A Cistanche Tubulosa feniletanoid glikozidok apoptózist indukálnak az Eca-109 sejtekben a mitokondrium-függő útvonalon keresztül
Mar 06, 2022
Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
CHANGSHUANG FU , JINYU LI , ADILA AIPIRE , LIJIE XIA , YI YANG , QIUYAN CHEN , JIE LV , XINHUI WANG és JINYAO LI
Absztrakt
Cistanche tubulosakülönféle biológiai funkciókat lát el. Jelen tanulmányban a C. tubulosa (CTPG-W) vízoldható fenil-etanol-glikozidjainak nyelőcsőrákra gyakorolt daganatellenes hatását vizsgáltuk. Az Eca-109 sejteket CTPG-W-vel kezeltük, és a sejtek életképességét MTT vizsgálattal mértük. Az apoptózist, a sejtciklust, a mitokondriális membránpotenciált (Δψm) és a reaktív oxigénfajtákat áramlási citometriával elemeztük. Az apoptotikus útvonalak fehérjeszintjét Western blot analízissel határoztuk meg. Megállapították, hogy a CTPG-W szignifikánsan csökkentette az Eca-109 sejtek életképességét az apoptózis kiváltása és a sejtciklus leállása révén. A CTPG-W kezelést követően az Eca-109 Δψm-je jelentősen lecsökkent, ami a B-sejtes limfóma-2 (Bcl-2)-hoz kapcsolódó X-szint emelkedésével és a leszabályozott szintekkel függ össze. of Bcl-2. Következésképpen a citokróm c és c-Jun NH2-terminális kináz szintje megemelkedett, ami megnövelte a hasított poli (ADP-ribóz) polimeráz és a hasított kaszpáz-3 szintjét, {{18} } és -9, de nem a kaszpáz-8. Ennek megfelelően az Eca-109 sejtekben a reaktív oxigénfajták szintje jelentős változásokat mutatott. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a CTPG-W mitokondriális függő útvonalon keresztül indukálta az Eca-109 sejtek apoptózisát.
Bevezetés
A nyelőcsőrák az egyik leggyakoribb ráktípus, a 11. legmagasabb morbiditási és 6. legmagasabb mortalitási rátával világszerte, és 2015-ben ~439,{3}} halálozást okozott (1). A nyelőcsőrák előfordulási gyakorisága jelentősen eltér a különböző régiókban: Kelet-Ázsiában, Kelet- és Dél-Afrikában volt a legmagasabb, Nyugat-Afrikában pedig a legalacsonyabb az előfordulási arány 2012-ben (1,2). Kínában a nyelőcsőrákos esetek és halálozások becsült száma 477,000 és 375000 volt 2015-ben (3). Bár a nyelőcsőrák megbetegedési aránya 2005 és 2015 között csökkent a közepes és magas szociodemográfiai indexű országokban, a halálozási ráta továbbra is magas a rossz prognózis miatt (1,4). A nyelőcsőrák kezelésére a műtéti reszekciót kemoterápiával vagy sugárterápiával kombinálták, azonban a jelentések szerint 2003 és 2014 között az 5-éves túlélési arány változatlan maradt.<20% in="" china,="" the="" usa,="" and="" europe="" (4,5).="" for="" these="" reasons,="" it="" is="" urgent="" to="" develop="" novel="" therapeutic="" agents="" to="" treat="" esophageal="">
