Absztrakt

A jelen találmány aCistanche kivonat a csont ásványi sűrűségének (BMD) javítására. A kivonatban aechinakozid és akteozid (verbaszkozid) teljes tartalmavan>25 tömeg%. A kivonatot végrehajtásával készítjükdesztillált vizes extrakcióanyers porCistanche tubulosa, utánaszűrés, centrifugálása szűrletből,koncentráció, folyadék-folyadék extrakció, koncentráció szennyeződés eltávolítással, hígítás, utókezelés, majdvégső koncentrálás és szárításhogy megkapjuk a Cistanche kivonatot.

 

 

Cistanche kivonat folyamata

A csont ásványianyag-sűrűségének javítására szolgáló találmány szerinti Cistanche kivonatban aechinakozid és akteozid teljes tartalmavan25-30 tömeg%(25 tömeg% kivételével), és a kivonat is gazdagsikiminsavvalamintfenilpropionsav típusú komponensekésalkaloid típusú komponensek, lehetővé téve aztstabilan fejtik ki a csontsűrűség-javító hatást.

 

Követelések

1. Elkészítési módszer

1. Eljárás Cistanche kivonat előállítására a csont ásványi sűrűségének javítására, azzal jellemezve, hogy a következő lépéseket tartalmazza:

zúzóCistanche tubulosanyerspor előállításáhozCistanche tubulosa;

desztillált víz hozzáadása a nyers porhozCistanche tubulosaextrakcióhoz, szűréshez, a szűrlet centrifugálásához és koncentráláshoz, így tömény oldatot kapunkCistanche tubulosa;

tömény oldatának extrahálásaCistanche tubulosaaz alsó extrakciós fázis betöményítése a szennyeződések eltávolítására, és hígítás, hogy töltőoldatot kapjunk;

a töltőoldat utókezelését, majd betöményítést és szárítást, hogy megkapjuk a Cistanche-kivonatot.

2. Az anyag és a víz aránya

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a nyers por tömeg/térfogat arányaCistanche tubulosadesztillált vízhez az1 : (15–25).

3. Extrakciós hőmérséklet

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a desztillált vizes extrakciós hőmérséklet a következő60-100 fok.

4. Folyadék-folyadék extrakciós arány

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a koncentrált oldat extrakciója során a tömény oldat térfogatarányaCistanche tubulosaaz extrakciós oldószerhez1 : (1–5).

5. Extrakciós oldószer

5. A 4. igénypont szerinti eljárás, ahol az extrakciós oldószer legalább az egyiket tartalmazzapetroléter, etil-acetát, n-hexán vagy ciklohexán.

6. Utókezelési folyamat

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a töltőoldat utókezelése a következőket tartalmazza: a töltőoldat átvezetésemakropórusos gyanta, majd szekvenciálisan eluálva ezzeldesztillált vízés egyetanolos oldat.

7. Elúciós térfogatok

7. A 6. igénypont szerinti eljárás, ahol a desztillált víz és a makropórusos gyanta térfogataránya(5–10) : 1, és az etanolos oldat és a makroporózus gyanta térfogataránya az(3–9) : 1.

8. A kivonat

8. Cistanche kivonat csont ásványi sűrűségének javítására, azzal jellemezve, hogy az 1-7. igénypontok bármelyike ​​szerint van előállítva.

9. Aktív marker tartalom

9. A 8. igénypont szerinti Cistanche kivonat, ahol az echinakozid és az akteozid teljes tartalma25-30 tömeg%, 25 tömegszázalék nélkül.

10. Jelentkezés

10. A 8-9. igénypontok bármelyike ​​szerinti Cistanche kivonat alkalmazása csont ásványi sűrűségének javítására szolgáló termék előállítására, ahol a termékben a Cistanche kivonat koncentrációja12,5-25 ug/ml.

 

Műszaki terület

A jelen találmány a következő területre vonatkozikgyógyászati ​​készítmények, és kifejezetten aCistanche kivonat a csont ásványianyag-sűrűségének javítására, annakelkészítési mód, ésalkalmazások.

Háttér

A Cistanche az Orobanchaceae növények szárított, húsos szárát jelenti pikkelylevelekkel.Cistanche deserticola YC MavagyCistanche tubulosa (Schenk) Wight. Cistanche számos tevékenységet folytat, mint plimmunszabályozás, gyulladáscsökkentő, fáradtság elleni, antioxidáns, neuroprotektív, ésa reproduktív rendszer támogatása.

