Az echinakozid véd a 6-hidroxidopamin által kiváltott mitokondriális diszfunkció és a PC12-sejtek gyulladásos válaszai ellen a ROS-termelés csökkentésével

Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yue-Hua Wang,1,2 Zhao-Hong Xuan,3 Shuo Tian,1 és Guan-Hua Du1,2

A Parkinson-kór (PD) egy neurodegeneratív rendellenesség, amelyet a substantia nigra dopaminerg (DA) neuronjainak fokozatos elvesztése jellemez. A mitokondriális diszfunkció és a gyulladásos válaszok szerepet játszanak a PD sejtkárosodásának mechanizmusában. 6-A hidroxidopamin (6-OHDA), egy dopamin analóg, kifejezetten károsítja a dopaminerg neuronokat.Echinakozid(ECH) egy feniletanoid-glikozid, amelyet a szárból izolálnakCistanche salsa, amely számos neuroprotektív hatást mutat a korábbi vizsgálatokban. Jelen vizsgálat célja az volt, hogy megvizsgálja az 6-OHDA által kiváltott neurotoxicitás elleni hatását és lehetséges mechanizmusait PC12 sejtekben. Az eredmények azt mutatták, hogy az 6-OHDA csökkentette a sejtek életképességét, csökkentette az oxidációs-redukciós aktivitást, csökkentette a mitokondriális membránpotenciált, és mitokondriumok által közvetített apoptózist indukált a kezeletlen PC12 sejtekhez képest. Azonban,echinakozidkezelés jelentősen gyengítette ezeket az 6-OHDA által kiváltott változásokat. Továbbá,echinakozidjelentősen enyhítheti az 6-OHDA által kiváltott gyulladásos reakciókat is. A további kutatások azt mutattákechinakozidcsökkentheti az 6-OHDA által kiváltott ROS-termelést PC12 sejtekben. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a mögöttes mechanizmus aechinakozidAz 6-OHDA által kiváltott neurotoxicitás ellen a ROS termelés csökkentésével a mitokondriális diszfunkció és a gyulladásos válaszok csillapítása is szerepet játszhat.

1. Bemutatkozás

Parkinson-kór (PD)egy neurodegeneratív betegség, amelyet a substantia nigra pars compacta dopamin neuronjainak lassan progresszív degenerációja jellemez [1]. Bár a PD neuropatológiai jellemzői jól leírtak, etiológiája továbbra is tisztázatlan. Számos megfigyelés arra utal, hogy a mitokondriális diszfunkció szerepet játszik a PD patogenezisében és a dopaminerg neuronok degenerációjában [2, 3]. A mitokondriumok sok redox enzimet tartalmaznak, és az oxidatív foszforiláció természetesen előforduló elégtelensége reaktív oxigénfajtákat (ROS) hoz létre [4]. A közelmúltban egyre több ember- és állatkísérletből származó bizonyíték arra utal, hogy a neuroinflammáció is fontos szerepet játszik a PD neuronvesztésében [5].

6-A hidroxidopamin (6-OHDA) specifikus a dopaminerg neuronokra intrastriatális rágcsálómodellekben és egyes sejtekben [6–11]. A PC12 sejt a PD-kutatás népszerű sejtmodelljévé vált, mivel ez a sejtvonal számos DAerg neuron tulajdonsággal rendelkezik. In vitro modellként használták a PD tanulmányozására, valamint a védő és terápiás szerek hatásának meghatározására. Az echinakozid (1. ábra) egy fenil-etanol-glikozid, amelyet a szárból izolálnak és tisztítanak.Cistanche salsa[12], egy Északnyugat-Kínában honos élősködő növény, amelyet az echinakozid kísérleti alapjául szolgáló mechanizmusként használnak a PC12-sejtek 6-OHDA-indukálta károsodása ellen.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Anyagok. Az echinakozidot a National Institutes for Food and Drug Controltól (Peking, Kína) szereztük be. Az RPMI-1640 és a magzati szarvasmarha-szérum a Gibco-tól származott