A hagyományos kínai gyógynövénygyógyászatot (CHM) különféle ráktípusok kezelésére alkalmazták, beleértve a nem-kissejtes tüdőrákot (6), a vastag- és végbélrákot (7), a hepatocelluláris karcinómát (8). A közelmúltban a klinikai vizsgálatok arról számoltak be, hogy a CHM kemoterápiával vagy sugárterápiával való kombinációja nemcsak az életminőség javítására és a kemoterápia vagy sugárterápia által kiváltott mellékhatások enyhítésére szolgál (9,10), hanem javította a betegek túlélési arányát is. nem kissejtes tüdő-, máj-, gyomor-, vastagbél-, orr-garat- vagy méhnyakrákban (9). Azonban ellentmondó bizonyítékok állnak rendelkezésre a CHM-kezelés hatékonyságával kapcsolatban a nyelőcsőrákban (10, 11). Számos tanulmány megállapította, hogy számos növényi gyógyszer vagy komponens gátolja a nyelőcsőráksejtek növekedését in vitro és in vivo, köztük az Andrographis paniculata (12, 13), a Daikenchuto (14), az icariin (15), a Rosa Roxburghii Tratt és a Fagopyrum. Cymosum (16), Jaridonin (17), Marsdenia tenacissima (18), OP16 (új ent-kauren diterpenoid) (19), Qigesan (20) és Tonglian főzet (21). A Cistanche a CHM egy fajtája, és különféle biológiai funkciókat fejt ki, beleértve az antioxidánst, a gyulladást és a neuroprotekciót (22, 23). Korábbi tanulmányunk ezt bizonyítottaCistanche tubulosa feniletanoid glikozidok(CTPG) elnyomhatja a melanoma B16-F10 sejtek növekedését in vitro és in vivo (24). A korábban használt CTPG gyenge vízoldhatósága azonban korlátozza a gyógyszerfejlesztést (24). Ezért vízben oldódó CTPG-t (CTPG-W) alkalmaztunk, és megvizsgáltuk a nyelőcsőráksejtekre kifejtett daganatellenes hatást (Eca-109). Megállapították, hogy a CTPG-W dózisfüggően gátolja az Eca-109 sejtek életképességét azáltal, hogy mitokondriális függő útvonalon keresztül apoptózist indukál.
Anyagok és módszerek Állatok.
A nőstény C57BL/6 egereket (6-8 hét, ~25 g) a Beijing Laboratory Animal Research Center-től (Peking, Kína) vásároltuk, és szabályozott hőmérsékletű (25 ˚C), fényciklusos (12/ 12) A Xinjiang Egyetem Állattelepe (Urumcsi, Kína). Minden állat kórokozómentes vizet és táplálékot kapott.
Sejtvonal és tenyészet. Az emberi nyelőcső karcinóma sejtvonalat (Eca-109) a Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering (College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, China) őrizte meg, és RPMI-ben tenyésztette ki{{1} } táptalaj (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA), kiegészítve 10 százalék hővel inaktivált borjúmagzatszérummal (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, Kína), 1 százalék L - glutamin (100 mM), 100 U/ml penicillin és 100 µg/ml sztreptomicin 37 °C-on, 5% CO2-t tartalmazó, párásított atmoszférában.
Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC). A CTPG-W-t (kat. sz. SGJG2{10}}170410) a Shanghai Upbio Tech Co., Ltd.-től (Sanghaj, Kína) vásároltuk. A CTPG főbb vegyületeit HPLC-vel minősítettük és mennyiségileg meghatároztuk korábbi vizsgálatunk szerint (24). Röviden, a HPLC-t ZORBAX SB-C18 oszlopon (250x4,6 mm; 5 µm) hajtottuk végre 30 °C-on, és 0,2%-os hangyasavoldattal és 23%-os metanolgradienssel eluáltuk, mivel percenként 1 ml-t adtunk hozzá. 45 percig, amíg el nem éri a 31 százalékot. Összesen 10 µl mintát fecskendeztünk be, és 330 nm-en detektáltuk. Az echinakozid standardot a Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd.-től (Sanghaj, Kína), az akteozid standardot pedig a Sigma-Aldrich-től (Merck KGaA, Darmstadt, Németország) vásároltuk. A szabványokat a CTPG-W összetevőinek elemzésére használták.
