 és Cited1 (L. Huang et al., 2016), valamint Lhx1, Pdgfr, Pekándió és Caleb, amelyek a vese hólyagot (Brunskill és mtsai, 2014), a vese stromát (S. Chen és mtsai, 2015), az endotéliumot (Kobayashi és mtsai, 2008) és a húgyhólyagot (Cebrian et al., 2014a) jelölik ) sejtek, ill. lásd még az 1. kiegészítő ábrát. A Gapdh-t (Barber és mtsai, 2005) háztartási génként használták, és a relatív kvantifikációt a 2-ΔΔCt módszerrel számították ki (Livak & Schmittgen, 2001). Ezen átiratok primerjeit a 2. táblázat tartalmazza.

2. táblázat. RT-PCR primerek.

A kromatin hozzáférhetőségekönyvtári előkészítés

Körülbelül 50,000nephron progenitor sejtekaz ATAC-seq egyes szekvenálási könyvtárait a Nextera DNA Flex Library Prep Kit (Illumina FC-121-1030) segítségével egy korábban publikált módszer szerinti módosításokkal (Buenrostro et al., 2013) használták. Röviden, a sejteket jéghideg, nem ionos lízispufferben szuszpendáltuk, amely 10 mM Tris-t, 10 mM NaCl-t, 3 mM MgCl2-t, 1 mM PMSF proteáz inhibitort és 0,05 térfogatszázalék Triton X-100-t tartalmazott 10 percre a sejt lízisére. membránokat, miközben a magmembránokat érintetlenül hagyja. Az ép nephron progenitor magokat transzpozáz enzimet tartalmazó transzpozíciós pufferben szuszpendáltuk, és 37 fokon 30 percig inkubáltuk. A transzpozíciós folyamat során felszabaduló szabad genomiális DNS-t a MinElute PCR Purification kit (Qiagen 28004) segítségével tisztítottuk, majd a Nextera Index Kit (Illumina FC{19}} forward (i7) és fordított (i5) indexű primereivel indexeltük. Az indexligálást és a fragmens amplifikációt a módszer PCR amplifikációs termikus ciklusos programjával végeztük.

Az ATAC-seq könyvtárhoz szükséges amplifikációs ciklusok optimális számának meghatározásához qPCR mellékreakciót hajtottunk végre SsoAdvanced SYBR Supermix (BioRad 1725274) és egy 96-lyuk C100 Thermal Cycler (Bio-Rad) segítségével a normalizált érték kiszámításához. riporter érték (Rn) minden ciklushoz. Azt a ciklusszámot, amelynél a reakció elérte a maximális fluoreszcenciájának egyharmadát, a hátralévő amplifikációs ciklusok optimális számaként azonosítottuk, és az indexelt ATAC-seq transzpozíciós reakció fennmaradó térfogatát a végső amplifikációban ennyi további ciklusnak vetették alá. program. A végső könyvtárakat Ampure XP mágneses gyöngyökkel (Beckman Coulter A63881) tisztítottuk.

A kromatin hozzáférhetőségeszekvenálás

Az ATAC-seq könyvtár páros végű szekvenálását Illumina NextSeq500-n végezte a Health Sciences Sequencing Core a pittsburghi UPMC Children's Hospital-ban, multiplexelve a könyvtári koncentrációkkal, amelyek várhatóan 90 millió páros végű olvasást eredményeznek mintánként. . Az olvasás minőségét a TrimGalore (BabrahamLab, 2014) (0.4.3-as verzió) segítségével, „--párosított” módban, egyébként alapértelmezett beállításokkal csökkentették. A leolvasásokat az mm10 genomhoz igazították (Church et al., 2011) a Bowtie2 (Langmead et al., 2009) (2.3.1-es verzió) használatával a „--local -q -X 2000 -- beállítással m". Ugyanazon DNS-fragmens PCR-másolatából származó leolvasásokat a Picard Tools (Broad Institute, 2016) MarkDuplicates funkciójával (2.10.9-es verzió) jelöltük meg alapértelmezett beállításokkal. A genom egynél több helyére félreérthetően leképezett olvasatokat véletlenszerűen e helyek egyikéhez rendelték, ha négynél kevesebb lehetőség volt, és egyébként kiiktatták őket (ENCODE, nd) (egy Python-szkript segítségével, amely elérhető a https://github címen). com/kundajelab/atac_dnase_pipelines, (Lee, 2017) a „--paired-end -k” beállítással). A Samtools-t (H. Li et al., 2009) (1.3.1-es verzió) használták a duplikált, feltérképezetlen, árva és mitokondriális leolvasások kiszűrésére, valamint a BAM-fájlok rendezésére és indexelésére. Az ATAC-seq adatok minőségellenőrzése az ENCODE projekt ATAC-seq irányelveit követte (ENCODE, nd), és a mintakönyvtárakat véletlenszerűen lemintázták, hogy mindegyik 31 millió páros végű olvasást tartalmazzon, hogy normalizálják a könyvtárméretek különbségeit.

