A patkányplazmában felszívódott komponensek elemzése a Cistanche kvázi ösztrogén frakciójának orális beadása után

A patkányplazmában felszívódott komponensek elemzése a Cistanche kvázi ösztrogén frakciójának orális beadása után

További információ: Ali.ma@wecistanche.com

Kattintson ide az előnyök és mellékhatások megtekintéséhez

Absztrakt:

A patkányplazma összetevőinek elemzése és azonosítása az aktív frakció orális beadása utáncistanche, a patkányplazmában lévő komponenseket nagy teljesítményű folyadékkromatográfia-elektrospray ionizációs-kvadrupólus-repülési tömegspektrometriával (HPLC-Q-TOF MS) mutattuk ki. A komponensek szerkezetét a retenciós idejük és MS/MS-spektrumuk összehasonlítása a referenciavegyületekével és az irodalomban közölt adatokkal történt. 13 kémiai összetételt azonosítottak, köztük 6 prototípus komponenst, mint például genipozidsav, szalidrozid,Cisztanozid A, Echinacoside, Acteoside, Cistanoside D,7 metabolit komponensek, például 3,4-Dihidroxi-fenil-etanol-glikozidok, metilációs akteozid, acetilezés Cisztanozid G,3,4-Dihidroxi-fenil-etanol, acetil-tubulozid B, Cisztanozid B-glükuronid-metabolit}},4{5 Dihidroxi-fenil-etanol. Az eredmények alapvető adatokkal szolgálhatnak a kvázi ösztrogén szabályozási tevékenység terápiás alapjainak megvilágításáhozcistanche．

Kulcsszavak:

cistanche; szérum tartalmú gyógyszer; kvázi ösztrogén; nagy teljesítményű folyadékkromatográfia-elektrospray ionizáció-kvadrupól-repülési idő-tömegspektrometria (HPLC-Q-TOFMS)

Cistanche deserticolaa sivatagi fák (például haloxilon ammodendron, tamarix stb.) gyökerében élősködő növény. Egyfajta tápláló és erős, értékes kínai hagyományos orvoslásként számos farmakológiai hatást fejt ki, például táplálja a vese Yang-ot, szabályozza az immunitást, késlelteti az öregedést, védi a sugárzást és védi a központi idegrendszert. "sivatagi ginzeng" néven ismert. Jelenleg a legtöbb tanulmány a c. deserticola itthon és külföldön a farmakológiai aktivitás értékelésére korlátozódik, míg farmakodinámiás anyagainak alapjai nem tisztázottak, ami súlyosan hátráltatja a gyógyszer ésszerű fejlesztését és alkalmazását.Cistanche deserticola.

A Hagyományos Kínai Orvoslás összetevői összetettek és sokrétűek, és csak megfelelő adagolás után, a szervezetben történő felszívódáson és metabolizmuson keresztül juthatnak be a komponensek a vérbe, hogy a hagyományos kínai orvoslás farmakodinámiás anyagalapját képezzék. Ezek a hatóanyagok lehetnek a HAGYOMÁNYOS kínai orvoslás prototípusai vagy metabolitjai, vagy a hagyományos kínai gyógyászatban a különböző komponensek kölcsönös reakciójával létrejövő új összetevők, vagy a gyógyszerek közvetlen hatására előállított endogén fiziológiás hatóanyagok. a testen. Ezért ezek a vérkomponensek képviselhetik a hagyományos kínai orvoslás és az összetett gyógyászat farmakodinámiás anyagbázisát. Az orális adagolást követően vérbe kerülő komponensek, metabolitok elemzése, a komponensek kölcsönhatási szabályainak felkutatása biztos alapot jelenthet a farmakodinámiás anyagok alapkutatásához.

