UPLC-Q-ORBITRAP HRM-ek a molekuláris dokkolással kombinálva a keserű íz és az íz-hatás kapcsolatának anyagi alapjainak vizsgálatához a Cistanchia sivatertikában ⅱ
Dec 18, 2024
2 módszer és eredmény
2.1 A CISTANCHE DESERTICOLA ANDOKOK azonosítása
2.1.1 UPLC-Q-ORBITRAP HRMS detektálási feltételek Kromatográfiás körülmények:
Phenomenex Kinetex C18 oszlop (2,1 mm × 1 0 0 mm, 2,6 μm); A mobil A fázis (vizes fázis, 0,1% ecetsavat tartalmaz), B (izopropanol-acetonitril 1: 1), gradiens elúció ({0-1 min, 1% B; 1-8 min, 1% {{15}% B; 8-9 min, 99% b; 99% -1% B; áramlási sebesség 0,2 ml · min -1; oszlop hőmérséklete 30 fok; Injekciós térfogat 2 μl.
Tömegspektrometriás körülmények: Az Orbitrap Exploris 120 tömegspektrométerrel az elsődleges és a másodlagos tömegspektrometria adatgyűjtésére szoftver ellenőrzése alatt (Thermo Scientific XCalibur Software, verzió: 4.4). A spray -feszültség 3,8 kV (pozitív) vagy -3. 4 kV (negatív), az ionforrás hőmérséklete 320 fok, a hüvely gázáramlási sebessége 50 ARB, a kiegészítő gázáramlási sebesség 15 ARB, és az ionátviteli cső hőmérséklete 320 fok volt. A szkennelési mód teljes szkennelés/adatfüggő másodlagos szkennelés (Full MS/DD-MS2) volt, az elsődleges felbontás 60 000 volt, a másodlagos felbontás 15 000, az ionszkennelési tartomány m/z100 ~ {{{{1 500, és az ütközés energiájának gradiense 20, 30, 40 EV volt.
Kiváló minőségű Cistanche-anyagok magasabbakEchinacoside, verbascoside, tubuloside A, izoverous glikozid
2.1.2 Referencia -megoldás előkészítése
Pontosan mérje meg a megfelelő mennyiségeketEchinacoside, verbascoside, tubuloside A, izoverous glikozid, gentianoside és a genipozid referenciaanyagok, adjunk hozzá 50% metanolt, hogy vegyes referenciamegoldást készítsenek, amelynek tömegkoncentrációja 500 ng · ml {-1, jól rázza meg és kapja meg.
2.1.3 A tesztoldat előkészítése
Mérjünk 1. 10 percig, és szűrje a cistanche sivaterticola alkoholkivonatának előállításához.
2.1.4 Az anyagok azonosítása
Összehasonlítva az egyes Cistanche sivaterticola minták elsődleges és másodlagos tömegspektrometriájának adatait, és a releváns irodalommal és referenciatartalmú anyagokkal kombinálva, azonosították, hogy a Cistanche -sivatagola különböző mintái 69 kémiai összetevőt tartalmaznak, lásd a 2. táblázatot, és a Cistanche sivaterticola teljes ionáramlási diagramját a 2. ábra mutatja.
2. táblázat A CISTANCHE DESERTICOLA KÉPEK alkotóelemei az UPLC-Q-ORBITRAP HRM-ek alapján azonosítottak
| Nem. | Összetett | Molekuláris képlet | Mért érték (m/z) | HIBA (× 10⁻⁶) | Ion mód | Fragmentionok | Beír |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0.02 | Izomenton | C₁₀H₁₈O | 223.06 | -8.7 | [M + H]⁺ | 223.06, 207.02, 137.02 | Monoterpenoidok |
| 0.57 | Uracil | C₄H₄N₂O₂ | 157.04 | 1.8 | [M + H]⁺ | 157.03, 59.02, 49.01 | Más |
| 0.67 | Glükózamin | C₆h₁₃no₅ | 195.05 | 1.1 | [M + H]⁺ | 75.01, 195.05, 59.01 | Szénhidrátok |
| 0.68 | Galaktozamin | C₆h₁₃no₅ | 181.07 | 1.1 | [M + H]⁺ | 181.07, 71.01, 89.02 | Szénhidrátok |
| 0.81 | Kapirilsav | C₈H₁₆O₂ | 144.11 | 1.0 | [M + H]⁺ | 104.11, 103.08, 87.03 | Más |