Fenil-etanol-glikozidok (PhG-k)-valechinakozidésakteozid (verbaszkozid)lévén a fő PhG-k Cistanche-ban, fontos összetevők.Echinakozidkimutatták, hogy hatással vana csont ásványianyag-sűrűségének javítása. Azt tapasztaltuk azonban, hogy a Cistanche kivonatok csontsűrűséget javító hatása aznem kizárólag az echinakozid-tartalommal korrelál. Egyszerűen szabályozható az echinakozid tartalomnem tudja biztosítanihogy a kivonat leszstabilancsontsűrűség-javító hatást fejt ki. Ezért kulcsfontosságú egy Cistanche kivonat és egy olyan elkészítési módszer kifejlesztése, amely képesstabilanbiztosítja a kívánt csontsűrűség-támogató hatást.

Kínai találmányi szabadalmi bejelentésCN102441040Aeljárást ismertet a Cistanche-ból származó összes fenil-etanoid-glikozid előállítására porítással, extrakcióval, makropórusos gyanta adszorpcióval, elúcióval, koncentrálással stb. Gyengén savas körülmények között (pH 2-4) a Cistanche-fenil-etanol-glikozidok stabilitása jelentősen javul, és a kapott összes aktekinozid 9% kombinált glikozidot tartalmaz. Azonban nem ellenőrzi, hogy a termék képes-estabilanjavítja a csont ásványianyag-sűrűségét.

Kínai találmányi szabadalmi bejelentésCN105111255Aeljárást ismertet echinakozid és akteozid Cistanche-ból való extrahálására és elválasztására, extrakciós oldószerként 75% etanolt, töltőanyagként AB-8 makropórusos gyantát és 55% etanolos eluálást alkalmazva, így Cistanche-kivonatot kapunk, amelynek echinakozidja > 25%, 10%, összesen 0% acteozid >8%. Előfordulhat azonban, hogy még mindig nem garantálja astabilcsontsűrűség-javító hatása.

 

A találmány összefoglalása

Olyan Cistanche kivonat és elõállítási eljárás kidolgozása, amely képesstabilantámogatja a csont ásványianyag-sűrűségének javítását, a találmány a következőket nyújtja:

Első szempont: Elkészítési módszer

1. Eljárás Cistanche kivonat előállítására a csont ásványi sűrűségének javítására, amely a következőket tartalmazza:

zúzóCistanche tubulosanyers por előállítása;

a nyers port desztillált vízzel extraháljuk, szűrjük, centrifugáljuk és koncentráljuk, hogy tömény oldatot kapjunk;

extrakció végrehajtása; az alsó fázis koncentrálása a szennyeződések eltávolítására; hígítás, hogy töltőoldatot kapjunk;

a betöltő oldat utókezelése, koncentrálás és szárítás, hogy megkapjuk a Cistanche kivonatot.

Az egyik kiviteli alakban a nyers port a40 hálósszita.

Az egyik kiviteli alakban a nyerspor tömeg/térfogat aránya a desztillált vízhez viszonyítva1 : (15–25).

Az egyik kiviteli alakban a tömeg/térfogat arány a következő1 : 20.

Az egyik kiviteli alakban az extrakciós hőmérséklet a következő60-100 fok.

Az egyik kiviteli alakban az extrakciós hőmérséklet a következő80 fok.

Az egyik kiviteli alakban az extrakciót hajtjuk végre1-2 alkalommal, 1 óra minden alkalommal.

Az egyik kiviteli alakban a szűrést egy80 meshszűrő.

Az egyik kiviteli alakban a centrifugálási sebesség az3000-4000 ford/percés az idő az3-9 perc.

Az egyik megvalósítási módban a centrifugálási sebesség az3500 ford/percés az idő az5 min.

Az egyik megvalósítási mód szerint centrifugálás után a szűrletet 1 °C hőmérsékleten koncentráljuk70 fokhogy18%–28%a kezdeti kötetből.

Az egyik kiviteli alakban a tömény oldat extrakciója során a koncentrált oldat és az extrakciós oldószer térfogataránya1 : (1–5).

Az egyik kiviteli alakban az arány a következő1 : 3.

Az egyik kiviteli alakban az extrakciós oldószer legalább egyet tartalmazpetroléter, etil-acetát, n-hexán vagy ciklohexán.

Az egyik kiviteli alakban az extrakciót szekvenciálisan hajtjuk végre a felhasználássalpetroléterkövetietil-acetát.

