A Cistanche Herba cisztanozidja az oxidatív stressz elnyomásával javítja a hipoxia által kiváltott férfi szaporodási károsodást -Ⅰ

Bevezetés

Jelenleg világszerte körülbelül 48,5 millió (15%) reproduktív korú házaspárt érint a meddőség, amelyek közül az esetek 40-50%-a a férfi meddőségnek tulajdonítható, amely állapot szorosan összefügg a környezeti és életmódbeli tényezőkkel. A bizonyítékok arra utalnak, hogy az emlős herének alacsony oxigénnyomásra való érzékenysége kiváltó tényező a férfi meddőség bizonyos formáiban. Amint azt a korábbi vizsgálatok kimutatták, a spermatogenezis károsodik és csökken, ha hipobárikus hipoxiának vannak kitéve.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA A SZEXUÁLIS FUNKCIÓ JAVÍTÁSÁRA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

A mögöttes mechanizmus feltárása érdekében a vizsgálatok kimutatták, hogy a hipobárikus hipoxiának való kitettség növeli a reaktív oxigénfajták (ROS) termelését. A ROS fontos szerepet játszik a férfi reproduktív rendszerben. Alacsony szinten szükségesek a spermium kapacitációjához, az akroszóma reakcióhoz és a spermium-petesejtek fúziójához [10]. A túlzott ROS azonban a spermium nukleáris/mitokondriális DNS-károsodását és a plazmamembrán peroxidatív károsodását okozhatja, amelyek viszont fő etiológiai tényezők anő a férfi meddőség kockázata. Így a hipoxia által kiváltott ROS felhalmozódása lehet a férfi meddőség egyik oka.

Cistanches Herba, egy évelő parazita gyógynövény, széles körben elterjedt száraz területeken, és farmakológiai aktivitása miatt széles körben használják. Az összes hatékony tartalma közöttCistanches Herba, a PhG-ket tekintik a fő aktív komponensnek. Eddig 34 PhG-t izoláltakCistanches növények. Cisztanozid(Cis), egy aktív PhG-ből izoláltCistanches Herba, antioxidáns hatása miatt kapott figyelmet.

Figyelembe véve a cisz antioxidáns hatásait és a ROS szerepét a hipoxia által kiváltott férfi meddőségben, a cisz potenciális gyógyszerjelöltnek tekinthető ahipoxia okozta férfi meddőség. Azonban kevés jelentés foglalkozott a Cistanches Herbából kivont cis antioxidáns hatásaival a hipoxia által kiváltott férfi meddőség kezelésében, vagy az érintett jelátviteli útvonalakkal. Ebben a tanulmányban in vitro és in vivo hipoxiás kísérleti modelleket építettünk fel, és értékeltük a különböző cisz-ek hatásösszetevőit.

Anyagok és metódusok

Sejtkultúra és reagens

A GC-1spg (GC-1) egér spermatogónia sejtvonalat az American Type Culture Collection-től (ATCC) vásároltuk, és DMEM-ben (Invitrogen, USA) tenyésztettük, kiegészítve 10% magzati szarvasmarha szérummal, 1% L-glutamin (100 mM), penicillin (100 U/ml) és sztreptomicin (100 ug/ml) 37 fokon, párásított inkubátorban 5% CO2-val. A Cis-t (Cis-A, B, C, H) a Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd.-től (Kína) vásároltuk.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA A SZEXUÁLIS FUNKCIÓ JAVÍTÁSÁRA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Sejtéletképességi vizsgálat

A sejtek életképességét sejtszámláló kit{{0}} teszttel (CCK-8) teszteltük. Röviden, a GC{2}} sejteket lyukanként 1,5×103 96-lyukú lemezekre oltottuk, és 37 fokon tenyésztettük 24 órán át. Ezután a sejteket különböző koncentrációjú (20%, 15%, 10%, 5%) oxigénnel vagy különböző koncentrációjú (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) cisz-szel (Cis-A, Cis-B, Cis- C, Cis-H) a szükséges ideig. Ezután a felülúszót eldobták, és a sejtek életképességét CCK-8 kit (Dojindo Japán) segítségével detektáltuk. Mindegyik lyuk abszorbanciáját 450 nm-en mértük mikrolemez-leolvasóval (BioRad USA). Végül a sejtek életképességét a következő képlet szerint számítottuk ki: Sejtéletképesség=(ODkísérleti csoport - ODblank csoport)/ (ODkontroll csoport - ODblank csoport) × 100%.

