A Cistanche hatása a neurotoxin 1-metil-4 -fenilpiridinium (MPP) által kiváltott dopaminerg neuronjainak apoptózisára

Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Tian Jiyu, Chen Jianzong

(Hagyományos Kínai Orvoslás és Kínai Materia Medica Kutatóközpont, Xijing Kórház, FMMU, Xi'an 710032)

Absztrakt

Célkitűzés: Hatásainak vizsgálataCistanche az elsődleges tenyészetben, a dopaminerg neuronok apoptózis sejtjein, amelyeket 1-metil-4-fenilpiridinium (MPP plusz) indukál. Módszer: A nyúlszérum elkészítéséhezCistancheszérumfarmakológiai módszert alkalmaz. Ezután vizsgálja meg a Cistanche hatását a DA neuronok apoptózis sejtjéreMPP pluszindukált modellek morfológiai, áramlási citometriával, TUNEL festéssel.Eredmény: 200μmol/L kezeléseMPP plusz24 órán át vagy tovább indukált apoptózist DA neuronokban. UtánMPP pluszkezelt csoportban az ekvivalens dózisú Cistanche szérumot tartalmazó csoport apoptózisaránya 6,3 százalék.MPP pluszönmagában kezelt 30,2 százalék . A B és C csoport apoptózisos sejtjei szignifikánsan kevesebbek, mint az E csoporté (P<0.05).>Következtetés: A benne lévő szérumCistancheáltal indukált védett apoptózis DA neuronokMPP plusz.

Kulcsszavak: Cistanche;1-metil-4-fenilpiridinium(MPP plusz ); dopaminerg neuronok; apoptózis

Jelenleg a fő terápia aParkinson kóraz összetett levodopa (L-dopa) készítmények helyettesítő terápiája, amelyek nem tudják szabályozni a betegség kialakulását. A betegség előrehaladtával az adagot emelik, általánosságban elmondható, hogy 3-5 éven belül a gyógyító hatás csökken, a motoros tünetek ingadoznak, és gyógyszer okozta dyskinesiák jelennek meg. A közelmúltban végzett vizsgálatok azt találták, hogy az L-dopa apoptózist indukál az in vitro tenyésztett neuronokon [1, 2], majd azt feltételezték, hogy az endogén dopamin neurotoxikus hatása a dopaminerg neuronok elvesztéséhez vezet.Parkinson kór. Ennek egyik oka [3]. A hosszú távú klinikai gyakorlatban a kínai orvoslást alkalmaztuka máj és a vese táplálásalevodopa-készítményekkel kombinálva a PD kezelésére, és jó eredményeket ért el [4-6]. Ez a kísérlet a hagyományos kínai orvoslás védő hatását vizsgálta a dopaminerg neuronok apoptózisára és annak mechanizmusát molekuláris és sejtszintről.

1. Anyagok és módszerek

1.1 Anyagok

DMEM közeg,1-metil-4-fenilpiridinium, MPP plusz, a Gibco cégtől vásárolt magzati szarvasmarha szérum.Citarabin, poli-l-lizin, PLLa Sigma Company-tól vásárolták. 24-lyuk kultúrtányér, 25 cm2

Műanyag kultúrlombikoka NUNC Company-tól vásárolták.A kínai orvosláshasználtunk, a Xi'an Decoction Piece Factory-tól vásároltuk. Az általunk használt állatokat az iskola állatközpontja biztosítja.https://www.xjcistanche.com/products