Az egyik kiviteli alakban a "koncentráció szennyeződés eltávolítással" azt jelenti, hogy az alsó extrakciós fázist pasztává koncentrálják, majd feloldják300 ml 50 tömeg%-os vizes etanolta szennyeződések eltávolítására és a hozzáigazításra1,0-1,5 g nyers gyógynövény ml-enkéntmint a rakodási megoldás.

Az egyik kiviteli alakban a töltőoldat koncentrációja a következő1,0-1,5 g nyers gyógynövény/ml víz.

Az egyik kiviteli alakban az utókezelés magában foglalja a betöltő oldat átvezetésétmakropórusos gyanta, majd szekvenciálisan eluálva ezzeldesztillált vízés egyetanolos oldat.

Az egyik kiviteli alakban a makropórusos gyantán keresztüli töltési áramlási sebesség a következő1-5 ml/perc.

Az egyik kiviteli alakban a gyanta azAB-8 makropórusos gyantagyanta térfogattal0.93 L.

Az egyik kiviteli alakban a desztillált víz és a gyanta térfogataránya a következő(5–10) : 1, és az etanolos oldat és a gyanta térfogataránya az(3–9) : 1.

Az egyik kiviteli alakban a desztillált víz és a gyanta térfogataránya a következő7 : 1, az etanolos oldat és a gyanta aránya pedig az6 : 1.

Az egyik megvalósítási mód szerint az etanolos oldat az80 tömeg%-os vizes etanol.

Második szempont: A kivonat

A találmány tárgyát képezi továbbá a fenti eljárással előállított Cistanche-kivonat.

Az egyik megvalósítási mód szerint az echinakozid és az akteozid teljes tartalma25-30 tömeg%25 tömeg% kivételével.

Harmadik szempont: Használat

A találmány tárgyát képezi továbbá a Cistanche kivonat alkalmazása csont ásványianyag-sûrûségének javítására szolgáló termékek elõállítására, ahol az extraktum koncentrációja a termékben12,5-25 ug/ml.

 

Előnyök / jótékony hatások

A technika állásához képest a találmánynak a következő jótékony hatásai vannak:

A Cistanche kivonat tartalmaz25-30 tömeg%teljes echinakozid és akteozid, és gazdagsikiminsav, fenilpropionsav típusú komponensek, alkaloidok, észsírsavak, lehetővé téve aztstabilantámogatja a csont ásványianyag-sűrűségének javítását.

Azon belül12,5-25 ug/mlkoncentráció tartományban, a kivonat elősegíti a proliferációtMC3T3-E1kiváló proliferatív hatással rendelkező sejtek.

A kivonat ugyanazt a dózisfüggő tendenciát mutatja a sejtproliferáció elősegítésében ésALP aktivitás, és stabilan elősegítheti a proliferációt és a differenciálódást. Az osteoblast mineralizáció elősegítésében jobb hatást mutat, mint a pozitív kontroll17 -ösztradiol.

A kivonat stimulálja az oszteoblaszt-specifikus transzkripciós faktorokatRunx2ésOsx, fokozza az oszteoblasztok differenciálódását és elősegíti az osteogén markerek expressziójátOPNésOCN, ezáltal elősegíti a csontképződést. Az is növekszikBmp2 mRNSexpressziója fokozza az oszteoblasztok differenciálódását és az új csontképződést azáltal, hogy aktiválja aBMP/Smad útvonal; továbbá szabályozásávalLrp5 mRNS, Lrp6 mRNS, ésWnt3 mRNS, aktiválódikWnt/ -catenin jelzés, befolyásolja a downstream transzkripciós faktor expresszióját, és elősegíti az oszteoblasztok differenciálódását és a csontképződést.

Az előállítási módszerrel feniletanoid-glikozidokat (echinakozidot és akteozidot), sikiminsavat és fenil-propionsavat, alkaloidokat és zsírsavakat tartalmazó kivonatot kapunk. Ezek az összetevők együttesen lehetővé teszik, hogy a kivonat következetes dózisfüggőséget mutasson a proliferáció, a differenciálódás és a mineralizáció terén, ami lehetővé teszi a stabil csontsűrűség-támogató hatást.