| 0.83 | L - aszparaginsav | C₄h₇no₄ | 132.03 | 0.7 | [M + H]⁺ | 132.03, 115.00, 71.01 | Aminosavak |
| 0.97 | Etil -acetát | C₄H₈O₂ | 198.19 | 1.4 | [M + H]⁺ | 197.02, 54.02, 153.02 | Más |
| 0.98 | Almasav | C₄H₆O₅ | 155.00 | 0.0 | [M + H]⁺ | 111.00, 49.00, 68.99 | Szervessavak |
| 0.99 | D - galaktóz | C₆H₁₂O₆ | 180.16 | 1.1 | [M + H]⁺ | 179.06, 89.02, 59.01 | Szénhidrátok |
| 1.00 | L - Glutaminsav | C₅h₉no₄ | 188.09 | -0.4 | [M + H]⁺ | 118.09, 119.09, 72.08 | Aminosavak |
| 1.01 | L - izoleucin | C₆h₁₃no₂ | 132.10 | -0.9 | [M + H]⁺ | 132.10, 86.03, 115.07 | Aminosavak |
| 1.05 | Glicin | C₂h₅no₂ | 182.08 | -0.9 | [M + H]⁺ | 182.08, 95.04, 29.03 | Aminosavak |
| 1.48 | Uridin | C₉H₁₂N₂O₆ | 243.06 | 0.3 | [M + H]⁺ | 243.06, 103.01, 102.10 | Nukleozidok |
| 1.93 | Metil -D - jodid | C₂H₅I | 131.03 | 0.0 | [M + H]⁺ | 131.03, 59.00, 41.01 | Más |
| 2.29 | Naringin | C₂₇H₃₂O₁₄ | 345.12 | 3.2 | [M + H]⁺ | 345.12, 327.11, 147.05 | Flavonoidok |
| 3.29 | Protokatechuiksav | C₇H₆O₄ | 153.02 | 1.1 | [M + H]⁺ | 153.02, 109.02, 41.00 | Fenolsavak |
| 3.46 | Triacontanol | C₃₀H₆₂O | 445.10 | 2.7 | [M + H]⁺ | 445.10, 271.08, 101.00 | Alkanolok |
| 3.47 | Kaempferol - 3 - o - glükozid | C₂₁H₂₀O₁₁ | 373.11 | 2.3 | [M + H]⁺ | 123.01, 149.06, 167.07 | Flavonoidok |
| 3.48 | Quercetin | C₁₅H₁₀O₇ | 109.03 | 0.6 | [M + H]⁺ | 109.03, 79.05, 77.03 | Flavonoidok |
| 3.66 | Klorogénsav | C₁₆H₁₈O₉ | 375.09 | -0.7 | [M + H]⁺ | 375.11, 359.07, 309.03 | Fenolsavak |
| 3.70 | Fésűssav | C₉H₈O₂ | 347.13 | 4.1 | [M + H]⁺ | 347.13, 181.09, 113.07 | Fenolsavak |
| 3.74 | 8 - Epigallocatechin - 3 - gallát | C₂₂H₁₈O₁₁ | 315.37 | 13.6 | [M + H]⁺ | 315.37, 136.05, 103.04 | Flavonoidok |
| 3.76 | Limonén | C₁₀H₁₆ | 163.04 | 0.2 | [M + H]⁺ | 163.04, 93.07, 62.03 | Monoterpenoidok |
| 3.77 | Hesperidin | C₂₈H₃₄O₁₅ | 299.11 | -1.9 | [M + H]⁺ | 299.11, 181.08, 101.04 | Flavonoidok |
| 3.91 | Vanillin | C₈H₈O₃ | 307.81 | 3.8 | [M + H]⁺ | 307.83, 173.03, 149.02 | Fenolsavak |
| 4.11 | Izoquercitrin | C₂₁H₂₀O₁₂ | 419.13 | 4.1 | [M + H]⁺ | 419.13, 149.02, 101.00 | Flavonoidok |
| 4.21 | Izopropil -metil -fenidát | C₁₄h₂₁no₂ | 221.08 | -0.8 | [M + H]⁺ | 221.08, 205.09, 104.00 | Más |
| 4.22 | Fecskendősav | C₉H₁₀O₅ | 785.25 | 1.4 | [M + H]⁺ | 785.25, 663.21, 661.19 | Fenolsavak |
| 4.30 | Eugenol | C₁₀H₁₂O₂ | 179.04 | 0.2 | [M + H]⁺ | 179.04, 153.03, 113.03 | Fenolsavak |
| 4.40 | Koffein | C₈H₁₀N₄O₂ | 769.26 | 1.4 | [M + H]⁺ | 769.26, 629.24, 622.14 | Alkaloidok |
| 4.43 | Krizin | C₁₅H₁₀O₄ | 442.05 | 1.1 | [M + H]⁺ | 442.05, 173.03, 113.03 | Flavonoidok |
2.2 A keserű anyagok molekuláris dokkoló szűrése a cistanche sivatertikolában
2.2.1 Ligandum adatbázis felépítése
A 2.1.4 -ben azonosított Cistanche -divaticola kémiai alkotóelemei szerint SDF -struktúrájukat letöltötték a Pubchem adatbázisból, hogy létrehozzanak egy ligandum kis molekula -összetett könyvtárat. Az összes ligandum kis molekulát szerkezetileg optimalizáltuk a Molecular Mechanics programmal, minimalizálva.