A Cistanche megelőzheti a vesefertőzést

Az elérhető kromatin régiók azonosítása

A szűrt ATAC-seq olvasást tartalmazó BAM-fájlokat a Bedtools (Quinlan & Hall, 201{{20}}) (2.26.0 verzió) 'bombed) segítségével páros végű BED formátumba konvertálták ' funkció a "- bed pe -mate1" beállításokkal. A hozzáférhető kromatin régióit a Model-based Analysis of ChIP-seq eszköz (MACS2, 2.1.1.20160309) széles csúcsú hívó algoritmus (Zhang et al., 2008) segítségével azonosítottuk, a következő beállításokkal: „--formátum BEDPE {{ 18}}g mm -p 0.01 --széles --shift 37 --szövegméret 75 --keep-dup all --model". A nagy megbízhatóságú hozzáférhető régiók azonosításához páronkénti összehasonlításokat végeztek (egy adott időpontból származó ismétlődések minden egyes kombinációját), és kiszámították az irrerodukálhatatlan felfedezési arányt (IDR) (Q. Li et al., 2011) egy nyilvánosan elérhető módszer segítségével. Python implementáció (GitHub https://github.com/nboley/idr) (Boleu et al., 2015) "--input-file-type wide peak --rank p.value {{" beállításokkal 35}}soft-IDR-threshold 0.{39}}output-file-type bed". Pontosabban, minden egyes időponthoz az összes elérhető régió összefűzött BED-fájlja került benyújtásra a "--csúcslista" argumentum segítségével minden összehasonlításhoz (például két E14.5 minta összehasonlításakor minden E14.5 széles csúcs mindhárom ismétlés között használjuk). Azokat a hozzáférhetőségi régiókat, amelyek az IDR szerint konzisztensnek bizonyultak legalább két páronkénti ismétléses összehasonlításban (minimum 20 százalékos átfedéssel), a nagy megbízhatóságú hozzáférhető régiók ("IDR régiók") egységes halmazává egyesítették.

Változások az elérhető kromatin régiókban

Az egyes IDR-régiók elérhetőségét egy adott mintán belül úgy határoztuk meg, hogy megszámoltuk a transzpozíciós események számát, amelyek a szekvencia GC-tartalmának normalizálása során fordulnak elő a minták között. Ezt egy egyéni szkript segítségével érték el (elérhető a mellékelt szoftvertárban, lásd a kiegészítő adatokat). A hozzáférhetőség változásait azután úgy határoztuk meg, hogy ezeket az értékeket időpontok között összehasonlították a Limma-voom (3.42.2-es verzió) szoftvercsomag segítségével (Ritchie et al., 2006). Az embriók nemének figyelembevétele érdekében az egyes mintákban a női embriók frakcióját kofaktorként szerepeltették a differenciális hozzáférhetőségi elemzéshez használt lineáris modellekben, és a Limma csomag eltávolítása batch hatás funkciójával eltávolították a vizualizációkból kötegelt hatásként. A kromatin eltérően hozzáférhető régiói (DAR) szignifikánsan nyílónak (megnövekedett hozzáférhetőség E14.5 és P0 között) vagy záródónak (csökkent hozzáférhetőség E14.5 és P0 között) minősültek, amikor a hamis felfedezési arányt 10 százalékon szabályozták. . A nyitó és záró genomiális régiók funkcionális dúsítási elemzését úgy határozták meg, hogy a megfelelő koordinátákat elküldték a Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool-nak (GREAT, elérhető a http://great.stanford.edu/public/html/ címen) (McLean et al., 2010). ). Az ismert és előre jelzett fokozók annotációit a FANTOM5 (Andersson és mtsai, 2014), a VISTA (Visel és mtsai, 2007) és az EnhancerAtlas 2.0 (Gao és Qian, 2020) tárolókból gyűjtöttük ki.