 

A rajzok rövid leírása

. 1. ábra: A kivonat (1. példa) hatása az MC3T3-E1 sejtproliferációra
. 2 ábra: A kivonat (2. példa) hatása az MC3T3-E1 sejtproliferációra
. 3 ábra: A kivonat (3. példa) hatása az MC3T3-E1 sejtproliferációra
. 4 ábra: A kivonat (1. példa) hatása az ALP aktivitásra
. 5 ábra: A kivonat (2. példa) hatása az ALP aktivitásra
. 6 ábra: A kivonat (3. példa) hatása az ALP aktivitásra
. 7. ábra: Fényképek az oszteoblasztok mineralizációjának alizarinvörös festéséről (2. példa)
. 8 ábra: Az oszteoblasztok mineralizációjának kvantitatív eredményei (2. példa)
. 9–12. ábra: A 2. példa hatása a Runx2, Osx, Opn, Ocn mRNS expressziójára
. 13 ábra: A 2. példa hatása a Bmp2 mRNS expressziójára (BMP/Smad)
. 14–16. ábra: A 2. példa hatása az Lrp5, Wnt3 , Lrp6 mRNS expressziójára (Wnt/ -catenin)
. 17–18. ábra: A 2. példa hatása az Osx és a RUNX2 fehérje expressziójára

 

Részletes leírás / Megvalósítások

1. példa

Egy előállítási eljárás a következőket tartalmazza:

zúzóCistanche tubulosa40 mesh-es szitán átpasszírozva megkapjuk200 gnyers por;

kivonattal5× tömegű desztillált víz(leírás szerint), kivonás at75 fokszámára2 alkalommal, 1 óra mindegyik, koncentrálva a70 fokkoncentrációarányhoz1 : 2.2koncentrált oldat előállítására;

abszolút etanol hozzáadása a koncentrált oldathoz a fokozatos etanolos kicsapáshoz, a végső etanol tömegkoncentrációval20%, 40%, 60%, 80%, csapadék at5 fok 24 órán keresztül, a felülúszó összegyűjtése után80 tömeg%etanolos kicsapás;

koncentrálás és szárítás at70 foka Cistanche-kivonat előállításához, hozammal20.75%.

2. példa

Egy előállítási eljárás a következőket tartalmazza:

zúzóCistanche tubulosamegszerezni240 gnyers por;

desztillált vízzel extraháljuk, szűrjük, centrifugáljuk és koncentráljuk, hogy tömény oldatot kapjunk;

a tömény oldatot extraháljuk; az alsó fázis koncentrálása a szennyeződések eltávolítására; hígítás, hogy töltőoldatot kapjunk;

a töltőoldat utókezelése; koncentrálás és szárítás at70 foka kivonat előállításához, hozammal19.69%.

A nyers port egy 40 mesh-es szitán megy át.
A nyerspor tömeg/térfogat aránya a desztillált vízhez viszonyítva:1 : 20.
Az extrakciós hőmérséklet a következő:80 fok.
Extrakciót hajtunk végre1-2 alkalommal, 1 óra mindegyik.
A szűrés egy80 meshszűrő.
A centrifugálás az3500 ford./perc 5 percig.
Töményítés centrifugálás után: töményítés at70 fokhogy20%a kezdeti térfogatból.
Az extrakció során a tömény oldat és az oldószer térfogataránya a következő1 : 3.
Az extrakciót egymás után hajtjuk végrepetroléterésetil-acetát.
Az alsó fázist pasztává töményítjük és feloldjuk benne300 ml 50 tömeg%-os vizes etanoltszennyeződések eltávolítására.
Töltőoldat koncentrációja:1,0 g nyers gyógynövény/ml víz.
Utókezelés: makropórusos gyantán engedjük át, desztillált vízzel, majd etanolos oldattal eluáljuk.
Átfolyási sebesség a gyantán keresztül:3 ml/perc.
Gyanta:AB-8, gyanta térfogata0.93 L.
Desztillált víz/gyanta térfogatarány:7 : 1. Etanol-oldat-gyanta arány:6 : 1.
Etanolos oldat:80% (w/w)vizes etanol.

 

Kattintson a további részletekért a tartálygyárról

3. példa

Egy előállítási eljárás a következőket tartalmazza:

zúzóCistanche tubulosa40 mesh-es szitán átpasszírozva megkapjuk120 gnyers por;

kivonattal12× tömega50 tömeg%-os vizes etanol, kivonás at70 fok, 2 alkalommal, 1 óra mindegyik, koncentrálva a70 fokarányához1 : 2.5koncentrált oldat előállítására;

víz hozzáadása a koncentráció beállításához0,2 g nyers gyógynövény/ml víz, centrifugálás at3500 ford./perc 5 percig, a felülúszót töltőoldatként véve;

áthalad a makropórusos gyantán; egymást követő eluálás desztillált vízzel és etanolos oldattal; az etanolos elúciót összegyűjtjük és betöményítjük/szárítjuk70 foka kivonat hozamának eléréséhez24.30%.

