A hálózati farmakológia és a kísérleti validáció feltárja a Cistanche fenil-etanol-glikozidok mechanikus szerepét a NAFLD kezelésében a TNF/PI3K/Akt útvonalon keresztül

3. Eredmények

3.1 Hálózati farmakológia

3.1.1 Aktív vegyületek és lehetséges célpontok

A projektcsapat korábbi kutatásai, valamint adatbázisokból és szakirodalomból származó információk alapján tíz reprezentatív farmakológiai hatású vegyületet választottak ki [10–11]:verbaszkozid, izoverbaszkozid, echinakozid, 2'-acetil-verbakozid, cisztanozid A, cisztanozid B, szalidrozid, izokrenatozid II, cisztanche-glikozid A és cisztanche-glikozid F.

Magas tartalmú verbaszkozid (akteozid) Cistanche kivonat vérzsírkezeléshez

Cistanche kivonat specifikációs listája

Vegye fel velünk a kapcsolatot, vásároljon most

HasználataSwissTargetPrediction, 44 célt sikerült elérni;NetInfermegjósolta a 20 legfontosabb célpontot, 45 célt eredményezve;SuperPred118 célpontot ért el. Az ismétlődések egyesítése és eltávolítása után195 egyedi célpontazonosították.

AGSE89632adatkészlet, amely 39 NAFLD mintát és 24 normál mintát tartalmazott,589 eltérően expresszált génátvizsgálták. Adatok kombinálása innenGeneCardsésDisGeNET, 2315 NAFLD-vel kapcsolatos betegséggéndeduplikáció után kaptuk (1A–1B. ábra). Azáltal, hogy a vegyülettel kapcsolatos célpontokat a betegség célpontjaival metszi,77 átfedő célA Cistanche-fenil-etanol-glikozidok potenciális terápiás célpontjaként azonosították a NAFLD-vel szemben (1C. ábra).

Ezeket a célokat importálták aHÚR database with an interaction threshold >0,400. Az elkülönített csomópontokat eltávolítottuk, és a hálózatot a következőn keresztül vizualizáltukCytoscape, ami aPPI hálózat 75 csomóponttal és 408 éllel(1D. ábra). A Cytoscape "Hálózat elemzése" funkciójával a fokérték alapján a 10 legfontosabb célpontot azonosítottuk alapvető célként:TNF, NFKB1, TLR4, HSP90AA1, ESR1, HIF1A, STAT1, APP, PRKACA, SMAD3.

3.1.2 GO, KEGG és DO dúsítási elemzések

A GO dúsítási elemzése 93 kifejezést tárt felmolekuláris funkció (MF), 38 értcelluláris komponens (CC), 989 pedigbiológiai folyamat (BP). Minden kategóriában a legjobb 10 pályaművet vizualizáltuk (2. ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy a Cistanche fenil-etanol-glikozidok NAFLD-ellenes hatást fejthetnek ki agyulladás, citokinek, anyagcsere és immunválasz.

DO dúsítás azonosítva833 betegséga célpontokhoz kapcsolódóan, a legjobb 25 megjelenítve (4. ábra), beleértveanyagcsere-, immun-, szív- és érrendszeri, elhízással kapcsolatos és májbetegségek, mindegyik szorosan kapcsolódik a NAFLD-hez.

3.1.3 „Összetett–cél–útvonal” hálózat

A KEGG dúsítási eredmények alapján a„összetett–cél–útvonal” hálózatfelhasználásával készültCytoscape 3.9.1. A zöld négyzetek az aktív vegyületeket, a kék körök a célokat, a narancssárga V-alakú csomópontok pedig az útvonalakat jelölik (5. ábra). Ez azt mutatja, hogy a Cistanche fenil-etanol-glikozidok NAFLD-ellenes hatást fejtenek kitöbb vegyület, célpont és útvonal, -valechinacoside és verbascosidelévén a leggyakrabban előforduló és felsorolt ​​markervegyületek a 2020-as kiadásbanKínai Gyógyszerkönyv.