1.2 Gyógyszeres szérum készítése és kísérleti csoportosítása

A Cistanche fagyasztva szárított porként készül tartósításra, és felhasználáskor desztillált vízzel hígítják. Az állatszérumot új-zélandi nagyfülű fehér nyúlból készítettékszérum, mindegyik egészséges férfi volt, súlyuk 2.5-3.0 kg. Az állatok ekvivalens dózisát a testfelületnek megfelelően átszámítjuk, és véletlenszerűen elosztjuk a kontrollcsoport vak szérumára; 1/2 ekvivalens dózisú csoport szérum (szondán keresztül adagolt Cistanche gyógyászati ​​alapanyag 0,8g/kg); egyenértékű dózisú csoportszérum(A gyomorszondás adag Cistanche cistanche eredeti gyógyászati ​​anyag 1,6g/kg); ekvivalens dózisának 2-szereseszérum(a gyomorszondás adag Cistanche eredeti gyógyászati ​​anyaga 3,2g/kg). Szonda naponta kétszer, összesen 3 napon keresztül, 1 órával az utolsó gyomorszonda után, carotis vérvétel, éjszaka 4 fokon, centrifugálás 2500 fordulat/perc sebességgel 25 percig, a szérum gondos elválasztása, inaktiválás 56 °C-on fokon 30 percig, majd szívással 0,22 μm-es szűrőmembránon keresztül Szűrje ki a baktériumokat és tárolja -20 fokon. Ugyanilyen körülmények között vakpróba nyúl kontroll szérumot készítettünk szondán keresztül azonos térfogatú normál sóoldattal. A kísérletet 5 csoportra osztották. Az A csoport üres nyúl voltszérumkultúra kontroll csoport; A B csoport aszérumtenyészet plusz MPPaz egyenértékű dózis kétszeresét tartalmazó kezelési csoport; A C csoport aszérumtenyészet plusz MPPegyenértékű dózist tartalmazó kezelési csoport; A D csoport egy szérumtenyészet kontrollcsoport volt, amely 1/2 ekvivalens dózisú szérumtenyészetet és MPP-kezelt csoportot tartalmazott; Az E csoport üres nyúlszérum tenyészet plusz MPP-kezelt csoport.

Cistanche haszon

1.3 Középagyi dopaminerg neuronok tenyésztése

Három 14 napos vemhes SD-patkányt választottunk ki, és légembólia szívbe adott közvetlen injekciójával leöltük; az embrionális patkányokat aszeptikus körülmények között kivettük és egy jeges D-Hanks oldattal töltött Petri-csészébe helyeztük. A magzati patkány agyszövetet feldaraboltuk és sztereomikroszkóp alatt elválasztottuk. A [7] hivatkozási módszert némileg javították. Az agyhártyát és a vaszkuláris szövetet lehámozták, és a ventrális középagy A8, A9 és A10 területének szöveteit elválasztottuk. Adjunk hozzá 1 ml 0,125 százalékos pankreatint, és helyezzük egy 37 fokos inkubátorba körülbelül 20 percre, adjunk hozzá megfelelő mennyiségű táptalajt, amely 10 százalék borjúmagzati szérumot tartalmaz az emésztés leállításához, és használjunk leszívást.

Pipettázzuk a csövet egyenletes sejtszuszpenzióba, centrifugáljuk 1500 fordulat/perc sebességgel 5 percig szobahőmérsékleten, óvatosan távolítsuk el a felülúszót, pipettázzuk 15-ször vékonynyakú pipettával, és hagyjuk állni 5 percig. A lizint tartalmazó 24-lyuk tenyésztőlemezen adjon táptalajt minden egyes lyukhoz, hogy a sejtsűrűséget 2 × 105 sejt/ml értékre állítsa be, adjon hozzá táptalajt lyukanként 0,5 ml-re, majd 3 napos tenyésztés után adjon hozzá citarabint ( a végső koncentráció 10μmol/L), gátolják a nem neuronok növekedését.

1.4 Tirozin-hidroxiláz (TH) immuncitokémiai festés

A SABC-módszert alkalmazva az antitest-hígító 1g/100mL (Boster Company, Wuhan), 0,3% Triton-100 (Sigma, USA), NaN3 80mg/ szarvasmarha-szérumalbumint tartalmaz. 100 ml-t, PBS-sel 100 ml-re hígítva, állítsa be a pH-t 7,6-ra. A tenyésztést a 7. napon leállítottuk, háromszor 5 percig D-PBS-sel mostuk, a frissen készített 4%-os paraformaldehidet szobahőmérsékleten fixáltuk 30 percig, és háromszor mostuk D-PBS-sel 5 percig; 1:1:8 arányú hidrogén-peroxiddal, metanollal és PBS-oldattal Inkubáljuk 30 percig szobahőmérsékleten, öblítsük D-PBS-sel 5 percig, adjunk hozzá 5 százalékos blokkoló kecskeszérumot 30 percig szobahőmérsékleten, öblítsük D-PBS-sel 5 percig perc, és adjunk hozzá antitest hígítóval (1:1000 hígítás, Calbiochem) hígított kecske anti-egér TH antitestet, éjszakán át 4 fokon, öblítsük le D-PBS-sel 3 percig 3-szor, adjunk hozzá biotinilált egér anti-patkány IgG-t antitesttel hígítva. hígítószer (1:200 arányban hígítva, Sigma USA), szobahőmérsékleten hat órán át, öblítse D-PBS-sel 3 percig 3-szor, Adja hozzá az antitest-hígítóval hígított HRP komplexet 2 órán át szobahőmérsékleten, és öblítse le D-PBS-sel. 3 percig 3 percig. Öblítse le a DAB hígítót 3 percig, adja hozzá a használatra kész DAB kromogén reagenst (Wuhan Boster Company) a cellákhoz, és figyelje meg a színt fordított mikroszkóp alatt.https://www.xjcistanche.com/