Transzkripciós faktor lábnyomok

A transzkripciós faktor lábnyomait úgy azonosítottuk, hogy összegyűjtöttük az összes BAM fájlt ugyanabban az időpontban, majd futtattuk a Regulatory Genomics Toolbox Hmm-alapú Identification of TF Footprints (HINT) szoftverét (0.12.3 verzió), különösen az ATAC lábnyom-modelljét. -seq adatok (elérhető a www.regulatory-genomics.org címen) (Z. Li et al., 2018). Ez a szoftver a következő beállításokkal futott: "right-hint footprinting --organism=mm10 --at-seq --paired-end". A lábnyomokat ezután a HOCOMOCO 11 adatbázisból (Kulakovskiy et al., 2018) ismert egérkötő motívumokkal annotáltuk a HINT motívumillesztő funkciójával a „jobboldali motívumelemzés megfelelő --organism=mm10” beállítással. A 10 alatti HINT pontszámú lábnyomokat kizártuk. Végül az RGT-HINT program differenciálfüggvényének segítségével megmértük a motívumhoz illő lábnyomok eltérő aktivitási mintázatait a „jobb oldali tipp differenciális --organizmus=mm10 --bc {{27} beállítással. }NC 12 --kimeneti profilok". A szignifikánsan változó aktivitási szinteket a 0,05-ös p-érték határértéke alapján azonosítottuk (Friedman-Nemeny módszer).

A Cistanche javíthatja a veseműködést

Nukleoszómális konfiguráció

Az azonos időpontból származó igazított leolvasásokat egyetlen BAM-fájlba gyűjtöttük össze, és a NucleoATAC csomagot (0.3.4-es verzió) használták a kötött nukleoszómális diádokra és a nukleoszómamentes régiókra utaló olvasási hosszbeli minták azonosítására ( NFR-ek) (Schep et al., 2015). Ez a szoftver az alapértelmezett beállításokkal futott. A nukleoszómákat a 146 bp hosszúságú régióként annotáltuk, amely az egyes nukleoszóma-diádok köré összpontosul.

Egysejtű RNS expresszió

Az egysejtű génexpressziós adatokat egy korábbi kézirathoz dolgozták fel (BioRxiv https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.16.300293v1) (Bais et al., 2020), és a Gene Expression Omnibusból nyertük ki. (GEOID GSE158166). A 7. kiegészítő ábrába beépített feldolgozott adatok közé tartoznak a sejttípusok, a génexpressziós szintek, az alacsony dimenziós (tSNE) beágyazások és a pszeudoidejű megjegyzések a proliferáló és differenciálódó nefron progenitorok klaszterei között felállított pályához képest. Az adatok elérése és rendszerezése a SingleCellExperiment R csomag segítségével történt (Lun & Risso, 2019).

miRNS-mRNS kölcsönhatások a nephron progenitor sejtek öregedésében és differenciálódásában

Változó kifejezéssel rendelkező gének az önmegújító, az alapozó és a differenciálódás közöttnephron progenitor sejteka Bais és munkatársai által közzétett 3. és 4. kiegészítő táblázatból (FDR< 0.1="" for="" all="" genes,="" 99="" genes="" total).="" mirtarbase="" v8.0="" for="" the="" mouse="" was="" downloaded="" (https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/~mirtarbase/mirtarbase_2022/cache/download/8.0/mmu_mt="" i.xls)="" while="" mirdb="" version="" 6.0="" predictions="" were="" obtained="" from="" the="" mid="" b="" website="" (y.="" chen="" &="" wang,="" 2020);="" high-quality="" mirna-to-target-gene="" predicted="" interactions="" with="" a="" minimum="" score="" of="" 90="" were="" considered.="" annotated="" mir="" target="" genes="" and="" differentially="" expressed="" genes="" were="" then="" intersected="" using="" the="" r="" programming="" environment="" to="" generate="" figure="" 2="" and="" supplemental="" table="">