A cistanche deserticola ösztrogénszerű aktív részeinek és dózisának szűrésére egerek méh tömegnövelő módszerét és MTT kolorimetriát alkalmaztunk. Az előzetes kísérleti eredmények azt mutatták, hogy az éretlen egerek méh koefficiense szignifikánsan megnőtt, ha a citanche deserticola etanolos (95 százalékos) kivonatát naponta 30 g/kg/kg dózisban adtuk gyomorba, és a gyógyszertartalmú szérum elősegítette a proliferációt. szignifikánsan (P < 0,01),="" ami="" a="" cistanche="" deserticola="" ösztrogénszerű="" hatásának="" aktív="" része="">

Ebben a vizsgálatban nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás kvadrupólus repülési idő tömegspektrometriát (HPLC-Q-TOF MS) alkalmaztak a vérkomponensek, prototípus komponensek és a cisztanche aktív részeinek metabolitjainak elemzésére és azonosítására a gyógyszer beadása után. cistanche ösztrogénnel, valamint az anyagcsere-útvonal spekulációja, hogy alapot nyújtson a cistanche ösztrogénnel történő farmakodinámiás anyagainak alapkutatásához.

1 Kísérleti rész

1.1 Műszerek és reagensek

Waters-600 Folyadékkromatográf: Waters Co., LTD., négyelemes gradiens-szivattyúval, automatikus mintavevővel, vákuum-gáztalanító géppel, oszlophőmérséklet-dobozsal, DAD-detektorral, Empower vegyi munkaállomással;

Agilent{0}} sorozatú Q-TOF LC-MS tömegspektrométer: amerikai Agilent cég termékei;

Xw-80örvénykeverő: Shanghai Yugong Machinery Co., LTD.

Dk-80 Elektromos termosztatikus vízfürdő: Shanghai Yiheng Technology Co., LTD.

Alc-110. 4 Analitikai mérleg: Shanghai Renhe Scientific Instrument Co., LTD.

H66MC ultrahangos oszcillátor: Ohaus Technology Co., LTD.

Cistanche deserticola: a San Ke Shu gyógynövénypiacról vásárolta, amelyet Zhang Delian professzor, a Harbini Kereskedelmi Egyetemről Cistanche deserticola néven azonosított;

Mullein (Tételszám: 111530-200505), echinozid (gyártási szám: 111670-200503), szalidrozid (gyártási szám: 110736-200628): mindegyiket a Kínai Gyógyszerészeti és Biológiai Termékek Ellenőrzési Nemzeti Intézete biztosítja ;

Etilén stilbesztrol: Guangzhou Hampden Pharmaceutical Co., LTD. Metanol és acetonitril: HPLC minőségű, a Shandong Yuwang Reagent Co., LTD termékei. A többi reagens analitikai tisztaságú volt.

Kísérleti víz: tiszta víz.

Nőstény Wistar patkányok: Tételszám: SCXK-(JI) 2003 -- 2004, tömeg (220 ± 20) g, a Changchun National Biological Industry Base kísérleti állatközpontja biztosította.

1.2 Intragasztrikus gyógyszeroldat készítése

A citanche deserticola nyers port 95 százalékos etanollal visszafolyató hűtő alatt történő extrakcióval extraháltuk, majd 8-szor 150 percig, 6-szor 75 percig és 6-szor 75 percig extraháltuk. Ezután a három kivonatot egyesítettük és nyomás alatt kondenzáltuk, hogy megkapjuk a kivonatot, amelyet hűtőszekrényben tároltunk későbbi felhasználásra. Használat előtt desztillált vízzel 1,5 g/ml koncentrációjú intragasztrikus oldatot készítettek.

1.3. Összehasonlító oldat elkészítése

Pontos mennyiségű ökörfarkkóróból, szalidrozidból és echinakozidból vettünk fel, és teljesen feloldottuk metanolban, hogy 1 ml vegyes kontrasztoldatot készítsünk, amelyek mindegyike 0,2 mg három referenciaanyagot tartalmazott. Helyezze át a referenciaanyag-oldatot egy 0,45 μm-es szűrőmembránon, és tegye félre.