1.5 Kábítószer-kezelés

A tenyésztett neuronok morfológiai megfigyeléseit fáziskontraszt mikroszkóp alatt naponta végeztük, és a változásokat fényképekkel rögzítettük. 12 órás tenyésztés után a sejteket fordított mikroszkóp alatt figyeltük meg, és a gyógyszereket közvetlenül az összefolyás előtt adtuk hozzá. Az egyes csoportok szérumtartalma 10 százalék volt. 3 napos tenyésztés után MPP pluszt adtunk hozzá 200 μmol/L végső koncentrációig. 37 fokos, 5 százalékos CO2-tartalmú inkubátorban 24 órán át végzett inkubálás után végezzen különféle vizsgálatokat.

Cistanche

1.6 Áramlási citometria kimutatása

A gyógyszeres kezelés ugyanaz volt, mint korábban. Az egyes csoportok kezelése után a tapadó PC12 sejteket 0,125% tripszinnel emésztettük, és a sejteket körülbelül 1 × 106 PBS-sel vettük fel. A sejteket kétszer mostuk, és 490 µl kötőpuffert adtunk hozzá, a sejteket alaposan összekevertük, és 5 µl annexin V-t adtunk hozzá. FITC és 10 μl oldott PI a sejtszuszpenzióban, óvatosan keverje össze, tegye a kémcsövet 4 fokra, inkubálja 10 percig sötétben, és tesztelje a COULTER EPICS áramlási citométerrel (Beckman Coulter, USA).

1.7 In situ end labeling (TUNEL) a sejt apoptózis kimutatására

A tenyésztett neuronok DNS in situ végén történő jelölése a Boster-féle apoptózis-detektáló készletet (MK1022) használja, és a lépések a következők: Vegye ki az egyes csoportok dopaminerg neuronsejtjeit az MPP plusz kezelés után (a tárgylemez az elsődleges tenyészet előtt). polimer lizin kezeléssel előtenyésztik), 4{{30}}g/l paraformaldehiddel 1 órán át, friss 3%-os ecetsavval (pH2,5) szobahőmérsékleten 10 percig fixálják, semlegesítik az alkalikus foszfatázt, adjunk hozzá 0,1 mol/L TBS-t (pH7,5) 1:200 arányban frissen hígított proteináz K emésztést 37 fokon 20 másodpercig, adjunk hozzá 1 µl TdT-t és DIG-d-UTP-t minden tárgylemezhez és 18 µL pufferoldatot 2 órán át 37 fokon; adjon hozzá 50 μL blokkoló oldatot minden tárgylemezhez, szobahőmérsékleten 30 percig; Adjon hozzá 50 μL blokkolóoldattal hígított biotinilált anti-digoxigenin antitestet; reagáljon 30 percig nedves dobozban 37 fokon; adjunk minden tárgylemezhez 50 µl SABC-AP-t 0,1 mol/l TBS-sel hígítva; BCIP/NBT-t (0,1 mol pH 9,5/l TBS 1:20 arányban hígítva) adtunk a mintához, hogy 30 percig színt fejlesszenek; ugyanakkor egy alternatív kontroll (TdT/biotin-dUTP keverék helyett TdT puffert használtunk) fotomikroszkópiához és invertált fázisú kontraszt mikroszkóphoz (200×) Figyeljük meg az apoptotikus sejteket. Számolja meg a pozitív sejteket fáziskontraszt mikroszkóp alatt, számoljon meg 5 mezőt mérőhelyenként minden csoportban, összesen 6 mérőhelyet.