Gyanta:HPD750, gyanta térfogata0.93 L.
Desztillált víz/gyanta arány:3 : 1. Etanol-oldat-gyanta arány:4 : 1.
Etanolos oldat:30% (w/w)vizes etanol.

 

Teljesítményteszt

1.1 Sejtburjánzási vizsgálat

Az oszteoblasztok a csontképzõdésért felelõs fõ funkcionális sejtek, amelyek magukban foglalják a pre-oszteoblasztok proliferációját, a csontmátrix termelését és a végsõ differenciálódást. AMC3T3-E1sejtvonalat gyakran használják az oszteogén aktivitás tanulmányozására. Az oszteoblasztok differenciálódása magában foglalja a proliferációt, a differenciálódást és a mineralizációt, amely megnövekedett pre-osteoblastok számában, oszteoblasztokká való érésében és új csontmátrix képződésében nyilvánul meg.

Alkáli foszfatáz (ALP)egy oszteoblaszt fenotípussal kapcsolatos fehérje, amely kimutatható a sejtproliferáció és a mátrix érése során, és az oszteoblasztok differenciálódásának általánosan használt korai markere.

Ezért az MC3T3-E1 proliferáció és az ALP aktivitás értékelésével összehasonlítottuk az 1-3. példákban előállított kivonatok oszteogenezist elősegítő aktivitását.

Az MC3T3-E1 sejteket újraélesztettük és passzáltuk. Stabilizálás után a sejteket emésztettük, centrifugáltuk és összegyűjtöttük. A sejtsűrűséget úgy állítottuk be, hogy minden 100 μl 5 × 1035 × 10 ^ 35 × 103 sejtet tartalmazzon, és egy 96 lyukú lemezre oltottuk. Egy éjszakán át tartó tenyésztést követően a táptalajt teljes tápközeggel helyettesítettük, amely az 1-3. példa szerinti kivonatokat tartalmazza koncentrációban6,25, 12,5, 25 és 50 ug/ml, vagy tartalmazó0,1 M ösztradiol(pozitív kontroll), vagy önmagában a tápközeg (vak kontroll), és tenyésztjük48 h. Fénytől védett körülmények között MTT törzsoldatot (a lyuk térfogatának 10-20%-a) adtunk hozzá, és inkubáltuk.4 hCO₂ inkubátorban, a táptalajt eltávolítjuk, és200 μl DMSOhozzáadva a formazán feloldásához. Az OD értékeket a490 nm.

Eredmények: Fig. 1 (1. példa), Fig. 2 (2. példa), Fig. 3 (3. példa).

[0058] Sejtburjánzási arány (%)=OD(Példa 1-3)-OD(Üres)OD(Üres)×100%\\frac{OD(\\text{Példa 1-3}) - OD(\\text{Blank})}{OD(\\text{Blank})} \\times OD10 1–3) − OD (üres) × 100%

Amint az a . 1–3. ábrán látható, a pozitív kontroll elősegítette az MC3T3-E1 proliferációját. Az 1. példa elősegítette a proliferációt 6,25, 12,5 és 25 ug/ml-nél; a proliferációs ráta 12,5 ug/ml-nél 1,4-szerese volt a pozitív kontrollénak, de szignifikáns különbség nélkül (P > 0,05). A 2. példa elősegítette a proliferációt 6,25, 12,5, 25 és 50 ug/ml-nél; 12,5, 25 és 50 ug/ml-nél a hatása jobb volt, mint a pozitív kontrollé (P < 0,01 vagy P < 0,001), a proliferációs ráta 2,55×, 3,46× és 2,59×, mint a pozitív kontrollé. A 3. példa elősegítette a proliferációt 6,25, 12,5, 25 és 50 ug/ml-nél; 12,5, 25 és 50 ug/ml-nél jobb volt, mint a pozitív kontroll (P < 0,01 vagy P < 0,001), a pozitív kontroll 1,40-szeresével, 1,76-szorosával és 0,93-szorosával. Ez azt jelzi, hogy a 2. példa volt a legjobb hatással az MC3T3-E1 proliferáció elősegítésére.

1.2 ALP Activity Assay

Az ALP aktivitást ALP vizsgálati készlettel mértük. A p-nitrofenol törzskoncentrációja 10 mM, a standard görbe koncentrációja 0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12, 0,16, 0,2 és 0,25 mM volt, detektálási pufferrel végzett gradiens hígítással előállítva.

