A Cistanche Deserticola kivonat fokozza a csontképződést az oszteoblasztokban{0}}I. rész

Kapcsolatba lépni:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Te-Mao Li^aet a

Absztrakt
Célkitűzések Vizsgáltuk a hatásátCistanchedeserticolaMa. (CD) bekapcsolvacsontképződéstenyésztett osteoblastok által. Módszerek A CD in vitro hatásainak vizsgálatára mineralizált csomóképződési vizsgálatot használtunk(Cistanchedeserticola)továbbcsontképződés. Az alkalikus foszfatáz (ALP), a csontmorfogenetikai fehérjék (BMP)-2 és az oszteopontin (OPN) mRNS expresszióját kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakcióval elemeztük. A CD hatásmechanizmusa(Cistanchedeserticola)Az extraktumot Western-blot módszerrel vizsgáltuk. A CD in vivo csontritkulásellenes hatása(Cistanchedeserticola)A kivonatot petefészek-eltávolított egereken értékeltük.
Kulcsfontosságú leletek

CD(Cistanchedeserticola)a kivonat nem volt hatással a tenyésztett osteoblastok proliferációjára, migrációjára vagy sebgyógyulására, de növelte az ALP-t, a BMP-t{0}} és az OPN-mRNS-t és a csont mineralizációját. A mitogén aktivált protein kináz (MAPK) vagy a nukleáris faktor (NF)-kB inhibitorok csökkentették a CD-t(Cistanchedeserticola)kivonat által kiváltottcsontképződésés ALP, BMP-2 és OPN kifejezés. Azonban CD(Cistanchedeserticola)kivonat nem befolyásolta az oszteoklasztogenezist. Ezen kívül CD(Cistanchedeserticola)A kivonat in vivo megakadályozta az ovariectomia által kiváltott csontvesztést.
Következtetések

CD(Cistanchedeserticola)regény lehetcsontképződéscsontritkulás kezelésére szolgáló szer.

Kulcsszavakcsontképződés; Cistanchedeserticola; kínai gyógynövény; oszteoblasztok

Cistanche deserticolaarra jócsontképződés

Bevezetés

A csont több sejttípusból álló összetett szövet, amely folyamatos megújulási és helyreállítási folyamaton megy keresztül, amelyet „csont-remodellingnek” neveznek. A csontok átalakulásáért felelős két fő sejttípus az oszteoklasztok, amelyek felszívják a csontot, és az osteoblastok, amelyek új csontot képeznek. A csontok átalakulását számos szisztémás hormon (pl. parathormon, 1, 25-dihidroxi-D3-vitamin, nemi hormonok és kalcitonin) és helyi tényezők (pl. nitrogén-monoxid, prosztaglandinok, növekedési faktorok és citokinek) szabályozzák.[1] Csontritkulás akkor következik be, ha a csont felszívódása és képződése nem koordinált, és a csontok lebontása meghaladja a csontépítést.[2] A csontritkulás jelenlegi kezelési módjai közé tartoznak a biszfoszfonátok, a kalcitonin és az ösztrogén, amelyek olyan csontreszorpció-gátlók, amelyek az oszteoklasztok aktivitásának gátlásával fenntartják a csonttömeget.[3] Azonban ezeknek a gyógyszereknek a csonttömeg növelésére vagy helyreállítására gyakorolt ​​hatása viszonylag csekély, természetesen nem több, mint évi 2 százalék.[3] Ezért szükség van olyan csontépítő szerekre, mint például a teriparatid, amelyek stimulálják az újcsontképződésés korrigálja a trabekuláris mikroarchitektúrában a kialakult osteoporosisra jellemző változást.[4,5] Mivel az újcsontképződéselsősorban az oszteoblasztok funkciója, azok a szerek, amelyek az oszteoblaszt vonalba tartozó sejtek proliferációját fokozzák, vagy az oszteoblasztok differenciálódását idézik elő, fokozhatják a csontképződést.[5,6]
Bár az oszteoporózis mechanizmusa továbbra is tisztázatlan, valószínűleg a csontnövekedési faktorok, például a csontmorfogenetikai fehérjék (BMP-k) csökkent elérhetőségével vagy hatásaival állnak összefüggésben.[7] A BMP-ket, amelyek szerkezetileg rokonok a transzformáló növekedési faktor-b szupercsaláddal, eredetileg méhen kívüli indukáló képességük alapján azonosították.csont képződésrágcsálókban.[8] A BMP-k fontos szerepet játszanakcsontképződésvalamint a csontsejtek differenciálódása az alkalikus foszfatáz (ALP) aktivitásának, valamint a proteoglikán, kollagén és oszteopontin (OPN) szintézisének stimulálásával.[9] Egy nemrégiben készült tanulmány összefüggést talált a csontritkulás és a BMP-2, ALP és OPN gének specifikus polimorfizmusai között, ami arra utal, hogy ezek összefüggésben állnak az oszteoporózis kialakulásával.[10]