Kromatin immunprecipitációs szekvenálás primer nephron progenitorokban

A kromatin immunprecipitációs szekvenálás (ChIP-seq) adatai a -catenin, Lef1, Six2 és Tcf7 kötődésre az elsődleges nephron progenitorokban a GEO repository (GSE131119) BedGraph fájljaiból származtak Guo és munkatársai esetében, 2021. A hajtási értékek átlagosan gazdagodtak. replikált mintákon keresztül.

A miRNS expresszióját befolyásoló szabályozó elemek szűrése

A miRNS potenciális fokozóinak kiszűrése érdekében a miRNS-t és a DAR-okat a topológiailag asszociált doménekkel (TAD-kkel) annotáltuk, az egér embrionális őssejtekből származó mm10 annotációi alapján, amelyeket a 3D genomböngészőből (elérhető a http://3dgenome címről) töltöttünk le. .fsm.northwestern.edu/) (Y. Wang et al., 2018). régióia kromatin hozzáférhetőségea miRNS-t pedig fokozójelölteknek tekintették – miRNS-pároknak, ha ugyanazt a TAD-t foglalták el, és konzisztens változásokat mutattak a hozzáférhetőségben és az expresszióban (növekvő elérhetőség a miRNS-expresszió növekedésével és fordítva). A DAR-okat csak akkor tekintették lehetséges „szabályozási jellemzőknek”, ha nem fedik át egy ismert promotert vagy exonvéget. A miRNS és a feltételezett szabályozóelemek potenciális párjait előnyben részesítettük, ha 1) ugyanabban a TAD-ban voltak, és 2) jelentős változásokat tapasztaltak az E14.5 és a P0 között (növekszik a miRNS expressziója és az IDR régió elérhetősége, és fordítva) .

Köszönetnyilvánítás

Shelby Hemker és Abha Bais közreműködtek a kísérleti tervezésben. Az ATAC-seq és mRNS-seq szekvenálását a pittsburghi UPMC Children's Hospital Health Sciences Sequencing Core végezte.

Versengő érdekek

Nincsenek bejelentett versengő érdekeltségek

Finanszírozás

Az AC-t a National Institute of Diabetes and Digestive és a támogatások támogattákVeseAz Országos Egészségügyi Intézet (T32DK061296-17) hatálya alá tartozó betegségek. A DK-t az Országos Egészségügyi Intézethez tartozó Országos Általános Orvostudományi Intézet (R01GM115836) támogatásával támogatták. A JH-t az Országos Egészségügyi Intézethez tartozó Nemzeti Diabétesz és Emésztő- és Vesebetegségek Intézete (R01DK103776 és 125015) támogatásával támogatta. A DMC-t a Nephrotic Syndrome Study Network (NEPTUNE) Karrierfejlesztési Díja és a Pittsburghi Kutatási Tanácsadó Tanács Gyermekkórháza Posztdoktori Ösztöndíja támogatta. Az YP-t a Pittsburgh-i UPMC Gyermekkórház és az Észak-Amerikai Mitokondriális Betegségek Konzorcium támogatásai támogatták.