A 96 lyukú lemezen lévő minden egyes mintaüreghez 49 μL kimutatási puffert, 1 μL kezelt MC3T3-E1 sejtekből extrahált fehérjét (1.1 szakaszból) és 50 μL kromogén szubsztrátot (utoljára hozzáadva) adtunk. A reakció 30 percig zajlott a fénytől védett inkubátorban, majd 100 μL leállító oldat hozzáadásával fejeződött be, és az abszorbanciát405 nm. Az ALP aktivitást a standard görbéből számítottuk ki.

Eredmények: Fig. 4 (1. példa), Fig. 5 (2. példa), Fig. 6 (3. példa).

[0061] ALP aktivitás (U/L)=(a fehérje relatív moláris koncentrációja) × 1000 × 100/30
(1000 moláris egység konverzióhoz; 100 teljes reakciótérfogathoz; 30 30 perces reakcióidőhöz)

Az ALP az MC3T3-E1 differenciálódás korai markere. A . 4–6. ábrák azt mutatják, hogy a pozitív kontroll növelte az ALP aktivitást. Az 1. példa nem segítette elő az ALP aktivitást. A 2. példa az ALP-aktivitást 12,5, 25 és 50 ug/ml-re növelte; 25 és 50 ug/ml-nél szignifikáns volt a különbség a vakhoz képest (P < 0,01). A 3. példa 12,5 és 25 ug/ml értéknél növelte az ALP aktivitást (P < 0,001), de a koncentráció növelésével a fokozódás csökkent. Ez azt jelzi, hogy csak a 2. és 3. példa növelte az ALP aktivitást és támogatta a differenciálódást.

Összességében csak a 2. példa mutatott dózis-pozitív korrelációt mind az MC3T3-E1 proliferációban, mind az ALP-aktivitásban 12,5 és 25 ug/ml-nél. A 3. példa dózis-pozitív korrelációt mutatott a proliferációra, de dózis-negatív korrelációt az ALP-re. Összehasonlításképpen a 2. példa alkalmasabb a csont ásványianyag-sűrűségének javítására.

1.3 A 2. példa ásványosítása (alizarinvörös festés).

Mivel a 2. példa mutatta a legjobb hatás- és dóziskorrelációt az 1. és 3. példához képest, mineralizációs kísérleteket végeztünk a hatás további értékelésére.

Az MC3T3-E1 sejteket 72 órás tenyésztés után kezeltük a 2. példa szerinti kivonattal12,5, 25 és 50 ug/ml, 37 fokon inkubált for14 days(kalciumcsomóképződés alapján), 2 naponta közegcserével. Alizarin Red festést végeztünk: a táptalajt eltávolítottuk, a sejteket 10%-os semleges formalinnal (300 μl/lyuk) fixáltuk 30 percig, öblítettük, 30 percig festettük 0,1 % Alizarin Reddel (300 µl/lyuk) (szobahőmérsékleten, fénytől védve), és addig mostuk, amíg vörös szín nem maradt. Képek készültek. Ezután 10%-os cetil-piridinium-klorid oldatot (400 μl/lyuk) adtunk hozzá, és 1 órán át ráztuk, hogy a meszesedő csomók feloldódjanak. Az oldott oldatot 96 lyukú lemezre vittük (100 μl/lyuk), és az OD-t562 nma mineralizációs sebesség kiszámításához. Fényképek: . 7. ábra; kvantitatív eredmények: . 8.

[0065] Mineralizációs arány (%)=OD(Példa 2)−OD(Üres)OD(Üres)×100%\\frac{OD(\\text{Példa 2}) - OD(\\text{Blank})}{OD(\\text{Blank})} \\times 100\\%OD(Blank) 2) − OD (üres) × 100%

A . 7. ábra azt mutatja, hogy a kalciumcsomók száma szekvenciálisan nőtt a koncentrációval az üreshez képest. A . 8 ábra azt mutatja, hogy a 2. példa koncentrációfüggő módon elősegítette a mineralizációt 12,5, 25 és 50 ug/ml-nél, a legerősebb hatást 50 ug/ml-nél, szignifikánsan jobban, mint a pozitív kontroll (P < 0,001). Mivel a mineralizált csomók az oszteoblasztok differenciálódásának végső szakaszát jelentik, ezek az eredmények tovább erősítik a 2. példa csontsűrűség-támogató hatását, és demonstrálják annak stabil aktivitását. A 2. példa jobb volt, mint az ösztradiol, jelezve a csont-egészségügyi termékek potenciális értékét.