CistanchedeserticolaMa. (Orobanchaceae; rövidítve CD)(Cistanchedeserticola)Kínában őshonos gyógynövény, és nyugtató, fájdalomcsillapító és immunstimuláló tulajdonságai miatt széles körben használják a hagyományos orvoslásban terápiás szerként.[11] A modern farmakológiai vizsgálatok kimutatták, hogy a CD(Cistanchedeserticola)a kivonatok serkenthetik az immunitást,[12] megköthetik a szabad gyököket[13], és növelhetik a szuperoxid-diszmutáz aktivitását.[14] A gyulladáscsökkentő és antioxidáns szerek növelik a csontritkulás kezelésének lehetőségétcsont képződésés/vagy a csontreszorpció elnyomása.[15,16] A CD hatása azonban(Cistanchedeserticola)a csontsejtek működését még nem határozták meg. Itt közöljük azt a CD-t(Cistanchedeserticola)kivonat nem befolyásolta a tenyésztett oszteoblasztok proliferációját, migrációját vagy sebgyógyító aktivitását, de növelte az ALP, BMP-2 és OPN expresszióját és a csont mineralizációját. Emellett kimutattuk, hogy a mitogén által aktivált protein kináz (MAPK) és a nukleáris faktor (NF)-kB jelátviteli útvonalak szerepet játszhatnak a génexpresszió és a csont mineralizáció CD-közvetített növekedésében. Ezzel szemben a CD(Cistanchedeserticola)A kivonat nem gátolta az oszteoklasztogenezist in vitro. Nevezetesen az egerek kezelése CD-vel(Cistanchedeserticola)A kivonat in vivo megakadályozta az ovariectomia által kiváltott csontvesztést. Adataink tehát arra utalnak, hogy a CD(Cistanchedeserticola)serkentésére használhatócsontképződéscsontritkulás kezelésére.

Cistanche deserticolafokozza az immunitást

Anyagok és metódusok

Cistanche deserticola kivonat és anyagok

CD(Cistanchedeserticola)A kivonatot a Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company-tól (Kaohsiung, Tajvan) vásároltuk. CD kinyerése és izolálása(Cistanchedeserticola)a korábban leírtak szerint követték (a spektrális adatok alapján azonosították a kémiai összetételt, beleértve a béta-szitoszterint, daukoszterint, borostyánkősavat, triakontanolt, akteozidot, betaint és poliszacharidot).[17] A p-extracelluláris szignál-szabályozott kinázokra (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun N-terminális kinázokra (JNK), JNK, p-p65 és p65 specifikus nyúl poliklonális antitesteket a Santa Cruz Biotechnology-tól vásároltuk. Santa Cruz, USA). Az osteocalcin ELISA készletet a Biosource Technology-tól (Nivelles, Belgium) vásároltuk. Az I-es típusú kollagén ELISA kit C-terminális telopeptidjeit a Cross Laps-tól (Herlev, Dánia) szereztük be. A p38 domináns-negatív mutánst Dr. J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, USA) biztosította. A JNK domináns-negatív mutánst Dr. M. Karin (University of California, San Diego, USA) biztosította. Az ERK2 domináns-negatív mutánst Dr. M. Cobb (South-Western Medical Center) biztosította. Az összes többi reagenst a Sigma-Aldrich-től (St Louis, USA) szereztük be.