MTT vizsgálat. A sejtproliferációt MTT vizsgálattal mértük. Eca{{0}} sejteket oltottunk be 96-lyuklemezekre 5x103 sejt sűrűséggel 100 µl RPMI-ben{{5 }} táptalaj/lyuk és 24 órán át 37 ˚C-on tenyésztettük, majd különböző koncentrációjú (0, 200, 400, 600 és 800 µg/ml) CTPG-W-vel vagy 0,4 százalékos dimetil-szulfoxiddal (DMSO) kezeltük 24 órán át, 48 és 72 óra. Oldószer kontrollként DMSO-t használtunk (800 µg/ml CTPG-W, amely 0,4% DMSO-t tartalmaz). Pozitív kontrollként ciszplatint (20 µg/ml) használtunk. Ezt követően a felülúszót 225 xg-vel 5 percig szobahőmérsékleten centrifugáltuk, majd 100 µl MTT-oldatot (0,5 mg/ml RPMI-1640 tápközegben FBS nélkül) adtunk minden egyes lyukhoz, és 37 °C-on inkubáltuk. 3 órán keresztül. A képződött formazán kristályokat 200 µl DMSO-ban oldjuk. Az optikai sűrűség (OD) értékeket 490 nm hullámhosszon mértük egy 96-lyukú mikrolemez-leolvasóval (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). A relatív sejtéletképességet a következő képlet szerint számítottuk ki: Sejtéletképesség ( százalék )=(OD-kezelt/ODkezeletlen)x100 százalék. Az Eca-109 sejtek morfológiáját fordított fluoreszcens mikroszkóppal (200-szoros nagyítás) figyelték meg (Nikon Eclipse Ti-E; Nikon Corporation, Tokió, Japán).
A lépsejtek proliferációjához a C57BL/6 egereket nyaki diszlokációval elaltattuk, és a lépeket izoláltuk. Az egysejtű szuszpenziót elkészítettük, és a lépsejteket 96-lyuk lemezekre oltottuk 1x105 sejt/lyuk sűrűséggel 100 µl RPMI-1640 tápközegben, majd különböző koncentrációkkal kezeltük. (0, 200, 400, 600 és 800 µg/ml) CTPG-W-t 24, 48 és 72 órán keresztül 37 °C-on 5 százalékos CO2 mellett. A lépsejtek proliferációját MTT assay-vel mértük, a fent említett protokoll szerint. Stimulációs index=ODkezelt/ODkezelt.
Az apoptózis és a sejtciklus mérése. Az Eca{{0}} sejteket 60 mm-es edényekben tenyésztettük 2,5x105 sejt/tál sűrűségben 24 órán keresztül, és különböző koncentrációkkal kezeltük ({{31} }, 200, 400, 600 és 800 µg/ml) CTPG-W vagy 0,4% DMSO 24 órán át 37 °C-on 5% CO2-val. A sejteket összegyűjtöttük, és egy Annexin V-fluoreszcein-izotiocianát (FITC)/propidium-jodid (PI) Apoptosis Detection Kit-tel (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Sanghaj, Kína) festettük a gyártó protokollja szerint. A mintákat áramlási citometriával (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) gyűjtöttük, és FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA) segítségével analizáltuk. A CTPG-W sejtciklusra gyakorolt hatásának elemzéséhez 2,5x105 Eca-109 sejtet oltottunk 60 mm-es tenyésztőedényekbe, és kezeltük CTPG-W-vel (0, 100, 200 és 400 µg/ml) vagy 0,4 százalékos DMSO-t 24 órán át 37 °C-on 5 százalék szén-dioxiddal. Az összes sejtet összegyűjtöttük, és kétszer mostuk jéghideg PBS-sel (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), majd 70%-os jéghideg etanolban fixáltuk 4 °C-on 30 percig. Jéghideg PBS-sel kétszeri mosást követően a sejteket 300 µl PI/RNáz festőpufferben (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 10 percig szobahőmérsékleten újraszuszpendáltuk. A sejtciklus eloszlását a ModFit LT 3.0 szoftverrel elemeztük áramlási citometriával (BD FACSCalibur).