Western blot analízis

Az összegyűjtött sejteket vagy szöveteket RIPA pufferben homogenizáltuk a fehérjék extrakciója céljából (RIPA Beyotime China; Cocktail Roche Switzerland). A felülúszókat összegyűjtöttük, és a fehérjék koncentrációját BCA módszerrel (Beyotime) teszteltük. Az egyes mintákból körülbelül 40 µg extrahált fehérjéket SDS-PAGE-val választottunk el, és elektrotranszferáltunk egy nitrocellulóz (NC) szűrőmembránra (Beyotime China). Az NC szűrőmembránokat 5%-os zsírmentes tejjel blokkoltuk 1,5 órán keresztül, majd specifikus antitestekkel (anti-PARP 1:1000, anti-Caspase-3 1:1000, anti-Bcl-2 1:1000, anti-Bax 1) inkubáltuk. :1000, az anti-GAPDH 1:1000 minden antitestet a Cell Signaling Technology-tól (USA) vásároltunk egy éjszakán át 4 °C-on. Ezután az összes NC membránt a megfelelő torma-peroxidázzal konjugált másodlagos antitesttel inkubáltuk 1,5 órán keresztül szobahőmérsékleten, és képalkotó rendszerrel (Tannon, Kína) leképeztük.

Sejtciklus kimutatása

A sejtciklus elemzésére áramlási citometrikus vizsgálatot (FCM) végeztünk. A sejteket különböző körülmények között kezeltük 72 órán át, majd összegyűjtöttük. A sejteket ezután PBS-sel mostuk, 75%-os etanolban fixáltuk, és propidium-jodiddal (PI) festettük. Minden mintához 1 × 104 sejtet gyűjtöttünk, és áramlási citometriával elemeztük (FACS Calibur, BD Biosciences). Ezután kiszámítottuk a G1/S/G2 fázisú sejtek arányát és a proliferációs indexet [Fázis(S+G2)/Fázis(G1+S+G2) × 100%].

Ki-67 festés

A sejteket konfokális edényben tenyésztettük, és hipoxiával vagy a Cis különböző altípusaival kezeltük 72 órán keresztül. Miután az összes sejtet 4%-os paraformaldehiddel rögzítettük, anti-Ki-67 antitesttel (1:200, Cell Signaling Technology) inkubáltuk. Ezután az összes sejtet megfelelő CY-3-konjugált anti-nyúl IgG antitesttel (1:200, Boster, Kína) és DAPI oldattal (1,0 ug/ml, Beyotime) inkubáltuk. A fluoreszcenciát Fluoview FV1000 konfokális mikroszkóppal (Olympus, Japán) figyeltük meg.

Csúcskategóriás CISTANCHE TUBULOSA KIVONAT A tesztoszteron fokozására PHGS75% ECH 30% ACT 12%

ROS észlelése

Az FCM-et az intracelluláris ROS szint mérésére vezették be DCFH-DA segítségével. A felfüggesztett sejteket 6-lyuklemezekre oltottuk, és különböző kezeléseknek vetették alá. 72 órás kezelés után a sejteket szérummentes DMEM-ben szuszpendáltuk 10 μM DCFH-DA-val (Beyotime). A ROS-tartalmat ezután fluoreszcenciával aktivált sejtválogatással határoztuk meg Beckman Coulter Flow Cytometry Systemen 488 nm gerjesztési hullámhosszú és 525 nm emissziós hullámhosszúsággal [18].