1.4 Gyógyszeres szérum és vakszérum készítése

Gyógyszer tartalmú szérum elkészítése: mérjük le a nőstény Wistar patkányokat, adjunk nekik napi 1 ml/100 g-ot, adjunk nekik desztillált vizet és szondaoldatot kétszer reggel és este, 3 egymást követő napon, 60 perccel az utolsó adag után. érzésteleníteni 2 ml/kg 10%-os klorálhidráttal intraperitoneális injekcióval. Vért vettünk a máj portális vénájából, és a teljes koaguláció után 10 percig centrifugáltuk 3 000 fordulat/perc sebességgel. A felülúszó ezután gyógyszertartalmú szérum volt.

Vakszérum készítése: a patkányokat minden nap azonos térfogatú desztillált vízzel intragasztrikusan kezeltük, és a többi elkészítési módszer megegyezett a gyógyszertartalmú szérummal.

ML gyógyszertartalmú szérumot vettünk, 5-szörös metanolt adtunk hozzá, és a centrifugacsőben 1 0 percig vortexeltük. A centrifugálást 14 000 r/perc sebességgel végeztük 10 percig, majd a felülúszót abszorbeáltuk, és az oldószert megszárítottuk. Mikropipettával 0,5 ml metanolt adunk hozzá, hogy a maradékot feloldjuk. A maradékot 0,22 μm-es mikroporózus membránon szűrtük, és kromatográfiával analizáltuk.

1.5 Kísérleti feltételek

Kromatográfiás körülmények: Waters Symmetry ShieldTM RP18 oszlop (4,6 mm × 250 mm × 5 μm); Előoszlop: Nova - PakC18 Guard - PakTM; Áramlási sebesség: 0,5 ml/perc; Befecskendezési térfogat: 10 μL; Mozgófázis: acetonitril-0,2%-os hangyasav vizes oldata; Gradiens feltételek: 0-35 perc, 5 százalék -34 százalék acetonitril, 35-65 perc, 24 százalék -26 százalék acetonitril; Oszlop hőmérséklet: 30 fok ; Érzékelési hullámhossz: 254 nm.

Tömegspektrometriás feltételes ionforrás: Atmoszférikus nyomású elektrospray ionizációs (ESI) forrás; Áramlási sebesség: {{0}},5 ml/perc; Porlasztógáz nyomása: 0,2 MPa; Száraz gáz áramlási sebessége:8. 0 L/perc; Száraz hőmérséklet: 30 fok; Kapilláris feszültség: 3,5 kV; Köpenygáz áramlási sebessége: 12,0 l/perc; A hüvely hőmérséklete: 400 fok. A pozitív és negatív ionos letapogatási mód van kiválasztva, és a tömeges letapogatási tartomány m/z 100 ~ 3 000.

2 Eredmények és megbeszélés

2.1 A Cistanche deserticola ösztrogén aktív részeinek szérumában lévő kémiai összetevők HPLC-ESI-Q-TOF MS/MS elemzése

A Cistanche deserticola ösztrogén-aktív részében patkányokból származó gyógyszertartalmú szérumminták kvalitatív elemzését ESI-MS detektorral végeztük. A szkenneléshez pozitív ionos, illetve negatív ionos módot használtunk, az eredményeket az 1. ábra mutatja. Az 1. ábrán látható két pásztázási mód első szintű tömegspektrometriás összion-folyamdiagramjainak összehasonlításával azt találtuk, hogy a teljes ion A negatív ion módban kapott áramlás erős karakterisztikával és nagy érzékenységgel rendelkezett, ezért ebben a kísérletben a negatív ion módú pásztázást választottam.

Negatív ion módban esI-MS detektort használtunk a patkányszérum kvalitatív elemzésére a Cistanche deserticola ösztrogén aktív részének beadása után. A vakszérum és a beadott szérum első szintű pásztázó teljes ionáramlási diagramjának összehasonlító elemzésével összesen 13 molekulaion csúcsot jelöltek meg, amint az a 2. ábrán látható. A 2., 3., 5., 7., 9. és 10. csúcsok prototípus komponensek lehetnek, és az 1., 4., 6., 8., 11., 12. és 13. csúcsokat metabolikus komponenseknek feltételezték.