2.2.2 A keserű receptorok kiválasztása
A keserű íz receptor (TAS2R) a GPCRS család tagja, és közvetíti az ízlelősejtek keserű ízérzékelési folyamatát a nyelven. 25 receptor altípus van. Közülük a TAS2R1, a TAS2R7, a TAS2R8 és a TAS2R14 különféle keserű anyagokkal aktiválható, és a széles spektrumú keserű érzékelő receptorokhoz tartozhat [14-15]. Ezért ez a tanulmány a TAS2R1, TAS2R7, TAS2R8 és TAS2R14 keserű íz receptor fehérjéket választotta a CISTANCHE DESERTICOLA kémiai komponenseivel történő dokkoláshoz, és a keserű fehérje kristályszerkezetet az AlphaFold adatbázisból szereztük be.
2.2.3 Molekuláris dokkolás
A cistanche sivaterticola kémiai alkotóelemét, amelyet UPLC-Q-Orbitrap HRM-ekkel azonosítottak, ligandumként használtuk, és a keserű íz-receptor TAS2R1, TAS2R7, TAS2R8 és TAS2R14 altípusokat protein receptorként használtuk. A molekuláris dokkolást az AutoDock Vina szoftverrel végeztük. Minél kisebb a dokkolási pontszám, annál jobb a kötő energia. A receptor fehérjét előre feldolgozták Auto Dock Tools (ADT) segítségével, beleértve a dehidrációt és a hidrogénezést. A ligandumot ADT alkalmazásával is feldolgozták, ideértve a hidrogénezést, a töltés kiszámítását, a kimutatást és a forgó kötések kiválasztását. A receptor aktív helyét ADT segítségével határoztuk meg, és a dokkolódobozt úgy állítottuk be, hogy a doboz mérete elegendő legyen az aktív helyszín visszatartásához. A dokkolás befejezése után a Pymol megjelenítő szoftverét használták a dokkoló eredmények megtekintéséhez és elemzéséhez. A molekuláris dokkolás hamis pozitív eredményeinek csökkentése érdekében ez a tanulmány a keserű pozitív ligand -kinin dokkoló pontszámát használták a szűrési kritériumként és a kiválasztott kémiai komponensekként, amelyek legalább két keserű receptorhoz kötődnek a Cistanchche Deserticola keserű anyagához. Ennek eredményeként összesen 20 kémiai komponens volt potenciális keserű anyag, beleértve 6 feniletanoid glikozidot, 5 flavonoidot, 3 fenolsavat, 2 ciklopentadién -terpént, 2 alkaloidot és 2 másik komponenst, jelezve, hogy a feniletanoid glikozidok és flavonoidok a fő keserű anyagok. A dokkolási pontszámokat a 3. táblázat mutatja.