(Grand Island, NY, USA). Az 6-OHDA, MTT, 2,7-diklór-dihidrofluoreszcein-diacetát, propidium-jodid (PI) és resazurin a Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO, USA) vásárolt. Az ATP biolumineszcens vizsgálati készletet a Promegától (Madison, USA) szereztük be. Az 5,5,6,6 -tetraklór-1,1,3,3 -tetraetil-benzimidazolil-karbocianin-jodid (JC-1) vizsgálati készletet a Beyotime Institute of Biotechnology cégtől szereztük be (Haimen, Jiangsu, Kína). A citokróm C ELISA készletet és az Ac-DVD-AMC fluorogén szubsztrátot az Invitrogentől (Carlsbad, CA, USA) szereztük be. Az IL-1 és IL-6 ELISA készleteket a Boster Bio-engineer Limited Company-tól szereztük be (Wuhan, Kína). A Spectramax M5 mikrolemez-leolvasót a Molecular Devices cégtől (Sunnyvale, CA, USA) vásároltuk.

2.2. Sejttenyésztés és kezelés. A PC12 sejteket 10 százalék lószérummal és 5 százalék magzati szarvasmarhaszérummal kiegészített RPMI-1640-ban növesztettük. A körülményeket 37 °C-on tartottuk 5 százalék CO2-t tartalmazó párásított atmoszférában [19]. A sejteket 96-lyukú lemezekre szélesztettük 2 × 105 sejt/ml sűrűséggel. 80 százalékos összefolyás után a sejteket különböző koncentrációjú echinakoziddal előinkubáltuk szérummentes RPMI{15}} tápközegben 1 órán át. Ezután 6-OHDA-t adtunk a lyukakba 100 M végső koncentrációban, és további inkubálást végeztünk. A kezelés után mikroszkóp alatt morfológiai változásokat figyeltünk meg. A sejtek életképességét MTT vizsgálattal értékelték [19]. Röviden, a kezelés után 0,5 mg/ml végkoncentrációjú MTT-t adtunk minden egyes lyukhoz, és 4 órán át 37 °C-on inkubáltuk.

2.3. A PC12 sejtek morfológiai változásai és életképességi vizsgálata. A kezelés után mikroszkóp alatt morfológiai változásokat figyeltek meg. A sejtek életképességét MTT vizsgálattal értékelték [19]. Röviden, a kezelés után 0,5 mg/ml végső koncentrációjú MTT-t adtunk minden egyes lyukba, és 4 órán át 37 °C-on inkubáltuk. Ezután a felülúszót eltávolítottuk, és a formazán terméket 100 liter dimetil-szulfoxidban oldottuk fel keverés közben 15 percig mikrotiterlemez rázógépen, és az abszorbanciát 570 nm-en leolvastuk Spectramax M5 mikrolemez-leolvasóval. Bizonyítékokon alapuló kiegészítő és alternatív gyógyászat

2.4. Intracelluláris ATP szint vizsgálat. A celluláris ATP szintet ATP biolumineszcens assay kittel mértük a gyártó utasításai szerint. A lumineszcenciát 100 l luciferin és luciferáz hozzáadása után egy mikrolemez-leolvasóval, lumineszcencia üzemmódban követtük [20].

2.5. A mitokondriumok oxidációs-redukciós aktivitásának mérése Resazurinnal. A kezelés után 5 M végkoncentrációjú resazurint adtunk a lyukakba, és a fluoreszcencia intenzitását 530 nm-es gerjesztésnél és 590 nm-es emissziónál vizsgáltuk [21].

2.6. A mitokondriális membránpotenciál mérése JC-vel-1. A mitokondriális membránpotenciált a JC-1 assay kit segítségével mérték a gyártó utasításai szerint. A kezelés után a táptalajt eltávolítottuk, és JC-1 oldattal töltöttük fel 15 percig 37°C-on, sötétben. A vörös/zöld arány fluoreszcencia intenzitását 490 nm-es gerjesztésnél és 530 nm-es emissziónál (zöld fluoreszcens monomerek) és 590 nm-es emissziónál (vörös fluoreszcens aggregátumok) határoztuk meg [22].