3.1.4 Molekuláris dokkolás

Az öt legfontosabb célpont a PPI-hálózatban (TNF, NFKB1, TLR4, HSP90AA1, ESR1) dokkoltuk az aktív vegyületekkel, és kiszámítottuk minimális kötési energiájukat (6. ábra). Minden dokkolási pontszám kisebb volt, mint– 6 kcal/mol, ami erős kötési affinitást jelez.A TNF mutatta a legerősebb affinitást. Néhány dokkolási eredményt a segítségével vizualizáltunkPyMOL(7. ábra).

3.2 Sejtkísérletek

3.2.1. Az FFA hatása a lipid felhalmozódásra a HepG2 sejtekben

Ahogy az ábrán látható8. ábra, az FFA-koncentráció 0,5-ről 2 mmol/l-re történő növelése a vörös lipidcseppek számának növekedéséhez vezetett, amelyek nagy lipidcseppekké olvadtak össze, jelezve a sikeres lipidterhelést.

3.2.2. Az FFA és a Cistanche fenil-etanol-glikozidok hatása a sejtek életképességére

Ahogy az ábrán látható9A ábra, FFA koncentrációja1 mmol/L és az alattnem volt szignifikáns hatása a sejtek életképességére (P > 0,05); így,1 mmol/lmodellezésre választották. Ahogy az ábrán látható9B. ábra, Cistanche feniletanoid glikozidok ig200 μg/mlnem befolyásolta szignifikánsan az életképességet (P > 0,05), de400 μg/mljelentősen gátolta az életképességet (P < 0,01). Ezért,25, 50 és 100 μg/mlalacsony, közepes és magas dózisúként választották ki a kezeléshez.

3.2.3 A lipid felhalmozódásra gyakorolt ​​hatások

Ahogy az ábrán látható10. ábra, a modellcsoport szignifikáns vörös lipidcsepp-akkumulációt mutatott a kontrollcsoporthoz képest (P < 0,01), ami megerősíti a sikeres modellezést. Kezelés a50 és 100 μg/mlA Cistanche fenil-etanoid glikozidok szignifikánsan csökkentették a lipidcseppek képződését (P < 0,01). In11. ábra, a TG és TC szintek emelkedtek a modellcsoportban (P < 0,01), míg az összes kezelési csoport szignifikánsan alacsonyabb szintet mutatott a modellcsoporthoz képest (P < 0,01).

3.2.4 Hatások a mitokondriális károsodásra

A JC-1 festék felhalmozódik az egészséges mitokondriumokban, és vörös fluoreszcenciát bocsát ki; a sérült mitokondriumokban monomer formában marad és zöld fluoreszcenciát bocsát ki. Ahogy az ábrán látható12. ábra, a vörös fluoreszcencia a kontrollcsoportban, míg a zöld fluoreszcencia a modellcsoportban volt kiemelkedő. A kezelt csoportok csökkent zöld fluoreszcenciát és fokozott vörös fluoreszcenciát mutattak, ami a mitokondriális membránpotenciál javulását jelzi.

3.2.5 Hatások az intracelluláris ROS-szintekre

Ahogy az ábrán látható13. ábra, a modellcsoport szignifikánsan megnövekedett fluoreszcencia intenzitást mutatott (P < 0,01), ami emelkedett ROS-t jelez. A Cistanche fenil-etanoid glikozidokkal végzett kezelés minden koncentrációban szignifikánsan csökkentette a ROS szintet (P < 0,01).

3.2.6 Az apoptózisra gyakorolt ​​hatások

A Hoechst 33342 megfesti a sejtmagokat, amelyekben az apoptotikus sejtmagok élénkkék, kondenzált vagy fragmentált morfológiát mutatnak. Mint látható14. ábra, a kontrollcsoport minimális fényes fluoreszcenciával rendelkezett, míg a modellcsoport bőséges világoskék apoptotikus magokat mutatott. A kezelt csoportok csökkent fluoreszcencia intenzitást mutattak, ami csökkent apoptózist jelez.