Az egyes kromatográfiás csúcsok negatív ion módban detektált molekula ioncsúcsai és a megfelelő karakterisztikus fragmens által adott relatív molekulatömeg alapján összesen 13 ms-os csúcsok jelölhetők meg. 13 csúcs kémiai összetevőit az egyes standard anyagok UV-MS információinak összehasonlításával és az irodalomban közölt komponensekre való hivatkozással azonosítottuk, amelyeket az 1. táblázatban soroltunk fel.

A hat prototípus komponens a genipozid, a salidrosid, a Cistanche-glikozid a, az echinacea-glikozid, a Mullein-glikozid és a Cistanche-glikozid D volt;

Hét metabolikus komponens: 3,4-dihidroxi-fenil-etanol-glikozid, metilezett Mullein-glikozid, acetilezett Cistanche-glikozid g, 3,4-dihidroxi-fenil-etanol, acetil-tubulozid B, Cisztanche-glikozid B-glükuronsav-metabolit és 4}},4-dihidroxi-fenil-etanol. A hét metabolit közül a feltételezések szerint az 1-es csúcs (3,4-dihidroxi-fenil-etanol), a 8-as (3,4-dihidroxi-fenil-etanol) és a 13-as csúcs (metilált 3,4-dihidroxi-fenil-etanol-glikozid) a fenil-etanol-glikozidok hidrolitikus fragmensei a Cistanche deserticolában; A 4. csúcs (metilált Mullein-glikozid) a Mullein-glikozid metabolitja; A 6. csúcs (acetilezett Cistanche-glikozid g) a Cistanche-glikozid G metabolitja; A 11. csúcs (acetil-guanozin b) a guanozin B metabolitja; A 12-es csúcs (a Cistanche glikozid b glükonsav metabolitja) a Cistanche glikozid B metabolitja.

A kínai karakterek magyarázata:

A 质谱信息 tömegspektrum információt jelent.

A 相对分子质量 a relatív molekulatömeget képviseli

A 化合物推测结果 összetett spekulációs eredményeket jelent

A 代谢 az anyagcsere-összetevőket jelenti

A 原型 prototípus komponenseket jelöl

2.2 Vita

Ebben a kísérletben hplc-q-tof MS-t használtunk 13 fő kromatográfiás csúcs azonosítására a szérumban a Cistanche deserticola ösztrogénszerű aktív részének beadása után. Ezek a Cistanche deserticola in vivo közvetlen hatású anyagai lehetnek. Ugyanakkor azt is tükrözi, hogy a hagyományos kínai orvoslás hatékonysága többkomponensű koordináció, komplementaritás vagy korlátozás eredménye. A vérben lévő 13 átmeneti komponens elemzésével bebizonyosodott, hogy a fenil-etanol-glikozidok a Cistanche deserticola fő hatóanyagai. Az utóvizsgálat során a megfelelő spektrumhatás összefüggést a gyógyszerhatás korrelációjának tanulmányozására hozzuk létre, hogy tovább tisztázzuk a gyógyszerhatás anyagi alapját, és megállapítsuk a többkomponensű dózis, idő és hatás összefüggését különböző időpontokban. pontok a szervezetben, hogy felfedjék a Cistanche deserticola anyagcsereútját és anyagcsere-módját.

3 Következtetések

Ebben a kísérletben a hplc-esi-q-tof MS/MS technológiát alkalmazták az ösztrogén vérkomponenseinek elemzésére, mint a Cistanche deserticola aktív részei, és 13 kémiai komponenst azonosítottak, ami nagy jelentőséggel bír a farmakodinámiás anyagi alap tisztázásában. a Cistanche deserticola ösztrogénszerű aktív komponenseinek összetételét, és megbízható alapot nyújthat a Cistanche deserticola további kutatásához és klinikai gyógyszeres kezeléséhez.