Sejttenyésztés

Az MC3T3-E1 egér oszteoblaszt sejtvonalat az American Type Culture Collection-től (ATCC; Rockville, USA) vásároltuk. A sejteket 95% levegőben, 5% CO2-ban tenyésztettük a-MEM-mel, amelyet 20 mm HEPES-sel és 10% hővel inaktivált magzati borjúszérummal, 2 mm-es glutaminnal, penicillinnel (100 U/ml) és sztreptomicinnel (100 mg) egészítettek ki. /ml).

A mineralizált csomóképződés mérése

A mineralizált csomóképződést a leírtak szerint értékeltük.[18] Röviden, az oszteoblasztokat C-vitamint (50 mg/ml) és b-glicerofoszfátot (10 mm) tartalmazó tápközegben tenyésztettük két hétig, és a tápközeget háromnaponta cseréltük. CD-vel való inkubálás után(Cistanchedeserticola)A sejteket kétszer mostuk 20 mm-es Tris-pufferolt sóoldattal, amely 0,15 m NaCl-t tartalmazott (pH 7,4), jéghideg 75%-os (v/v) etanolban 30 percig fixáltuk, majd levegőn. szárított. A kalcium lerakódást alizarin red-S festéssel határoztuk meg. Röviden, az etanollal rögzített sejteket és a mátrixot 1 órán át festettük 40 mm-es alizarin red-S-sel (pH 4,2), és alaposan öblítettük vízzel. A megkötött foltot 10% (w/v) cetil-piridinium-kloriddal eluáltuk, és a mintákban található alizarin-vörös-S mennyiségileg meghatároztuk az abszorbancia mérését 550 nm-en, és összehasonlítottuk egy standard görbével. Egy mól alizarin red-S szelektíven körülbelül két mól kalciumot köt meg.

Cistanche deserticolaarra jócsontképződés

Kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció

A teljes RNS-t oszteoblasztokból TRIzol kit (MDBio Inc., Taipei, Tajvan) segítségével extraháltuk. A reverz transzkripciót 2 mg teljes RNS és oligo(dT) primer felhasználásával végeztük.[19,20] A kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakciót (qPCR) a TaqMan® egylépéses PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, USA). A teljes cDNS-t (100 ng per 25- ml reakció) adtuk hozzá szekvencia-specifikus primerekkel és Taqman® próbákkal. Minden célgén primert és próbát kereskedelmi forgalomban vásároltunk, beleértve a b-aktint belső kontrollként (Applied Biosystems). A qPCR vizsgálatokat három párhuzamosban végeztük StepOnePlus szekvenciadetektáló rendszeren (Applied Biosystems). A ciklus körülményei a következők voltak: 10-perc polimeráz aktiválás 95 fokon, majd 40 ciklus 95 fokos 15 másodpercig és 60 fokos ciklus 60 másodpercig. A küszöböt a nem templát kontroll háttér fölé és a célgén-amplifikáció lineáris fázisán belül állítottuk be, hogy kiszámítsuk azt a ciklusszámot, amelynél a transzkriptumot detektálták (CT-vel jelölve).

Western blot analízis

A sejtlizátumokat a korábban leírtak szerint állítottuk elő.[21,22] A fehérjéket SDS-PAGE-val rezolváltuk, és Immobilon polivinil-difluorid membránokra (Millipore, Billerica, USA) vittük át. A blotokat 4 százalékos szarvasmarha-szérumalbuminnal blokkoltuk 1 órán át szobahőmérsékleten, majd nyúl anti-humán antitestekkel vizsgáltuk p-65 vagy p-p65 (1:1000) ellen 1 órán át szobahőmérsékleten. Három mosás után a blotokat peroxidázzal konjugált szamár anti-nyúl másodlagos antitesttel (1:1000) inkubáltuk 1 órán át szobahőmérsékleten. A blotokat fokozott kemilumineszcenciával tettük láthatóvá X-OMAT LS film segítségével (Eastman Kodak, Rochester, USA).