Génexpresszió és útvonal-mechanizmus (2. példa)

A 2. példa szerinti kivonatot (12,5, 25, 50 ug/ml) MC3T3-E1 sejtekre vittük fel 3 napig. RNS extrakciót, mennyiségi meghatározást, reverz transzkripciót (20 μl rendszer; 800 ng RNS bemenet) és qRT-PCR-t végeztek a relatív expressziós szint meghatározására.Runx2 mRNS, Osx mRNS, Opn mRNS és Ocn mRNS. Eredmények: . 9–12. ábra.

A Runx2 és az Osx kulcsfontosságú downstream szabályozók a BMP jelátvitelben, és indukálják az oszteoblasztok differenciálódását. A Runx2 fontos a korai elkötelezettségi szakaszban, míg az Osx a terminális differenciálásban működik. Az OPN és az OCN fontos mutatói az oszteoblasztok aktivitásának és a szövetek mineralizációjának. A . 9–12. ábrák azt mutatják, hogy a 2. példa növelte ezeknek a markereknek a relatív expresszióját, támogatva az oszteoblasztok fokozott differenciálódását és a csontképződést.

A 2. példa felülszabályozvaBmp2 mRNS(. 13 ábra), jelezve aBMP/Smad útvonal, amely támogatja az oszteoblasztok differenciálódását és az új csontképződést.

A 2. példa növelte a relatív expressziótLrp5 mRNS, Lrp6 mRNS és Wnt3 mRNS(. 14–16. ábra), amely támogatja az aktiválástWnt/ -catenin jelzés, amely szorosan összefügg az oszteoblasztok proliferációjával, differenciálódásával és csontképződésével.

Fehérje expresszió (2. példa)

A Western-blot analízis azt mutatta, hogy a 2. példában leírtak szerint növekedettOsxésRUNX2fehérje expressziója (. 17–18. ábra), amely mind a transzkripciós, mind a transzlációs szintű szabályozást jelzi az oszteoblasztok differenciálódásának elősegítése érdekében.

Ezek az aktivitási tesztek azt mutatják, hogy a 2. példa biztosította a legjobb proliferációt elősegítő hatást, és ez volt az egyetlen, amely következetes dóziskorrelációt mutatott mind a proliferáció, mind az ALP tekintetében. A 2. példa szintén jobb volt az ösztradiolnál az MC3T3-E1 proliferációjának és mineralizációjának elősegítésében, összehasonlítható differenciáló hatásokkal, ami az optimális csontsűrűség-támogató potenciálra utal.

 

Kémiai összetétel vizsgálata

6.1 Fenil-etanol-glikozid-tartalom

A Kínai Gyógyszerkönyvben található „Cistanche” vizsgálati módszerre hivatkozva az 1–3. példákban az echinakozid- és akteozid-tartalmat mértük (az eredményeket az 1. táblázat mutatja). Az echinakozid, az akteozid és az összes PhG alapján a tendencia következetes volt: 3. példa > 1. példa > 2. példa, és a 3. példában az akteozid 3,85-szerese, illetve 4,27-szerese az 1. és 2. példában leírtaknak. Az aktivitás és a tartalom eredményeinek kombinálása azt mutatja, hogy az echinacoside és az acteozid önmagában nem határozza meg közvetlenül az oszteogén hatásokat.

 

1. táblázat: Echinakozid és akteozid tartalma Cistanche kivonatokban (%)

Minta (Példa)	Echinakozid (%)	Akteozid/verbaszkozid (%)	Összesen (%)
1. példa	28.68	1.63	30.31
2. példa	26.27	1.47	27.74
3. példa	30.39	6.27	36.66

 

6.2 Egyéb összetevők (UPLC/Q-TOF/MS)

UPLC/Q-TOF/MS-t használtunk az 1–3. példák kémiai komponenseinek összehasonlítására. A válaszértékek a 2. táblázatban láthatók.

A 2. példa az echinakozidon és az akteozidon kívül további anyagokat is tartalmazottsikiminsav és fenil-propionsav típusú komponensek, és azt isalkaloidok. Az 1. és 3. példával összehasonlítva a 2. példa 11 fenilpropionos/sikiminsavval rokon komponenst tartalmazott, amelyek a legnagyobb válaszreakciót mutatták, beleértve:

2. táblázat: A kulcskomponensek UPLC/Q-TOF/MS válaszértékei a Cistanche kivonatokban (1–3. példa)

注:原表为"响应值(válaszérték)";我保留为纯数值,不加单位(与图表一致).表内分为2).Shikiminsav és fenilpropionsav származékok(莽草酸及苯丙酸类)与 Alkaloidok(生物碱).