A mitokondriális membránpotenciál (Δψm) és a reaktív oxigénfajták (ROS) elemzése. A Δψm elemzéséhez az Eca{0}} sejteket CTPG-W-vel (0, 400, 600 és 800 µg/ml) vagy 0,4 százalékos DMSO-val kezeltük 24 percig. h 37 ˚C-on 5 százalékos CO2-tartalommal, és a mitokondriális membránpotenciál vizsgálati készlettel JC-vel-1 (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, Kína) festjük a gyártó protokollja szerint, 20 percig 37 ˚C-on. . A JC-1 mosópufferrel (Beyotime Institute of Biotechnology) végzett kétszeri mosást követően a mintákat 300 µl JC-1 mosópufferrel szuszpendáltuk, és áramlási citometriával (BD FACSCalibur) elemeztük. A JC-1 festék fluoreszcenciáját az Eca-109 sejtekben fordított fluoreszcens mikroszkóppal is megfigyelték (200-szoros nagyítás; Nikon Eclipse Ti-E). A ROS analíziséhez az Eca-109 sejteket CTPG-W-vel (0, 400, 600 és 800 µg/ml) kezeltük 2, 4, 6, 12 és 24 órán keresztül, és Reactive Oxygen Species-szel festettük. Assay Kit (Beyotime Institute of Biotechnology), a gyártó protokollja szerint, 20 percig 37°C-on. Jéghideg PBS-sel történő háromszori mosást követően a mintákat áramlási citometriával (BD FACSCalibur) gyűjtöttük, és a FlowJo 7.6 szoftverrel elemeztük.
2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) gyökfogó aktivitása. A CTPG-W szabadgyökfogó aktivitását DPPH szabadgyök-vizsgálattal határoztuk meg a közzétett protokoll szerint, kisebb módosítással, mivel a metanolt etanollal helyettesítették a DPPH feloldása érdekében (25,26). Állandósult állapotú mérésekhez 150 µl DPPH-t (100 mmol/l) etanolban kevertek össze különböző koncentrációjú CTPG-W-vel (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 és 600 µg/ml) 50 µl PBS-ben, és sötétben inkubáltuk 30 percig szobahőmérsékleten. Az 517 nm-en mért abszorbanciát CTPG-W jelenlétében és hiányában is kimutattuk. Összesen 50 µl C-vitamint használtunk pozitív kontrollként. A DPPH gyökfogó aktivitását a következő képlettel számítottuk ki: Scavenging ( százalék )=[1-(A sample-Ablank)/A0] x100, ahol az Ablank a kontroll abszorbanciája (DPPH nélkül), A minta a minta abszorbanciája, A0 pedig a PBS abszorbanciája DPPH-val.
Western blot analízis. Az Eca{{0}} sejteket CTPG-W-vel (0, 200, 600 µg/ml) vagy 0,4 százalékos DMSO-val kezeltük 24 órán át 37 °C-on 5 százalékos CO2 mellett. A következő kétszeri PBS-mosás után a sejteket Radioimmunoprecipitation Assay Lysis pufferben (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Peking, Kína) 20 percig jégen lizáltuk. 10, 000 xg 10 perces, 4 °C-on végzett centrifugálás után a felülúszót összegyűjtöttük, és a fehérjekoncentrációt bicinkoninsav kittel (Thermo Fisher Scientific, Inc.) detektáltuk a gyártó protokollja szerint. A Western blot analízist korábbi leírásunk szerint végeztük (24). A kaszpáz-7 (kat. sz. D120077), kaszpáz-8 (kat. sz. D155240), kaszpáz-9 (kat. sz. D220078), B-sejtes limfóma{ elleni antitestek {24}} (Bcl-2)-asszociált X (Bax) (kat. sz. D220073) és Bcl-2 (kat. sz. D260117), valamint anti-egér IgG-torma-peroxidáz (HRP) ) (kat. szám: D111050) és az anti-nyúl IgG-HRP-t (kat. szám: D110058) a BBI Life Sciences-től (Sanghaj, Kína) vásároltuk. A kaszpáz-3 (kat. sz. E-AB-10050) és az aktív kaszpáz-3 (kat. sz. E-AB-22115) elleni antitesteket az Elabscience-től vásároltuk ( Wuhan, Kína). Egyéb kaszpáz-7 (kat. sz. 9492), poli(ADP-ribóz) polimeráz (PARP) (kat. sz. 9542), citokróm c (kat. sz. AC909), c-Jun NH{ elleni antitestek A {48}}terminális kinázt (JNK) (kat. sz. 9252S) és az -aktint (kat. sz. 58169) a Cell Signaling Technology, Inc.-től (Danvers, MA, USA) szereztük be. Az összes elsődleges és másodlagos antitestet 1:1 arányban hígítottuk,000. Az elsődleges antitesteket 4 °C-on egy éjszakán át, a másodlagos antitesteket 37 °C-on 1 órán át inkubáltuk.