Ovariectomia által kiváltott csontritkulás

A vizsgálathoz négy hetes, 22-28 g-os nőstény ICR egereket használtunk. Az egereket kétoldali petefészekeltávolítjuk triklór-acetaldehid (100 mg/kg) érzéstelenítés alatt, a kontroll egereket pedig áloperációval (Sham) végezzük összehasonlítás céljából. A csontsűrűséget és a csont ásványianyag-tartalmát különböző koncentrációjú CD orális beadása után mértük(Cistanchedeserticola)kétnaponta kivonat négy héten keresztül. A teljes test csontsűrűségét és a csont ásványianyag-tartalmát kettős energiás röntgenabszorpciós mérővel (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, USA) határozták meg, a kis alanyok számára korábban leírt módot alkalmazva.[18] 23] Valamennyi protokoll megfelelt az intézményi irányelveknek, és a Kínai Orvostudományi Egyetem Állatgondozási Bizottsága jóváhagyta.

Statisztikai analízis

A statisztikai elemzés a Prism 4.{4}}1 szoftverrel történt. (GraphPad Software Inc., San Diego, USA). A megadott értékek átlagos SEM. A két minta közötti statisztikai elemzést Student-féle t-próbával végeztük. Több mint két csoport statisztikai összehasonlítását egyutas varianciaanalízissel végeztük Bonferroni posthoc tesztjével. Minden esetben P < 0,05="" volt="">

Cistanche deserticolaarra jócsontképződés

Eredmények

Cistanche deserticolakivonat növeli a csont mineralizációját az osteoblastok által A CD hozzáadása(Cistanchedeserticola)A 24 vagy 48 órás kivonat nem befolyásolta az egér oszteoblaszt MC3T3-E1 sejtek proliferációját egy MTT vizsgálatban (az adatokat nem mutatjuk be). Mivel az oszteoblasztok differenciálódása egy összetett folyamat, amely magában foglalja a sejtproliferációt és a migrációt, ezért megvizsgáltuk az MC3T3-E1 sejtek migrációs képességét is CD-kezelés után.(Cistanchedeserticola)kivonat. Transwell és sebgyógyulási tesztek segítségével azt a CD-t találtuk(Cistanchedeserticola)A kivonat nem befolyásolta az oszteoblasztok migrációját (az adatokat nem mutatjuk be). A mineralizált csomók kialakulása az oszteoblasztok érésének egyik markere. Az alizarin vörös S festés azt mutatta, hogy mineralizált csomók keletkeztek, amikor az oszteoblasztokat két hétig C-vitamint (50 ug/ml) és -glicerofoszfátot (10 mm) tartalmazó tápközegben tenyésztjük, a koncentrációtól függő módon CD hozzáadásával.(Cistanchedeserticola)(1a. ábra). Ezért CD(Cistanchedeserticola)kivonat által kiváltott csontcsomók képződését tenyésztett osteoblastok, de nem azok proliferációját vagy migrációját. Megvizsgáltuk a CD szerepét is(Cistanchedeserticola)kivonat a RANKL által kiváltott oszteoklasztogenezisben, de nem talált hatást (az adatokat nem mutatjuk be).