3. táblázat A Cistanche Deserticola kivonatok molekuláris dokkoló pontszáma keserű íz receptorokkal kcal · mol -1
| Nem. | Keserű anyag | TAS2R1 | TAS2R7 | TAS2R8 | TAS2R14 |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | Szekszin | -7.6 | -6.6 | -7.8 | -7.1 |
| 2 | Trifolirhizin | -8.8 | -7 | -8.7 | -8.5 |
| 3 | Benzoesav | -7.9 | -6.9 | -8.2 | -7.1 |
| 4 | Vitexin | -7.6 | -6.8 | -8.5 | -7.1 |
| 5 | Trifolin | -8.4 | -7.5 | -8.2 | -7.7 |
| 6 | Izoquercitrin | -9.2 | -7.5 | -8.1 | -7.8 |
| 7 | Izomenton | -7.3 | -6.7 | -7.4 | -6.9 |
| 8 | Kurkumin | -9.2 | -8.1 | -8.3 | -7.4 |
| 9 | Dehidroacetsav | -6.6 | -6 | -7.8 | -7.9 |
| 10 | Ginsenozid | -7.3 | -7.9 | -8.8 | -8.3 |
| 11 | Piperin | -8.8 | -7.9 | -7.9 | -7.9 |
| 12 | Epicatechin | -9.8 | -6.9 | -9.1 | -8.7 |
| 13 | Izoquercitrin (ismét) | -8.1 | -8 | -8.2 | -8 |
| 14 | Rein | -8.7 | -7 | -8.9 | -8.5 |
| 15 | Izoosalicilsav | -8.7 | -6.5 | -8.3 | -9.3 |
| 16 | Pinocembrin | -9.1 | -7.6 | -8.1 | -8.6 |
| 17 | Eriocitrin | -7.9 | -7.6 | -8.2 | -8.4 |
| 18 | Gomisztin | -8.1 | -8.2 | -9.1 | -8.2 |
| 19 | Kaempferol | -8.4 | -8.1 | -9.1 | -8.4 |
| 20 | Izoquercitrin (harmadik említés) | -8.2 | -8.4 | -7.9 | -8.7 |
2.3 A CISTANCHE DESERTICOLA keserűségének elektronikus nyelvének értékelése
2.3.1 jelszerzés
Lásd az irodalmi módszert és optimalizálni azt [16]. A paraméterek a következők: Begyűjtési hőmérséklet 25 fok, adatgyűjtési idő 120 s, 1 s gyűjtési periódus, keverési sebesség 1 r · s -1, ultrapure víz felhasználásával tisztítófolyadékként, minden minta mérése előtt, az érzékelőt 10 másodpercig.
2.3.2 Minta meghatározása
Mérjünk 1. Helyezze az elkészített mintát a műszer 100 ml -es standard főzőpohárjába, és hajtsa végre a mérést. Ismételje meg a mérést háromszor az egyes mintáknál.
2.3.3 keserűség -értékelési eredmények elektronikus nyelv felhasználásával
A módszertani ellenőrzés után a pontosság, a megismételhetőség és a {0}} h stabilitási kísérletek relatív standard eltérése (RSD) 1,7%, 3,6%és 1,4%volt, mind kevesebb, mint 5,0%, jelezve, hogy ez a módszer megvalósítható. A különféle Cistanche Deserticola minták kvantitatív keserűségi értékei 8,856 és 27,32 között változtak, a 4. táblázat szerint, szignifikáns különbségekkel.
3 megbeszélés
Ebben a tanulmányban 69 kémiai komponenst azonosítottak a cisztanche-sivatagola-ban, UPLC-Q-Orbitrap HRMS technológiával, és 20 keserű anyagot, amelyek stimulálják a keserű íz receptorokat a Cistanche-sivatagolában, szűrjük ki a molekuláris dokkoló technológiák kombinálásával, beleértve 6 fenil-etanol-glicosides-t, 5 Flavonoids-t, 3 fenolsavat, 2 iridoids-t, beleértve a 2 alletanol-gilkozidokat, és a 3 fenolsavat, a 2 iridoids-t, beleértve más komponensek, beleértve az echinacoside, a verbascoside, a tubuloside A, az izoverboszkozid, a genipozid stb.; 9 tétel friss cisztanche -sivaterticola mintát gyűjtöttünk különböző hónapokban, és különböző hónapokra és különböző részekre osztottuk. Az elektronikus nyelv módszerét használtuk a minták keserűségének kvantitatív értékének meghatározására, és a HPLC -t a mintákban a 6 potenciális keserű farmakológiai komponens (echinacoside, verbaszkoszid, tubuloside) meghatározására. A, izo-verbaside, jinshicanoside, genipozid) tartalmat és UV-látható spektrofotometriát alkalmaztunk az összes feniletanoid glikozid, az összes poliszacharid, az összes alkaloid, az összes flavonoid és az összes fenolsav-tartalom meghatározására a mintákban. Ennek alapján a kemometriai elemzéssel kombinálva a Pearson korrelációs analízist, a szürke korrelációs elemzést, az OPLS-DA-t stb. Használtuk a keserű komponensek megtalálásához a Cistanche deserticola-ban. A korrelációs elemzés eredményei azt mutatták, hogy a teljes feniletanoid glikozidok és az összes flavonoid tartalma a Cistanche -dezertikola -ban pozitívan korrelált a keserű válaszértékkel, és a Cistanche deserticola összes poliszacharidja negatívan korrelált a keserű válaszértékkel. Közülük a feniletanoid glikozid -komponensek echinakozid, verbaszkoszid és jinshicanozid tartalma szignifikánsan pozitívan korrelált a keserű válaszértékkel, amely összhangban volt a molekuláris dokkoló eredményekkel, igazolva a molekuláris dokkoló eredmények pontosságát. A két módszer támogatta egymást, és referenciát adott a Cistanche Deserticola későbbi betéti és ízkorrekciójára.