A célfehérjéket fokozott kemilumineszcenciás vizsgálati kittel (Beyotime Institute of Biotechnology) mutattuk ki, a gyártó protokollja szerint.
Statisztikai analízis. A statisztikai szignifikanciát Tukey post hoc teszttel végzett egyirányú varianciaanalízissel számítottuk ki, és az eredményeket GraphPad Prism 5.{2}} szoftverrel (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) elemeztük a kezelt és a kontrollcsoportok között. Minden adatot átlag ± standard deviációként adtunk meg. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Cistanche tubulosa feniletanoid glikozidok(CTPG)
Eredmények
A CTPG-W elnyomja az Eca-109 sejtek növekedését. A CTPG-W komponenseit HPLC-vel minősítették és mennyiségileg meghatározták (1. ábra), amelyeket az echinakozid és az akteozid standardjaival hasonlítottak össze. A csúcsretenciós idők és a csúcsterületek szerint a CTPG-W 39,16 százalék echinakozidot és 2,44 százalék akteozidot tartalmazott. Először is, a CTPG-W hatását az Eca-109 sejtek életképességére MTT vizsgálattal határoztuk meg. A CTPG-W-t DMSO-ban oldottuk fel 200 mg/ml koncentrációban, és 10% hővel inaktivált FBS-t tartalmazó RPMI{12}} tápközeggel hígítottuk a jelzett koncentrációig. Az Eca-109 sejteket CTPG-W-vel kezeltük, és a sejtek életképességét MTT-teszttel elemeztük a jelzett időpontokban. A CTPG-W kezelés dózis- és időfüggő módon jelentősen csökkentette az Eca-109 sejtek életképességét (P<0.001; fig.="" 2a).="" the="" morphology="" of="" eca-109="" cells="" was="" observed="" with="" an="" inverted="" fluorescence="" microscope="" (magnification,="" x200)="" following="" ctpg‑w="" treatment="" for="" 24="" h,="" which="" changed="" notably="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" with="" the="" cells="" shrinking="" and="" becoming="" round="" following="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 2b).="" these="" results="" indicate="" that="" ctpg-w="" suppresses="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells.="" the="" effect="" of="" ctpg-w="" on="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" was="" also="" detected="" with="" an="" mtt="" assay.="" ctpg-w="" significantly="" promoted="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="" 2c),="" indicating="" that="" it="" has="" no="" cytotoxic="" effect="" on="">
A CTPG-W apoptózist indukál az Eca-109 sejtekben. Annak vizsgálatára, hogy a CTPG-W gátolta-e az Eca-109 sejtek növekedését apoptózis vagy nekrózis kiváltása révén, a sejteket különböző koncentrációjú CTPG-W-vel kezeltük. 24 óra elteltével az Eca-109 sejtek apoptózisát és nekrózisát Annexin V/PI festéssel detektáltuk. A 3A. ábrán látható módon az Annexin V-/PI plusz sejteket nekrotikus sejtekként, az Annexin V plusz /PI plus és az Annexin V plusz /PI-sejteket pedig apoptotikus sejtekként kapuztuk. A CTPG-W elsősorban az Eca-109 sejtek apoptózisát indukálta dózisfüggő módon, bár a nekrotikus Eca-109 sejtek száma is szignifikánsan növekedett 600 és 800 µg/ml CTPG-W kezelés hatására (P<0.001 at="" 600="" µg/ml="" and=""><0.05 at="" 800="" µg/ml).="" consistently,="" the="" levels="" of="" pro-apoptotic="" bax="" and="" anti-apoptotic="" bcl-2="" in="" eca-109="" cells="" were="" upregulated="" and="" downregulated,="" respectively,="" upon="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 3b).="" the="" results="" indicated="" that="" ctpg-w="" primarily="" inhibited="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells="" through="" the="" induction="" of="">