A. Shikiminsav és fenilpropionsav-származékok

Összetett	1. példa	2. példa	3. példa
Izodanfenolsav B (异丹酚酸B)	1,514,590.932	5,985,000.378	5,279,315.212
p-hidroxi-fenil-propionsav (对羟基苯丙酸)	2,897,237.374	6,144,507.902	1,139,582.918
Shikiminsav (莽草酸)	6,539,932.014	8,883,034.928	7,442,038.152
(2R)-2-[(E)-3-[3-[(1R)-1-karboxi-2-(3,4-dihidroxi-fenil)-etoxi]-karbonil-2-(3,4-dihidroxi-fenil)-7-hidroxi-2,3-dihidrobenzofurán-4-il]prop-2-enoil-dihidroxi-3-hidroxi-4-propil)-3	1,514,590.932	5,985,000.378	5,279,315.212
Benzoil-aceton (苯甲酰丙酮)	4,235,952.540	4,526,539.189	4,297,281.060
Epipinorezinol 4′-O- -D-glükozid (表丁香树脂酚 4′-O- -D-葡萄糖苷)	2,758,386.748	4,338,477.068	1,182,637.856
Yangmei Changshan glikozid* (杨梅常山苷)	713,259.014	9,202,359.822	841,791.016
Jionoside A1 (焦地黄苯乙醇苷A1)	2,184,856.679	3,736,929.302	3,098,713.743
3,4-Dimetil-benzoesav (3,4-2甲基苯甲酸)	585,269.7562	1,386,349.28	1,400,433.204
Robustaside D	1,693,753.421	3,272,248.064	4,236,657.164
7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-[[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5-trihidroxi-tetrahidropiran-2-il]-oxi-metil]-tetrahidropirán-2-il]-oxikromen-2-on	4,489,728.765	1,167,879.841	824,633.4

 

---

B. Alkaloidok

Összetett	1. példa	2. példa	3. példa
Verticin (野百合碱)	1,306,481.28	524,919.97	4,057,704.757
Dihidrokoptizin (氢化可他宁碱)	6,406,217.365	9,533,850.521	4,649,410.535
Timin (胸腺嘧啶)	2,658,397.084	2,715,160.269	554,956.4602
Gelsemine (钩吻碱)	3,698,263.919	1,554,195.385	5,144,366.562
Yohimbine (育亨宾)	3,929,806.438	1,286,932.427	9,431,924.132

izodanfenolsav B,

p-hidroxi-fenil-propionsav,

(2R)-2-[(E)-3-[3-[(1R)-1-karboxi-2-(3,4-dihidroxi-fenil)-etoxi]-karbonil-2-(3,4-dihidroxi-fenil)-7-hidroxi-2,3-dihidrobenzofurán-4-il]-prop-2-enoil,4-oxi-propanosav

benzoil-aceton,

epipinorezinol 4'-O- -D-glükozid,

miricetinnel rokon glikozid (a felsoroltak szerint),

jionoside A1,

3,4-dimetil-benzoesav,

robustaside D,

7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-[[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5-trihidroxi-tetrahidropiran-2-il]-oxi-metil]-tetrahidropirán-2-il]-oxikromen-2-on.

5 alkaloidot is tartalmazott, köztük:

verticine,

dihidrokoptizin (a felsoroltak szerint),

timin,

gelseminnel rokon alkaloid (a felsoroltak szerint),

yohimbin.

A proliferációs/ALP-aktivitás, a fenil-etanol-glikozid vizsgálatok és a kémiai profilalkotás összehasonlító eredményei alapján megállapítható, hogy a fenil-etanoid-glikozidok (echinakozid és akteozid), shikim/fenil-propionsavak, alkaloidok és terpenoidok együttesen alkotják a 2. példa produkciós specifikus kivonatának konzisztens dózis-függőségét. (12,5-25 ug/ml) a proliferáción, differenciálódáson és mineralizáción keresztül, ami lehetővé teszi a stabil csontsűrűség-támogató hatást.

2. táblázat: komponensek válaszértékei.
A találmány a 2. példa szerinti eljárással egy Cistanche-kivonatot biztosít, amely több mint 25% összes echinakozidot + akteozidot és dúsított sikimin-/fenil-propionsavakat és alkaloidokat tartalmaz, ami stabil csontsűrűség-támogató hatást tesz lehetővé. 12,5-25 ug/ml-en belül elősegíti az MC3T3-E1 proliferációját, differenciálódását és mineralizációját, dózisnövelő módon, következetes dóziskorreláció mellett, támogatja a jobb és stabilabb csont-egészségügyi eredményeket, és lehetővé teszi a csont ásványianyag-sűrűségének javításával kapcsolatos termékekben való felhasználást.