Lipid-peroxidáció (LPO) meghatározása

Az LPO kimutatására tiobarbitursavval reaktív anyagok (TBARS) vizsgálatot végeztek. Minden műveleti lépést az utasítások szerint végeztünk (Sigma USA). A koncentrációkat 1,56×105/(M·cm) moláris extinkciós együtthatóval számítottuk ki, amelyet malondialdehid standard felhasználásával kaptunk. Az eredményeket nmol MDA-ekvivalens/mg fehérje értékben fejezzük ki.

Az enzimaktivitások meghatározása

Az enzimaktivitásokat glutation-reduktázt (GR), glutation-peroxidázt (GPx) és szuperoxid-diszmutázt (SOD) tartalmazó tesztkészletekkel tesztelték. Minden műveleti lépést a mellékelt utasítások szerint hajtottak végre (Nan Jing Jian Cheng Bioengineering Institute China).

Állatok és kísérleti jegyzőkönyv

Kifejlett hím Wistar patkányokat (180-220 g, 8 w évesek) a Kínai Hsziani Negyedik Katonai Orvostudományi Egyetem állatközpontjából szereztünk be. Az állatok felhasználására az Egyetemi Etikai Bizottság engedélyt kapott (hivatkozási szám: 20190506). Az állatkísérlet a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó egyetemi irányelvek szerint történt.

Minden patkánynak hagytuk alkalmazkodni körülbelül 1 hétig a kísérlet megkezdése előtt. Az akklimatizáció után a patkányokat véletlenszerűen 6 csoportba osztottuk, mindegyik csoportban 5 állat volt. A kontrollcsoport patkányait normál nyomáson (PO2: 20%; légnyomás: 101,3 kPa), míg a modell és a cisz-kezelt csoport patkányait alacsony nyomású oxigénkamrában (61,6 kPa belső nyomás) neveltük. 4000 méteres tengerszint feletti magasságnak megfelelő PO2: 14,55%), hogy szimulálja a nagy magasságú hipoxiás környezetet. Minden patkány szabadon hozzáférhetett élelemhez és vízhez műanyag ketrecekben 22 ± 2 fokos hőmérsékleten és páratartalom mellett, automatikus 12-h fény/sötét ciklussal. A modellben és a cisz-szel kezelt csoportban lévő patkányok hipobár körülmények között maradtak, de 96 óránként átvitték őket normobár körülmények közé, ekkor táplálékot és vizet biztosítottak számukra, és a ketreceket megtisztították. A hipobáriásból a hipobáriásba való átmenet időtartama körülbelül 2 óra volt. Minden kezelt csoportot a megfelelő Cis-szel (8 mg/kg/nap) kezeltünk orális szondán keresztül 8 hétig, míg a kontroll- és modellpatkányokat azonos térfogatú vízzel.

8 hét elteltével a patkányokat altatásban leöltük. A heréket, mellékheréket és ondóhólyagokat elválasztottuk és lemértük, és a szervindexet a következő képlet szerint számítottuk ki: (szerv/állat tömege) × 100%. Ezt követően a mellékherékben lévő spermiumokat összegyűjtöttük, és megvizsgáltuk mozgékonyságukat és akroszóma enzimaktivitásukat. Hasonlóképpen hereszöveteket gyűjtöttünk a hisztopatológiai vizsgálatokhoz, valamint a ROS, LPO és antioxidáns enzimaktivitás kimutatásához.

CISTANCHE TUBULOSA KIVONAT CISTANCHE GYÓGYNÖVÉNY NÖVELI SZEXERŐT PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Az élő spermiumok arányának értékelése

Az epididimiszt sebészeti ollóval bemetszettük, és a spermium szuszpenziót normál sóoldatban készítettük. Az élő spermiumok arányának értékeléséhez 5 μl spermiumszuszpenziót gondosan összekevertünk azonos térfogatú eozin-Y festékkel. Ezután fénymikroszkóp alatt megszámoltuk a spermiumokat. Az élő spermiumok arányát a festett (elhalt sperma) és a festetlen spermiumok (élő spermiumok) kiszámításával értékelték.