A hálózati farmakológiai előrejelzés révén 245 keserű anyagcélt kaptunk, és a legfontosabb célok az EGFR, PIK3CB, PTK2, PIK3CD, PIK3R1, PTPN11, IK3CA, SRC, JAK2, PDGFRB stb.; A keserű anyagcélok KEGG útja és GO funkció dúsítási eredményei azt mutatták, hogy az inzulinrezisztencia, a PI3K-AKT jelátviteli út szerepe a diabéteszes szövődményekben, és az AGR-RAGE jelátviteli út diabéteszes szövődményekben voltak a CISTANCHE DESERTICOLA keserű anyagcélok keserű anyagcéljai kulcsfontosságú útjai. Összesen 267 GO funkciót szereztünk a keserű anyagcélokhoz. Beleértve 123 biológiai folyamatot, 75 molekuláris funkciót és 69 sejtkomponenst; A keserű anyagcélok és a CARISTANCHE DESERTICOLA keserű hatásainak keserű hatásainak a keserű elemzésével végzett elemzéssel az eredmények azt mutatták, hogy 54,69%, 65,30%, 48,16%, 40,40%, 20,40%és 19,59%-a keserű anti-diebrotációt, neuroprotekciót, immunmodulációt, az anti-diebrotációt, a neuroprotekciót, a neuroprotekciót, a neuroprotekciót, a neuroprotekciót, a neuroprotekciót, az immunmodulációt, az anti-diablopathy-t anti-dropathy-t, a neuroprotekciót, az immunmodulációt. és anti-osteoporosis. Ez azt mutatja, hogy a keserű anyagok a cistanche deserticola -ban bizonyos anyagi alapokkal rendelkeznek a keserű hatásokhoz.
Ebben a tanulmányban kutatási objektumként használták a Cistanche sivaterticola kivonatát, és a Cistanche sivaterticola keserű anyagokat az UPLC-Q-ORBITRAP RMS és a molekuláris dokkolás szűri ki; A HPLC-t használtuk a keserű gyógykomponensek tartalmának meghatározására, és UV-látható spektrofotometriát használtunk a keserű anyagok egyes főbb kategóriáinak tartalmának meghatározására. Az elektronikus nyelvet használták a keserűség mértékének felmérésére, és a keserű alkatrészeket kemometria segítségével igazoltuk. A modern műszaki kutatási módszereket teljes mértékben felhasználták a cistanche sivaterticola ízinformációinak feltárására, és felfedték annak keserű anyagának alapját, amely referenciát nyújt a Cistanche Deserticola későbbi terhelési és ízkorrekciójára. A hálózati farmakológia tanulmányozása révén a keserű anyagok hatásmechanizmusát a Cistanche-sivatagolában és annak kapcsolatát a keserű hatékonyság célpontjával előzetesen feltárták, amely ötleteket és hivatkozásokat fog nyújtani a kínai orvoslás öt ízének „ízfájás” kapcsolatának jövőbeni tanulmányozására. Még mindig vannak néhány hiányosság: Ez a kísérlet csak a hagyományos betakarítási szezonban jó minőségű növényeket választott, hogy megmérje a keserű anyagtartalmat és a különböző részek keserűségét. Van egy bizonyos fokú elégtelen minta, és a különböző alkatrészek keserűségének különbségeinek eredményei nem rendelkeznek bizonyos megbízhatósággal. A tervek szerint nagyszabású mintákat kell használni az ellenőrzéshez és a jövőben szisztematikusabb kutatásokat végezni; Általában úgy gondolják, hogy az alkaloid komponensek keserűek, de a kísérlet korrelációs elemzése azt mutatta, hogy az alkaloidok és keserűség negatívan korrelálnak, ami az lehet, hogy a Cistanche -sivatagola alkaloid komponense elsősorban a betain, és a molekuláris dokkoló azt mutatja, hogy az a keserű receptorok és a keserű receptorok gyengén kötődik. Ezenkívül a molekuláris dokkolás által átvizsgált keserű eredmények nem specifikus keserűség -kvantitatív értékelési kísérleti ellenőrzési adatokat, és a szűrési eredmények hamis pozitív eredményekkel járhatnak, és további kutatásokra és a kísérlet feltárására van szükség.