A Cistanche deserticola kivonat növeli az alkalikus foszfatáz, a csont morfogenetikus fehérje-2 és az osteopontin expresszióját tenyésztett oszteoblasztokban

A differenciált oszteoblasztok fokozott ALP-aktivitást mutatnak, ami az enzimexpresszió magas szintjével korrelál.[18] Azt találtuk, hogy a kezelés CD-vel(Cistanchedeserticola)kivonat 72 órán keresztül szignifikánsan növelte az oszteoblaszt ALP aktivitást (1b. ábra). Tekintettel a BMP-2, az ALP és az OPN döntő szerepére az oszteoblasztok differenciálódásában, megvizsgáltuk, hogy a CD(Cistanchedeserticola)A kivonat az oszteoblasztok differenciálódására a BMP{0}}, az ALP és az OPN expressziójának szabályozásával fejti ki hatását. Sejtek kezelése CD-vel(Cistanchedeserticola)A kivonatok koncentrációfüggő módon növelték az ALP, BMP-2 és OPN mRNS expresszióját (1c. ábra), bizonyítva, hogy a CD(Cistanchedeserticola)kivonat indukálta az oszteoblasztok differenciálódását az ALP, BMP-2 és OPN expressziójának fokozásával.

A Cistanche deserticola kivonat a mitogén által aktivált proteinkináz útvonalon keresztül fokozza a csontcsomók képződését

Beszámoltak arról, hogy a MAPK fontos szerepet játszik acsontképződés[24,25] ezért a következő lépésben azt vizsgáltuk, hogy ez a jelátviteli útvonal szerepet játszik-e a CD-ben(Cistanchedeserticola)kivonat által kiváltott csont mineralizáció. A sejtek előkezelése U0126 ERK gátlóval, SB203580 p38 inhibitorral vagy JNK gátlóval SP600125 csökkentette a CD-t(Cistanchedeserticola)kivonat által megnövekedett csont mineralizáció (2a., 3a. és 4a. ábra). Ezenkívül az inhibitorok blokkolták a CD-t is(Cistanchedeserticola)kivonat által kiváltott ALP, BMP-2 és OPN expresszió (2b–4c. ábra). A sejtek transzfekciója ERK2, p38 vagy JNK mutánssal csökkentette a CD-t(Cistanchedeserticola)kivonat-növekedés az ALP, BMP-2 és OPN mRNS expressziójában (2c., 3c. és 4c. ábra). Ezután közvetlenül megvizsgáltuk az ERK, a p38 és a JNK aktiválását CD után(Cistanchedeserticola)kivonat kezelés. Sejtek inkubálása CD-vel(Cistanchedeserticola)A kivonat ERK, p38 és JNK foszforilációt indukált (2d., 3d. és 4d. ábra). Ezért az ERK, a p38 és a JNK közvetítik a megnövekedettcsontképződésCD indukálta(Cistanchedeserticola)osteoblastok kezelése.

A Cistanche deserticola kivonat a nukleáris faktor-kB útvonalon keresztül fokozza a csontcsomók képződését

Mint korábban említettük, az NF-kB aktiválása szükségescsontképződés[26,27] Ezután az oszteoblasztokat az NF-kB inhibitorokkal, a pirrolidin-ditiokarbamáttal (PDTC) és az N-tozil-L-fenilalanin-klór-metil-ketonnal (TPCK) a Calbiochem-től (Darmstadt, Németország) vásároltuk, hogy meghatározzuk, hogy az NF-kB aktiválódik-e. részt vesz a CD-ben(Cistanchedeserticola)kivonat által kiváltott csont mineralizáció. Az 5a. ábra azt mutatja, hogy az oszteoblasztok PDTC-vel vagy TPCK-val történő előkezelése gátolta a CD-t(Cistanchedeserticola)kivonat által kiváltott csontcsomók képződését, valamint csökkentette az ALP, BMP-2 és OPN expresszió növekedését (5b. és 5c. ábra). Az NF-kB p65 alegységének foszforilációja az NF-kB aktiválódásának indikátora; [28] ezzel összhangban azt találtuk, hogy a CD(Cistanchedeserticola)kivonat növelte a p65 foszforilációját az oszteoblasztokban (5d. ábra). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy az NF-kB aktiválása fontos a CD-kivonat által kiváltott ALP, BMP-2 és OPN expressziójában és a csontcsomók kialakulásában.