A CTPG-W sejtciklus-leállást indukál az S-fázisban az Eca-109 sejtekben. A rákos sejtciklus megzavarása elnyomja a sejtnövekedést és elősegíti az apoptózist (27). A sejtciklus eloszlását Eca-109 sejtekben PI-festéssel detektáltuk 24 órás CTPG-W kezelést követően. Megfigyelték, hogy az S fázisban lévő sejtek növekedtek, a G0/G1 fázisban lévő sejtek pedig összességében szignifikáns csökkenést jeleztek a CTPG-W kezelés hatására (P<0.05; fig.="" 4),="" indicating="" that="" ctpg-w="" arrests="" the="" eca-109="" cell="" cycle="" at="" the="" s="">
A CTPG-W csökkenti a Δψm-et és indukálja a citokróm c felszabadulását. Apoptózis indukálható mitokondriális függő útvonalon (28, 29). A BCL-2 fehérjecsalád pro- és anti-apoptotikus tagjai fontos szerepet játszanak a mitokondriális membrán integritásának szabályozásában (30,31). 24 órás CTPG-W kezelést követően a Δψm-et JC-1 festéssel határoztuk meg. A JC-1 aggregátum (piros fluoreszcenciát észlel az FL-2-ben) monomerré bomlik (zöld fluoreszcencia az FL-1-ban), amikor a Δψm csökken (32). Amint az 5A. ábrán látható, az FL-1 plusz FL-2-/plus sejtek gyakorisága dózisfüggő módon jelentősen megnőtt, jelezve, hogy az Eca-109 sejtek Δψm-je csökkent. Az Eca-109 sejtekben a fluoreszcencia változásait fordított fluoreszcens mikroszkóppal is megfigyelték (5B. ábra). A CTPG-W növekvő koncentrációjával a vörös fluoreszcencia csökkent, a zöld fluoreszcencia pedig nőtt, ami összhangban van az áramlási citometriás adatokkal. Azt is megfigyelték, hogy a citokróm c szintje a citoszolban jelentősen megnőtt (5C. ábra), ami a Δψm csökkenés eredménye. Ez megerősíti az FL-1 plusz FL-2-/ plusz sejtek számának növekedéséből levont következtetést, miszerint a Δψm csökkent a CTPG-W kezelés hatására. Beszámoltak arról, hogy a JNK szabályozhatja a BCL-2 fehérjecsalád aktivációját, ami citokróm c (33-35) felszabadulását okozza. Azt is megállapították, hogy a JNK szintje jelentősen megnőtt a CTPG-W kezelést követően (5C. ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy a CTPG-W indukálhatja az Eca-109 sejtek apoptózisát egy mitokondriális függő útvonalon keresztül.
A CTPG-W hatása az intracelluláris ROS-képződésre. A ROS csökkentheti a Δψm-t, hogy apoptózist indukáljon (36). Annak vizsgálatára, hogy a CTPG-W képes-e növelni a ROS termelést, az Eca-109 sejteket különböző koncentrációjú CTPG-W-vel kezeltük. A sejteket a jelzett időpontokban összegyűjtöttük, és DCFH-DA-val festettük. Az intracelluláris ROS termelését Eca-109 sejtekben áramlási citometriával határoztuk meg. A 6A. ábrán látható módon a 800 µg/ml CTPG-W jelentősen növelte a ROS termelést 2-6 óráról, és csökkent 12-24 óráról. Ezenkívül a 400 µg/ml CTPG-W jelentősen megnövelte a ROS-termelést 12-24 órától kezdve. Ezenkívül a 200 µg/ml CTPG-W nem változtatta meg számottevően a ROS termelést. A ROS termelés dinamikus változásai összefüggésbe hozhatók az Eca-109 sejt apoptózisával. Azt is megállapították, hogy a CTPG-W szabad gyökfogó aktivitással rendelkezik (6B. ábra), ami összefüggésbe hozható a 800 µg/ml CTPG-W-vel 12 óra elteltével kezelt Eca{18}} sejtekben a csökkent ROS termeléssel.
A CTPG-W fokozza a kaszpáz-3, kaszpáz-7, kaszpáz-9 és a PARP aktivitását. A citokróm c felszabadulása a Δψm redukció következtében aktiválhatja a kaszpáz proteázokat, hogy apoptózist váltsanak ki (29, 30, 37). 24 órás CTPG-W kezelést követően Western blot analízissel kimutattuk a kaszpáz-3, 7, 8, 9 és PARP aktivációját. A kontrollhoz képest a hasított kaszpáz-9, a hasított kaszpáz-7, a hasított kaszpáz-3 és a hasított-PARP szintjei, de a hasított kaszpáz{{ szintjei nem. 20}}, a CTPG-kezelés dózisfüggő módon fokozta a szabályozást (7. ábra). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a CTPG-W csökkentette a Δψm-et és elősegítette a citokróm c felszabadulását, hogy aktiválja az Eca-109 sejtek apoptózisát kiváltó kaszpázokat.