2.7. A citokróm C felszabadulás mennyiségi meghatározása. A citoszol citokróm C szintjét ELISA kittel mértük a gyártó utasításai szerint [23]. Röviden, a kezelés után a sejteket lizáltuk és 1000 g-vel 15 percig centrifugáltuk, majd a felülúszót citoplazmatikus frakcióként összegyűjtöttük, és citokróm C felszabadulás mérésére használtuk.

2.8. A kaszpáz-3 aktivitás meghatározása. A kaszpáz-3 aktivitást a hivatkozások szerint végeztük módosítással [24]. Röviden, a kezelés után a lízispuffert minden lyukba hozzáadtuk, majd centrifugáltuk 12 000 g-vel 10 percig. A kaszpáz-3 aktivitását a kapott felülúszókban az Ac-DVD-AMC fluorogén szubsztrát proteolitikus hasításának mérésével tesztelték 380 nm-es gerjesztési hullámhosszú és 460 nm-es emissziós hullámhosszon.

2.9. Áramlási citometriai vizsgálat PC12 sejtekben. A kezelés után a sejteket tripszinnel kezeltük, kétszer mostuk PBS-sel, centrifugáltuk 1000 fordulat/perc sebességgel 5 percig, majd 70%-os etanollal fixáltuk egy éjszakán át 4°C-on. A sejteket centrifugáltuk, és kétszer mostuk PBS-sel, újraszuszpendáltuk PBS-ben (50 g/ml RNázA-t tartalmazott), PI-vel festettük 10 M végső koncentrációban 30 percig szobahőmérsékleten, sötétben, és áramlási citométerrel 488 °C-on leolvastuk. nm-es gerjesztés [10].

2.10. Az IL-1 és IL-6 szint mérése ELISA vizsgálattal. A tenyésztett PC12 sejttáptalajt a kezelés után összegyűjtöttük, és az IL-1 és IL-6 koncentrációkat a kereskedelemben kapható ELISA kitekkel mértük a gyártó protokollja szerint.

2.11. Az intracelluláris reaktív oxigénfajok szintjének meghatározása. Az 6-OHDA-val végzett inkubálás után a sejteket 10 M H2DCFH-DA-val töltöttük fel 30 percig 37 °C-on, sötétben. A DCF fluoreszcencia intenzitását gerjesztésnél mértük

Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine 495 nm hullámhossz és 530 nm emissziós hullámhossz mikrolemez-leolvasón [25].

2.12. Statisztikai analízis. Minden adatot átlag ± SD-ben fejezünk ki. Az eredmények statisztikai elemzését egytényezős varianciaanalízissel (ANOVA), majd -teszttel végeztük. A statisztikai szignifikancia elfogadása <>

3. Eredmények

3.1. Az echinakozid hatása a morfológiára és a sejtek életképességére az 6-OHDA által károsított PC12-sejtekben. Amint az a 2(A) ábrán látható, a PC12 sejtek életképessége nem mutatott szignifikáns különbséget az echinakozid kezelés 0,1-10 M koncentrációja mellett.

24 óra. Amint a 2(B) ábrán látható, a csak 6-OHDA-val végzett kezelést követő 24 órán belül a PC12 sejtek többsége morfológiai változásokon ment keresztül, mint például a membrán felhólyagosodása és a sejtzsugorodás. Az echinakoziddal végzett kezelés megvédte a sejteket az 6-OHDA károsodástól. Az MTT vizsgálat kimutatta, hogy a PC12 sejtek kezelése önmagában 6-OHDA-val körülbelül 25 százalékkal csökkentette a sejtek túlélését 24 órán belül, míg a {{10}}.1 M, 1 M, és 10 M echinakozid az 6-OHDA által közvetített citotoxicitás csökkenését mutatta (mind <0,01, 2(c)="">