2. Kísérleti eredmények

2.1 Tenyésztett neuronok morfológiai megfigyelése

OlympusIX70 fáziskontraszt mikroszkóppal megfigyelve: 5 órával az oltás után a sejtek nagy része a falhoz tapad, a sejtek szétszórtak, a sejttest kerek, a sejtmag láthatatlan, a törésmutatója erős. 24 órás tenyésztés után a sejtkiemelkedések növekedtek és fokozatosan megnyúltak. 48 óra elteltével a sejtek többsége elágazó fonalas nyúlványokkal nyúlt ki. A sejtmorfológia változatos volt, amely bipoláris, tripoláris és multipoláris volt, és fokozatosan ritka hálózatot alkotott. A sejttest megnagyobbodott, kerek és ellipszis alakú volt. Az MPP plusz sérülés után a sejtek először megduzzadtak, a törésmutató nőtt, a sejtek degeneratív állapotba kerültek, végül a sejtek összezsugorodtak és leestek. Az összetett kínai orvoslást tartalmazó szérum különböző dózisai védő hatással vannak az MPP-re és a sérülésekre. Miután a tenyészetet TH immunsejtekkel megfestettük, azt láttuk, hogy a TH-pozitív sejtek barnák, neurit kinövéssel. A hagyományos kínai orvoslás szérumának egyenértékű dózisának hozzáadása után a TH-pozitív arányaneuronokelérheti az 55 százalékot -60 százalék .

2.2 Az áramlási citometria vizsgálati eredményeinek elemzése (lásd 1. ábra)

Az apoptózis korai szakaszában a sejtmembránon belül található foszfatidilszerin (PS) a sejtmembránon kívülre vándorol. A foszfatidil-kötő protein V (Annexin V) egy kalciumfüggő foszfolipidkötő fehérje, amely nagy affinitással rendelkezik a PS-hez. Ezért az Annexin V szondaként használható a sejtmembrán felületén kitett PS kimutatására. Ugyanakkor a PI kizárási módszerrel kombinálva a duplafestésAz apoptotikus sejtek közül az apoptotikus sejtek áramlási citometriával kimutathatók. Az 1. ábra jobb alsó negyedében (FITC plusz /PI-) az egyes csoportok apoptózisának részletei láthatók. A sejtek aránya, az apoptózis aránya az egyes csoportokban 4,1 százalék, 5,8 százalék, 6,3 százalék, 28,6 százalék, 30,2 százalék volt.

2.3 A TUNEL festési eredmények elemzése

A kék-lila részecskék a sejtmagban pozitív sejtek, azaz apoptotikus sejtek. Az egyes csoportokban az apoptotikus sejtek arányát fénymikroszkóp alatt megszámoltuk. Az apoptotikus sejtek száma látómezőnként minden csoportban: A csoport 2,13±0,34; B csoport 4,92±0,67; C csoport 6,20±1,47; D csoport 10,33±1,51; E csoport 12,74±2,51. Utánt-teszt elemzés,a B és C csoportot összehasonlították az E csoporttal (P<0.05). the="">eredményekalapvetően összhangban vannak aáramlási citometria eredményei.