Az adatok elérhetősége

A várható egér-javítókat a FANTOM5 (DOI: 10.1038/nature12787; a fájl itt érhető el), a Vista (DOI: 10.1093/var/gkl822; a fájl itt érhető el) és az EnhancerAtlas (DOI: 10.1093/var/gkz980) alkalmazásból lettek letöltve; egérfájlok itt érhetők el. adatbázisok. Az egér mm10 genomja és annotációi az Illumina genomes projekten keresztül lettek letöltve (itt érhető el). Az mm9 koordináták mm10-re emeléséhez szükséges láncon átívelő fájlt a UCSC genomböngészőből kértük le (DOI: 10.1101/gr.229102; a fájl itt érhető el). Az egérembrionális őssejtekből származó TAD annotációkat a 3D genomböngészőből kértük le (DOI: 10.1186/s13059-018-1519-9; a fájl itt érhető el). A megjósolt miRNS-transzkriptum-célpontokat a TargetScan-ből (DOI: 10.7554/eLife.05005, itt érhető el) és a miRDB 6-os verziójából (DOI: 10.1093/var/gkz757, a fájl itt érhető el). Az ATAC-seq adatok, beleértve az IDR/DAR helyeket, annotációkat és a differenciáldúsítási eredményeket, elérhetők a GEO-n (GSE168339), csakúgy, mint az mRNS-seq adatok, beleértve a megjegyzéseket és a differenciális expressziós eredményeket (GSE168342). Az adatok feldolgozására és elemzésére, valamint számadatok generálására használt számítógépes kód elérhető a https://bitbucket.org/clugstonA/mirna_enhancers oldalon.

Bibliográfia

Abruzzese, MP, Bilotta, MT, Fionda, C., Zingoni, A., Soriani, A., Petrucci, MT, Ricciardi, MR, Molfetta, R., Paolini, R., Santoni, A. és Cippitelli, M (2019). A MEIS2 homeobox transzkripciós faktor a rákos sejtek túlélésének és IMiD-aktivitásának szabályozója myeloma multiplexben: moduláció Bromodomain és Extra-Terminal (BET) fehérje inhibitorokkal. Sejthalál és -betegség, 10 (4). https://doi.org/10.1038/s41419-019-1562-9

Agarwal, V., Bell, GW, Nam, JW és Bartel, DP (2015). Hatékony mikroRNS célhelyek előrejelzése emlős mRNS-ekben. ELife. https://doi.org/10.7554/eLife.05005

Andersson, R., Gebhard, C., Miguel-Escalada, I., Hoof, I., Bornholdt, J., Boyd, M., Chen, Y., Zhao, X., Schmidl, C., Suzuki, T ., Ntini, E., Arner, E., Valen, E., Li, K., Schwarzfischer, L., Glatz, D., Raithel, J., Lilje, B., Rapin, N., … Sandelin, A. (2014). Az emberi sejttípusok és szövetek aktív fokozóinak atlasza. Nature, 507(7493), 455–461. https://doi.org/10.1038/nature12787

BabrahamLab. (2014). Trim Galore. Bioinformatikában. http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_annyi

Bais, AS, Cerqueira, DM, Clugston, AS, Ho, J. és Kostka, D. (2020). Az egysejtű RNS szekvenálás differenciált sejtciklus-aktivitást tár fel kulcsfontosságú sejtpopulációkban a nefrogenezis során. BioRxiv. https://doi.org/https://doi.org/10.1101/2020.09.16.300293

Barber, RD, Harmer, DW, Coleman, RA és Clark, BJ (2005). GAPDH, mint háztartási gén: A GAPDH mRNS expressziójának elemzése 72 emberi szövetből álló panelben. Fiziológiai genomika. https://doi.org/10.1152/physiolgenomics.00025.2005

Bartel, DP (2009). MikroRNS célfelismerés és szabályozási funkciók. Cell, 136(2), 215–233. https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.01.002.MicroRNA

Bertram, JF, Douglas-Denton, RN, Diouf, B., Hughson, MD és Hoy, WE (2011). Emberi nefronszám: Egészségre és betegségekre gyakorolt ​​hatás. Pediatric Nephrology, 26(9), 1529–1533. https://doi.org/10.1007/s00467-011-1843-8

Boleu, N., Kundaje, A., Bickel, PJ és Li, Q. (2015). Reprodukálhatatlan felfedezési arány (2.0.3). https://github.com/nboley/idr

Bouchard, M., Souabni, A., Mandler, M., Neubüser, A. és Busslinger, M. (2002). Pax2 és Pax8 nephric leszármazási specifikációja. Gének és fejlődés. https://doi.org/10.1101/gad.240102

..............

Feladó: Journal Pre-proof

2021 Kiadó: Elsevier Inc.