3.2. Az echinakozid hatása az 6-OHDA által kiváltott mitokondrium-diszfunkcióra PC12 sejtekben. A sejtek ATP-szintje szignifikánsan csökkent 24 órás 100 M 6-OHDA-val végzett inkubációt követően, míg az 1 Mand 10 M echinakoziddal való együttes kezelés enyhítette az 6-OHDA által közvetített ATP-t, csökkentette az anabolikus változásokat a PC12 sejtekben . Az eredmények azt mutatták, hogy az 1 Mand 10 M echinakoziddal történő együttes kezelés jelentősen csökkentheti a mitokondriumok 6-OHDA által kiváltott oxidációs-redukciós aktivitásának károsodását (mindkettő <0,05 és="" 3(b)="">

A 3(c) ábrán látható, hogy a 24 órás 100 M 6- OHDA-val végzett kezelés a mitokondriális membránpotenciál jelentős csökkenését eredményezte a kezeletlen csoporthoz képest (< {="" {11}}.01).="" a="" mitokondriális="" membránpotenciál="" 6-ohda="" által="" kiváltott="" csökkenését="" azonban="" szignifikánsan="" csökkentette="" a="" 0,1="" m,="" 1="" m="" és="" 10="" m="" echinakoziddal="" történő="" együttes="" kezelés="" (mind=""><>

3.3. Az echinakozid anti-mitokondriális apoptózisa PC12 sejtekben az 6-OHDA neurotoxicitás ellen. Az eredmények azt mutatták, hogy az 6-OHDA-expozíció a citoszol citokróm C 167%-os növekedését eredményezte a kezeletlen csoporthoz képest (< 0.{{10}}1).="" az="" echinakozid="" 0,1="" m,="" 1="" m="" és="" 10="" m="" dózisban="" jelentősen="" csökkentheti="" az="" 6-ohda="" által="" kiváltott="" citokróm="" c="" felszabadulását="" a="" citoszolba="">< 0,05,="">< 0,01="" és="">< 0,01,="" ill.;="" 4(a)="">

A kaszpáz{{0}} aktivitás körülbelül 3.3--szeresére nőtt a kezeletlen csoporthoz képest az 6-OHDA expozíció után ( < 0.01).="" ).="" ezzel="" szemben="" az="" 1="" m,="" illetve="" 10="" m="" echinakoziddal="" végzett="" kezelés="" jelentős="" csökkenést="" mutatott="" a="" kaszpáz-3="" aktivitásában="" az="" 6-ohda-val="" kezelt="" sejtekhez="" képest="" (mind="">< 0,05,="" mind="" a="" 4.="" ábra).="" b)).="" a="" pi="" a="" membrán="" permeabilitás,="" és="" általában="" kizárják="" az="" életképes="" sejtekből.="" ezért="" gyakran="" használják="" az="" elhalt="" sejtek="" azonosítására="" egy="" populációban.="" az="" eredmények="" azt="" mutatták,="" hogy="" az="" apoptózis="" aránya="" szignifikánsan="" megnőtt="" a="" 100="" m="" 6-ohda-val="" végzett="" 24="" órás="" inkubációt="" követően,="" míg="" az="" 1="" és="" 10="" m="" echinakoziddal="" történő="" együttes="" kezelés="" jelentősen="" csökkentette="" az="" 6-ohda="" által="" kiváltott="" apoptózist="">< 0,05,="">< 0,01,="" ill.="" 4(c)="">

3.4. Az echinakozid gyulladáscsökkentő hatása az 6-OHDA által kiváltott PC12 sejtekben. Az eredmények azt mutatták, hogy az 6-OHDA expozíció az IL-1 szintjének növekedését eredményezte a kezeletlen csoporthoz képest (< 0.05;="" 4(a)="" ábra).="" 10="" m="" echinakozid="" azonban="" jelentősen="" csökkentheti="" az="" 6-ohda="" által="" kiváltott="" il-1="" felszabadulását="">< 0,05;="" 5(a)="">

Az IL{{0}} szintje szintén szignifikánsan megemelkedett a kezeletlen csoporthoz képest (< 0.01).="" a="" 0,1,="" 1="" és="" 10="" m="" echinakoziddal="" végzett="" együttes="" kezelés="" azonban="" szignifikánsan="" csökkentette="" az="" il-6="" felszabadulását="" az="" 6-ohda-val="" kezelt="" sejtekhez="" képest="" (mindkettő=""><0,05 és="" 5(b)="">