4. ábra A c-Jun N-terminális kinázok (JNK) részvétele aCistanchedeserticola(CD) kivonat által kiváltott csont mineralizáció osteoblasztokban. (a) A sejteket 24-lyuklemezekre szélesztettük, és C-vitamint (50 mg/ml) és b-glicerofoszfátot (10 mM) tartalmazó tápközegben tenyésztettük két hétig. A sejteket egyidejűleg CD-vel kezeltük(Cistanchedeserticola)kivonat (26 mg/ml) plusz SP600125 (3 mM). A mineralizált csomóképződést alizarin red-S festéssel értékeltük (n=5). (b, c) A sejteket SP600125-tel előkezeltük 30 percig, vagy JNK mutánssal vagy 24 órán át transzfektáltuk, majd CD-kivonattal stimuláltuk, és alkalikus foszfatáz (ALP) aktivitással és ALP-vel, csontmorfogenetikai fehérjével (BMP)-2 és Az oszteopontin (OPN) mRNS expresszióját ALP kittel és kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakcióval mérték. (d) A sejteket CD-kivonattal kezeltük a megadott ideig, és a p-JNK expressziót Western blottal vizsgáltuk. *P< 0.05,="" compared="" with="" control="" group;="">< 0.05,="" compared="" with="" cd="">(Cistanchedeserticola)kivonattal kezelt csoport.

A csontvesztés gátlása Cistanche deserticola kivonattal petefészek-eltávolított egerekben

A CD hatásának vizsgálata(Cistanchedeserticola)kivonat a csontvesztésre, a csontritkulást nőstény egerekben petefészekeltávolítással váltották ki. Amint az várható volt, a petefészek-eltávolított egerek csökkent csontsűrűséget és csont ásványianyag-tartalmat mutattak (6a és 6b ábra). Kezelés CD-vel(Cistanchedeserticola)A kivonat négy hétig dózisfüggő módon gátolta a csont ásványianyag-sűrűségének és a csont ásványianyag-tartalmának csökkenését (6a. és 6b. ábra). Az ALP vérkoncentrációja tükrözheti az oszteoblaszt aktivitást.[29] Amint az a 6c ábrán látható, CD(Cistanchedeserticola)kivonat gátolta a szérum ALP-aktivitás ovariectomia által kiváltott csökkenését. Ezen kívül CD(Cistanchedeserticola)A kivonat növelte az oszteokalcin szintjét is, amely acsontképződés, és csökkentette az I-es típusú kollagén C-terminális telopeptidjeinek szintjét, amely a csontreszorpció markere (6d. és 6e. ábra). Ezek az eredmények tehát alátámasztják a CD hatékonyságát és hatékonyságát(Cistanchedeserticola)kivonat a csontvesztés megelőzésében in vivo.

6. ábra A petefészek eltávolítása által kiváltott csontsűrűség és csont ásványianyag-tartalom csökkenéseCistanchedeserticola(CD) kivonat. A nőstény ICR egereket színlelt műtéttel végezték, vagy petefészkeket eltávolítottak. Ovariectomizált egereket a jelzett koncentrációjú CD-vel kezeltük(Cistanchedeserticola)kivonat szájon át történő táplálással. A teljes test csontsűrűségét (a), a csont ásványianyag-tartalmát (b), a szérum alkalikus foszfatáz (ALP) aktivitását (c), a szérum osteocalcint (d) és az I-es típusú kollagén szérum C-terminális telopeptidjeit (e) négyszer határozták meg. héttel a műtét után. Az adatok átlagos SE, n=8–10 egér/csoport. *P < 0,05,="" hamishoz="" képest;="" #p="">< 0,05,="" összehasonlítva="" a="" petefészek-eltávolított="">

VITA

Kattintson ide a cikk II. részével (Megbeszélés és következtetés) kapcsolatos információkért.

Tól től: 'Cistanchedeserticolakivonat növekszikcsontképződésaz osteoblastokban' általTe-Mao Li^aet al

---© 2012 A szerzők. JPP © 2012 Royal Pharmaceutical Society 2012Gyógyszerészeti és Gyógyszerészeti folyóirat, 64, 897–907