Cistanche tubulosa kivonat
Vita
A hagyományos CHM a nyelőcsőrák sejtek apoptózisát indukálhatja különböző utakon, beleértve a külső halálreceptort, a belső mitokondriális és endoplazmatikus retikulum stresszútjait (29). Korábbi vizsgálatunk kimutatta, hogy a CTPG, mint a C. tubulosa fő összetevője, gátolta a melanoma B16-F10 sejtek növekedését azáltal, hogy mitokondriális függő útvonalon keresztül apoptózist indukál (24). Jelen tanulmányban a CTPG-W Eca-109 sejtekre kifejtett daganatellenes hatását vizsgáltuk, és megállapítottuk, hogy a CTPG-W elnyomja az Eca-109 sejtek növekedését, apoptózist indukált és sejtciklus leállást. csökkentette a Δψm-t, növelte a citokróm c felszabadulását és aktiválta a kaszpázokat. A CTPG és a CTPG-W apoptózist és sejtciklus-leállást indukálhat a rákos sejtekben. A pontos mechanizmusok azonban eltérőek a CTPG (26,64 százalék echinakozid, 10,19 százalék akteozid és 1,71 százalék izoakteozid) és a CTPG-W (39,16 százalék echinakozid és 2,44 százalék akteozid) komponensei miatt. A CTPG leállította a B16-F10 sejteket a G0/G1 fázisban, de a CTPG-W az Eca-109 sejteket az S fázisban (24). A ROS termelést dózisfüggően növelte a CTPG, de időfüggő változást jelez a nagy dózisú CTPG-W, amely a CTPG-W kezelés kezdetén jelentősen megnőtt (2-6 óra), ill. szignifikánsan csökkent 12 óra elteltével a kontrollhoz képest. Ennek lehetséges oka az, hogy a CTPG-W fő összetevője az echinakozid. Számos tanulmány számolt be arról, hogy az echinakozid gátolhatja a ROS termelést és a ROS által kiváltott apoptózist, hogy kifejtse neuroprotektív és öregedésgátló hatását (38-40). Hasonlóképpen, a szabad gyökfogó aktivitást a jelen tanulmányban is megfigyelték. Ezért azt feltételezték, hogy egyes komponensek, beleértve a verbaszkozidot, az izo-verbaszkozidot és a szalidrozidot nagy dózisú CTPG-W-ben, azonnal ROS képződést válthatnak ki, ami az Eca-109 sejtek apoptózisát okozza (41,42), majd A ROS-t az echinakozid megtisztította. A CTPG és a CTPG-W ROS-termelésében mutatkozó különbségek másik lehetséges oka az, hogy ebben a vizsgálatban és egy korábbi vizsgálatban különböző sejtvonalakat használtak (24). Dong és mtsai (43) arról számoltak be, hogy az echinacoside indukálhatja a humán SW480 vastagbélráksejtek apoptózisát azáltal, hogy oxidatív DNS-károsodásokat generál a ROS-szint növekedése nélkül.
A CTPG-W kezelés csökkentette a Δψm-et és citokróm c felszabadulását idézte elő, ami elősegíti a kaszpáz-9 hasadását (28). A hasított kaszpáz-9 szintje következetesen megemelkedett a CTPG-W kezelés hatására. Ezt követően az aktív kaszpáz-9 aktiválhatja a kaszpázt-3, hogy apoptózist indukáljon (44). A hasított kaszpáz{10}} szintjét szintén felfelé szabályozta a CTPG-W kezelés. A CTPG-W azonban nem aktiválta a kaszpázt-8, ami azt jelzi, hogy a külső halálreceptor útvonal nem vett részt a CTPG-W által kiváltott apoptózisban. Ezek a megfigyelések azt mutatják, hogy a CTPG-W az Eca-109 sejtek apoptózisát indukálja egy mitokondriális függő útvonal aktiválása révén.