3.5. Az ECH hatása az 6-OHDA által kiváltott ROS-termelésre PC12-sejtekben. Az 6-OHDA-val kezelt sejtek az intracelluláris ROS szignifikáns (körülbelül 1.4--szeres) növekedését mutatták a kezeletlen sejtekhez képest (< 0.01).="" ezt="" a="" növekedést="" szignifikánsan="" csökkentette="" a="" 0,1,="" 1="" és="" 10="" m="" echinakoziddal="" való="" együttes="" inkubáció="">< 0,05,="">< 0,01,="" illetve="">< 0,01;="" 6.="" ábra)="">

4. Megbeszélés

Az echinakozid a fenil-etanoid-glikozidok egyik fő összetevője, amelyet egy híres, hagyományosan leírt echinakozidból extrahálnak, és antiapoptotikus és neuroprotektív tulajdonságokkal rendelkezik a neurodegeneratív betegségekben [18]. In vivo tanulmány arról számolt be, hogy az echinakozid neuroprotektív hatást és viselkedésbeli javulást mutatott az MPTP-indukálta dopaminerg neuronális károsodás egérmodelljében, míg a további vizsgálatok kimutatták, hogy az echinakozid csökkentette a kaszpáz-3 és a kaszpáz-8 aktiválását az MPP plusban. kisagyi szemcseneuronok -indukált apoptózisa [16]. Egy másik in vivo tanulmány az echinakozid neuroprotektív hatásáról számolt be az 6-OHDA által megsérült striatális dopaminerg neuronokon [17]. Az e hatások hátterében álló sejtes és molekuláris mechanizmusok azonban nem teljesen ismertek, különösen a mitokondriális funkcióra és a gyulladásos válaszokra gyakorolt ​​hatásuk miatt. Tehát jelenlegi tanulmányunk az echinakozid hatását vizsgálta a mitokondriális funkcióra és a gyulladásos válaszokra, hogy megvilágítsa a PD elleni mechanizmusát. Az eredmények először is azt mutatták, hogy az echinakozid szignifikánsan enyhítette az 6-OHDA által kiváltott neurotoxicitást a PC12 sejtekben a mitokondriális funkció védelmével és a gyulladás gátló hatásával.

A mitokondriális diszfunkció régóta közrejátszik a nigrostriatális dopaminerg neuronok halálában Parkinson-kórban és annak kísérleti modelljeiben [26]. A mitokondriumok mélyen részt vesznek a reaktív oxigénfajták (ROS) előállításában a légzési lánc elektronhordozóin keresztül neurodegeneratív betegségekben [27]. A biológiai rendszerekben a normál anyagcsere során sokféle ROS termelődik, de felhalmozódásuk túlmutat.

A szükséges mennyiség károsíthatja a lipideket, fehérjéket és nukleinsavakat.

6-Az OHDA, egy katekolamin analóg, a substantia nigra neuronok specifikus degenerációját okozza. Az 6-OHDA által kiváltott neurotoxicitás részben a ROS termelésnek köszönhető [28–32].

Az OHDA idegsejtek halálához vezet a mitokondriumok működésének befolyásolásával, beleértve az ATP termelés csökkenését, a ROS metabolizmus zavarát és az apoptózis indukálását [10, 33, 34]. Jelen tanulmányunkban eredményeink azt is kimutatták, hogy az 6-OHDA károsította a mitokondriális oxidatív-redukciós funkciót, csökkentette a mitokondriális membránpotenciált, mitokondriumok által közvetített apoptózist indukált, és növelte a ROS termelést PC12 sejtekben.