A spermiumok akroszóma enzimaktivitásának meghatározása

A spermium akroszóma enzimaktivitás vizsgálatát a spermium akroszóma enzimek értékelésére használták [19]. Az egyes csoportok eredményeit a következő képlettel számítottuk ki: Akroszóma enzimaktivitás (μIU)=(ODExperiment group - ODBlank group)/(247,5×10) × 106.

Eredmények

A hipoxia hatása a GC{0}} sejtekre

A hipoxia csírasejtekre gyakorolt ​​hatásának meghatározásához először a sejtek életképességében bekövetkezett változásokat vizsgáltuk különböző oxigénkoncentrációkkal (20%, 15%, 10% és 5%) végzett hipoxia kezelés után 1, 3, 5 , illetve 7 nap. A CCK-8 vizsgálati eredményei azt mutatták, hogy a kontrollcsoporthoz (20%-os oxigénkoncentráció) képest a hipoxiának kitett sejtek életképessége szignifikánsan csökkent (P < 0,01; 1A. ábra). Ráadásul túlélési arányuk fordítottan arányos az oxigénkoncentrációval, és tovább csökkent az indukciós idővel. A túlzott citotoxikus hatás elkerülése érdekében a következő in vitro kísérletekhez 10%-os oxigénkoncentrációt és 3-napos indukciós időt választottak a hipoxiás modell kritériumaként.

Ezt követően FCM-et és immunfluoreszcens festést végeztünk, hogy tovább értékeljük a GC{{0}} sejtek proliferációs változását hipoxia kezelés alatt. Az eredmények azt mutatták, hogy a hipoxia GC-1 sejtleállást indukálhat a G1 fázisban, ezáltal csökkentve a sejtek S-fázisba jutását, és gátolva a DNS-replikációt. Így a hipoxia szignifikánsan csökkentette a GC-1 sejtek proliferációs indexét (P < 0,01; 1B. ábra). A pozitív Ki-67 festődés a proliferáló sejtek másik specifikus biomarkere. Ezért megvizsgáltuk a Ki-67-pozitív sejtek arányát hipoxia-kezeléssel vagy anélkül. A kontrollcsoporthoz képest a hipoxiás kezelés jelentősen csökkentette a Ki-67-pozitív sejteket, amint az 1C. ábrán látható.

Ezt követően a GC{{0}} sejtek hipoxia által kiváltott életképesség-gátlásának módját kívántuk megvizsgálni. Amint az irodalomban beszámoltak róla, a ROS szintje emelkedett, amikor a patkányokat hipobárikus hipoxiás környezetnek tették ki [8, 20]. Ezért a GC-1 sejtekben az endogén ROS-szinteket FCM-teszttel mértük. Az eredmények magasabb ROS szintet mutattak hipoxia esetén a normál oxigéncsoporthoz képest (P < 0,01; 1D ábra). A felhalmozódott ROS jelentős DNS-károsodást okoz, ami viszont a sejt apoptózis útvonalának aktiválódását okozza, és a férfi meddőség növekvő kockázatának fő etiológiai tényezője lehet [21, 22]. Ezt követően TUNEL festéssel detektáltuk a hypoxia apoptotikus aktiváló hatását GC-1 sejteken. Amint az 1E. ábrán látható, a hipoxiás kezelés a TUNEL fluoreszcenciájának növekedését eredményezte a kontrollcsoporthoz képest, ami az apoptózis növekedését jelzi a modellcsoportban.

Mivel a ROS által kiváltott sejtkárosodást általában az operációs rendszer okozza, tovább teszteltük a GC-1 sejtek operációs rendszerét. Amint az 1F. ábrán látható, a GC-1 sejtek LPO-szintje a modellcsoportban jelentősen megemelkedett a kontrollcsoport GC-1-sejtek LPO-szintjéhez képest. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a hipoxia által kiváltott GC{6}} sejtkárosodás összefüggésben lehet az OS-sel, amelyet a ROS felhalmozódása indukál.