3. Megbeszélés

Parkinson kóra kínai orvoslásban a "remegés szindróma" kategóriájába tartozik. A hagyományos kínai orvoslás úgy véli, hogy a PD kialakulása többnyire a máj és a vese fokozatos kimerülésének sorozata az időseknél, valamint az agyvelő-meridián táplálkozásának elvesztése. A fő kezelés aztáplálja a májat és a vesét, megnyugtatja a májat és megszünteti a szelet. A hagyományos kínai orvoslás képes lehet arra, hogycsökkenti a toxicitást és növeli a hatékonyságot" kezelésébenParkinson-kór, de hatásmechanizmusa jelenleg nem egészen világos. A modern orvostudományban számos kísérleti bizonyíték utal arra, hogy az oxidatív stressz az egyik olyan tényező, amely a PD idegsejtek pusztulását okozza [3]. Tanulmányok kimutatták, hogy a cisztanche összes glikozidja hatékonyan képes eltávolítani a különféle reaktív oxigén szabad gyököket, és megvédi a DNS-t az OH által okozott oxidációtól[8]. A Cistanche kivonat tubulozid B mérsékelheti az általa kiváltott citotoxicitástMPP plusz,gyengíti a reaktív oxigénfajták felhalmozódását a sejtben, és antagonista hatást fejt ki az apoptózisra és az oxidatív stresszre.MPP plusz[9]. A hagyományos kínai orvoslás képes aktiválni és megerősíteni saját védő jelútját, ellenállni a külső károknak, és helyreállítani az egyensúlyt. Ez a hagyományos kínai orvoslás modernizációjának egyik célja. A dopaminpótló terápia után az emberek általában nagyra értékelik a neuroprotektív terápiát, amelyet a második forradalomnak neveznek a betegségek kezelésében.Parkinson kór. Ebben a kísérletben az izolált középagyi dopaminerg idegsejteket szérumtartalmú kínai gyógyszerekkel tenyésztették, és megállapították, hogy a Cistanche bizonyos neuroprotektív hatással rendelkezik. Ebben a kísérletben két kimutatási módszert, az áramlási citometriát és a TUNEL festést alkalmaztuk annak megállapítására, hogy a Cistanche gyógyszeres szérumtenyészet ekvivalens dózisú csoportos széruma és az ekvivalens dóziscsoport szérumának kétszerese csökkentheti az elsődlegesen tenyésztett középagyi dopamin ideget, amelyetMPP pluszAz apoptotikus sejtek száma bizonyos védelmi hatással bír az apoptotikus sejtekre. A hagyományos kínai orvoslás képes megvédeni a dopaminerg neuronokat a korai stádiumban lévő károsodástól, ami fontosabb intézkedés, mint más terápiák. Ebben az értelemben a kínai orvoslás holisztikus kezelése a kiváltó ok gyógymódja, és az egyik neuroprotektív kezelésnek tekinthető, amelyet jelenleg az emberek nagyra értékelnek.

Hivatkozások

1. Ziv I, Zilkha-Falb R, Offen D et al. A levodopa apoptózist indukál tenyésztett idegsejtekben – a nigrostriatális degeneráció lehetséges gyorsítója Parkinson-kórban? Mov Disord, 1997, 12(1):17

2. Jenner PG, Brin MF. Levodopa neurotoxicitás: kísérleti vizsgálatok a klinikai relevanciával szemben. Neurology, 1998, 50(6 Suppl 6): S39

3. Maruyama W, Naoi M. Sejthalál Parkinson-kórban. J. Neurol, 2002, 249 (2. melléklet): II6

4. Chen Jianzong, Jiang Wen, Shi Jian és társai. Klinikai megfigyelés a Parkinson-kór máj- és vesefunkcióval történő kezeléséről: 60 esetről szóló jelentés. Journal of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 1999, 22(3): 14

5. Chen Jianzong, Chen Xiaoli, Li Junchang stb. Klinikai megfigyelés 40 Parkinson-kór esetéről, amelyeket a máj és a vese táplálásának módszerével kezeltek. Research in Chinese Medicine, 1998, 14(3): 10

6. Chen Jianzong, Jiang Wen, Wu Baron és mások. Pingchan No. 1 orális folyadék 40 Parkinson-kór kezelésében. Journal of Anhui College of Traditional Chinese Medicine, 1999, 18(2): 9

7. Shimoda K, Sauve Y, Marini A és mtsai. Magas százalékos hozam tirozin-hidroxiláz-pozitív sejtekből patkány E14 mesencephalic sejttenyészetből. Brain Res, 1992, 586 (2): 319

8. Wang Xiaowen, Jiang Xiaoyan, Wu Liya Yiming és mások. A szabad gyökök in vitro megkötése és a cisztanche teljes glikozidjai által okozott OH·indukált DNS károsodás elleni védekezés. Chinese Pharmaceutical Journal, 2001, 36(1): 29

9. Sheng G, Pu X, Lei L, et al. A Cistanche salsából származó tubulozid B Megmenti a PC12 idegsejteket a 1-metil-4-fenilpiridinium-ion által kiváltott apoptózistól és oxidatív.Stress.Planta Med, 2002, 68(11):966