A rezazurin egy fluoreszcens indikátor, amely csak a molekuláris oxigén és a citokróm-oxidáz végső redukciója között van. Ezért a resazurin oxidatív-redukciós potenciálja lehetővé teszi, hogy a légzési lánc majdnem teljes mértékben működjön, ami pontosabb és érzékenyebb jelzést ad a mitokondriális működésről. A JC-1 egy membránpotenciál-érzékeny szonda, amely a belső mitokondriális membránon lokalizálódik, ahol a mitokondriális membránpotenciál alapján monomereket (zöld) vagy aggregátumokat (piros) képez. Így a resazurin és a JC-1 értékes analitikai eszközök a mitokondriális működés vizsgálatához [35]. Jelen tanulmány kimutatta, hogy a mitokondriális oxidatív-redukciós aktivitás és a mitokondriális membránpotenciál csökkenése fontos szerepet játszhat az 6-OHDA által kiváltott dopaminerg neurotoxicitásban. Eredményünk mitokondriális oxidatív-redukciós aktivitást és mitokondriális membránpotenciált is mutatott. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a mitokondriális diszfunkció javítása jobb módja lehet a PD-vel általában összefüggő progresszív dopaminerg neurodegeneráció lassításának.

Általánosan elfogadott, hogy az 6- OHDA által kiváltott sejtapoptózist mitokondriális diszfunkció közvetít, amelyet citokróm C felszabadulása és kaszpáz-3 aktiválása jellemez [36]. Egy apoptotikus inger kiváltja a citokróm C felszabadulását a mitokondriumokból a citoszolba, ahol azután aktiválja a kaszpázt-3 és más, áramlási irányban lévő kaszpázokat. Jelen tanulmányban az eredmények azt mutatták, hogy a 100 M 6-OHDA-nak kitett PC12 sejtek fokozott citokróm C felszabadulását és kaszpázfüggően gátolták a citokróm C felszabadulását és a kaszpáz- 3 aktiválódását. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az echinakozid gátolhatja a mitokondriumok által közvetített apoptózist azáltal, hogy csökkenti a citokróm C felszabadulását a mitokondriumokból a citoszolba és a kaszpáz-3 aktiválódásába.

A gyulladás a Parkinson-kóros agy neuropatológiai jellemzője, és a betegség kísérleti modelljeiben is. A gyulladás csökkentésére és e gyulladásos faktorok termelésének gátlására irányuló terápiás stratégiák ígéretes neuroprotektív stratégia lehet a Parkinson-kór és a kapcsolódó állapotok kezelésében [37]. Számos, az agy-gerincvelői folyadékban és a Parkinson-kóros betegek posztmortem elemzése során végzett tanulmányok is kimutatták a citokinek, például az interleukin-1 (IL-1) és az interleukin-6 (IL{{4}) szintjét. }), ami az aproinflammatorikus válasz aktiválására utal [38, 39]. A jelen tanulmányban az eredmények azt mutatták, hogy a PC12 sejtekben a 100 Mof{8}}OHDA által kiváltott IL-1 és IL-6 felszabadulást mutatták ki. Az echinakoziddal végzett kezelés azonban dózisfüggően gátolja az 6-OHDA által kiváltott IL-1 és IL-6 felszabadulását. Az eredmények arra utalnak, hogy a gyulladásos válaszok csökkentése is szerepet játszik az echinakozid 6-OHDA által kiváltott neurotoxicitás elleni mechanizmusában.

Összefoglalva, ennek a kutatásnak az eredményei azt mutatták, hogy az echinakozid képes volt blokkolni az 6-OHDA által kiváltott neurotoxicitást PC12 sejtekben, és a mechanizmusok összefüggésbe hozhatók a mitokondriális védelemmel és a gyulladáscsökkentő hatással a ROS termelés csökkentésével. Az ebben a munkában közölt információk hasznosak lesznek az echinakozid PD elleni mechanizmusának tisztázásához. Arra a következtetésre jutottak, hogy az echinakozid ígéretes terápiás lehetőség lehet a PD megelőzésében és kezelésében.

Összeférhetetlenség

A szerzők nem nyilatkoztak összeférhetetlenségről

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (81473383) és a National Science and Technology Major Project (2012ZX09103101-078; 2013ZX09103-001-008; és 2013ZX09102106) támogatásai támogatták.