3.2.7 Hatások az TNF/PI3K/Akt jelátviteli útvonalra és a Bax-kifejezésre

Ahogy az ábrán látható15. ábra, a kontrollcsoporthoz képest a modellcsoport szignifikánsan emelkedett expressziót mutatottTNF-a, PI3K p85, Akt és Baxfehérjék (P < 0,05, P < 0,01). A kezelés során:

Minden Cistanche fenil-etanol-glikozid csoport csökkentTNF-αkifejezés (P < 0,01),

A50 μg/mlcsoport csökkentPI3K p85kifejezés (P < 0,01),

A100 μg/mlcsoport csökkentAkt és Baxkifejezés (P < 0,05).

4. Vita

A NAFLD egy összetett májbetegség, amely anyagcsere-rendellenességekkel jár, beleértvelipidanyagcsere egyensúlyhiány, inzulinrezisztencia és oxidatív stressz[12]. Az elmúlt évekbenhagyományos kínai orvoslás (TCM)jelentős ígéretet mutatott a NAFLD kezelésében.

A modern kutatások ezt mutatták kia Cistanche-ból származó fenil-etanol-glikozidokszabályozhatja a lipid- és glükózanyagcserét a májban, és gátolja az oxidatív stresszt, a gyulladást és a fibrózist [13–15]. A máj használβ-oxidációzsírsavak lebontására ésCYP7A1hogy a koleszterint epesavakká alakítsák a lipid homeosztázis érdekében [16–18]. Magas zsírtartalmú környezetben a metabolikus egyensúlyhiány lipidfelhalmozódáshoz és NAFLD-hez vezet [19].

Ez a tanulmány megerősítette eztFFA-indukált HepG2 sejtekemelkedett lipidcseppeket és emelkedett TC és TG szintet mutatott. A Cistanche feniletanoid glikozidokkal végzett kezelés jelentősen csökkentette a lipidcseppek képződését és a TC/TG szintet, javítva a máj steatosist.

A mitokondriális diszfunkció csökkent β-oxidációhoz, túlzott ROS-termeléshez és lipid-peroxidációhoz vezet [20]. A ROS tovább károsítja a mitokondriumokat, rontva a steatosist [21]. Eredményeink azt mutatják, hogy a Cistanche feniletanoid glikozidokcsökkenti a ROS-t, javítanimitokondriális membránpotenciál, és enyhítioxidatív stressz, ezáltal mérsékelve a zsírfelhalmozódást.

A hálózati farmakológia azt mutatta, hogy az anti-NAFLD hatások többszörösekmetabolikus és apoptózissal kapcsolatos utak. A molekuláris dokkolás erős kötési affinitást mutatott az aktív vegyületek és a célpontok között, különösenTNF, ami központi szerepére utal.

ATNF útvonalkritikus a sejtjelátvitelben. A TNF-α kötődikTNFR1, aktiválja a halálreceptor útvonalakat és indukálja az apoptózist [22]. Ez is aktiválja aPI3K/Akt útvonalparakrin jelátvitel révén [23–24]. Az abnormális PI3K/Akt jelátvitel lipidfelhalmozódáshoz, gyulladáshoz és fibrózishoz kapcsolódik a NAFLD-ben [25]. Adataink azt mutatják, hogy a Cistanche feniletanoid glikozidokgátolja az apoptózistés csökkenti a kifejeződésétTNF-α, PI3K, Akt, ésBax, összhangban a hálózati előrejelzésekkel, megerősítve a fontosságátTNF/PI3K/Akt útvonal.

Következtetés

A Cistanche feniletanoid glikozidok szabályozzák a NAFLD-ttöbb folyamat és út, beleértve:

Csökkenti a lipid felhalmozódást,

Az oxidatív stressz gátlása,

A mitokondriális károsodás enyhítése,

Az apoptózis elnyomása.

Ezek a hatások szorosan összefügghetnek aTNF/PI3K/Akt jelzőútvonal. Ez a tanulmány nemcsak tudományos támogatást nyújt a Cistanche-fenil-etanol-glikozidok NAFLD-kezelésben történő alkalmazásához, hanem referenciaként szolgál új terápiás gyógyszerek fejlesztéséhez és klinikai kutatásához.