A PARP fontos szerepet játszik a genomiális stabilitásban, és az aktív kaszpázok, különösen a kaszpáz-3 és a -7 hasíthatják (45). Megállapítást nyert, hogy a CTPG-W kezelés aktiválta a kaszpázt-3 és -7, amelyek hasíthatják a PARP-t, így gátolva a DNS-javítást és apoptózist okozhatnak.
A CTPG-W dózis- és időfüggően is gátolja a humán hepatocelluláris karcinóma BEL-7404 sejtek növekedését (nem publikált adatok). Bár a CTPG-W gátolja az Eca-109 és BEL-7404 sejtek növekedését, elősegíti a lépsejtek szaporodását, ami a CTPG-W poliszacharidtartalmának (~50 százalék) lehet az oka (46). ). Hasonlóképpen, számos tanulmány beszámolt arról, hogy a poliszacharidok elősegíthetik a lépsejtek proliferációját (46-49). Az egérmodellben megállapították, hogy a CTPG-W szignifikánsan növelte a lépindexet a kontrollcsoporthoz képest, de nem befolyásolta a testtömeget és a többi szervindexet, beleértve a szívet, a májat, a vesét és a tüdőt (nem publikált adatok), jelezve, hogy a CTPG-W-nek nincs citotoxikus hatása a normál sejtekre.
Az adatok együttesen azt mutatták, hogy a CTPG-W gátolja az Eca-109 sejtek növekedését azáltal, hogy mitokondriális függő útvonalon keresztül apoptózist indukál.
a cistanche előnyei: apoptózis elleni
Köszönetnyilvánítás
A szerzők szeretnének köszönetet mondani Dr. Jianhua Yangnak (Baylor College of Medicine) a kézirat csiszolását.
Finanszírozás
Ezt a tanulmányt a 13. ötéves terv a kulcsfontosságú tudományági biológiai licitprojekthez (17SDKD0202 támogatás), a Xinjiang Normal University és a Xinjiang-i Speciális Környezeti Biodiverzitás Alkalmazási és Szabályozási Laboratóriuma támogatta (XJTSWZ-2017-04 számú támogatás). a JL-nek és a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítványnak (31760260. sz. támogatás) az XW-nek.
Az adatok és anyagok elérhetősége
A jelen tanulmány során felhasznált és elemzett adatok és anyagok ésszerű kérésre elérhetők a megfelelő szerzőtől.
A szerzők hozzászólásai
CF, AA, YY és QC végezte a kísérleteket. LX, JLv és XW elemezte az adatokat és az elkészített ábrákat. JinyuL és JinyaoL tervezte a projektet és megírta a kéziratot.
Etikai jóváhagyás és hozzájárulás a részvételhez
Valamennyi állatkísérletet jóváhagyott a Xinjiangi Kulcsfontosságú Biológiai Erőforrások és Géntechnológiai Laboratórium Állatkísérletek Etikai Bizottsága (jóváhagyás: BRGE-AE001; Xinjiang University).
A beteg hozzájárulása a közzétételhez
Nem alkalmazható.
Versengő érdekek
A szerzők kijelentik, hogy nincsenek egymással versengő érdekeik.
Hivatkozások
Wu CR, Lin HC és Su MH: Megfordítás vizes útonCistanche tubulosa kivonataiAz Alzheimer-kórhoz hasonló patkánymodell viselkedési hiányosságaiból: Relevancia az amiloid lerakódás és a központi neurotranszmitter funkció szempontjából. BMC Complement Altern Med 14: 202, 2014.
Li J, Aspire A, Gao L, Huo S, Luo J és Zhang F:Fenil-etanol-glikozidok a Cistanche tubulosa-bólgátolja a B16-F10 sejtek növekedését mind in vitro, mind in vivo azáltal, hogy mitokondriumfüggő útvonalon keresztül apoptózist indukál. J Cancer 7: 1877-1887, 2016.
Brand-Williams W, Culver ME és Berset C: Szabadgyökös módszer alkalmazása az antioxidáns aktivitás értékelésére. LWT-Food Sci Technol 28: 25-30, 1995.