A Cistanche Herba cisztanozidja az oxidatív stressz elnyomásával javítja a hipoxia által kiváltott férfi szaporodási károsodást -Ⅱ

A cisz hatása a hipoxia által kiváltott GC-1 sejtek életképességére in vitro.

Annak vizsgálatára, hogy a cis képes-e megakadályozni a hipoxia GC{{0}} sejtek életképességére gyakorolt ​​gátló hatását, CCK-8 vizsgálatot végeztünk. A GC-1 sejteket különböző altípusokkal (Cis-A, B, C, H) és koncentráció-tartományokkal (0.02 μM, 0,2 μM, 2 μM) cisz 72 órán át. A modellcsoport és a DMSO csoport összehasonlítása azt mutatta, hogy a DMSO közvetlenül nem segítette elő a GC{{10}} sejtek életképességét (2A. ábra). A sejtek életképessége azonban jelentősen helyreállt (P < 0.05) a cis-kezeléssel. A modellcsoporttal összehasonlítva a Cis-A, Cis-B, Cis-C és Cis-H mindegyike mutatott bizonyos védőhatásokat a GC-1 sejtek életképességének hipoxia által kiváltott károsodására, a Cis-B pedig a legjelentősebb. hatás (2A ábra). A cisz védő hatásai 0,2 μM-nál szignifikánsan magasabbak voltak, mint a cisz védőhatásai 0,02 μM-nál, míg a 2 μM és 0,2 μM közötti különbség nem volt nyilvánvaló, ami arra utal, hogy a helyreállított A Cis által kiváltott GC-1 sejtek életképessége dózisfüggő növekedést mutatott a 0.02-0,2 μM koncentrációtartományban (2A. ábra). Ezért a kísérleti igényeknek megfelelően a következő in vitro kísérletekben a 0,2 μM Cis-t választottuk optimális koncentrációnak. Annak további igazolására, hogy a csírasejtek valóban védettek-e a Cis-, az FCM- és a Ki-67-festéssel, a GC-1-sejtek proliferációjának Cis-kezelés utáni változásának felmérésére került sor. A Cis kezelés hatására a GC-1 sejtek aránya a G1 fázisban csökkent. Ezzel szemben több sejt került az S fázisba, ami arra utal, hogy a cisz-kezelés növelheti a csírasejt-proliferációs indexet (P < 0,01; 2B ábra). A GC-1 sejtciklus statisztikáit a 2Bb. ábra mutatja. A Ki-67 festési eredmények azt is mutatták, hogy a Cis-A, Cis-B, Cis-C és Cis-H kezelés szignifikánsan javította a hipoxia által kiváltott GC{54} Ki-67-pozitív sejtarányát. } sejteket in vitro (2C. ábra).

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA A SZEXUÁLIS FUNKCIÓ JAVÍTÁSÁRA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

A cisz mechanizmusa in vitro megvédi a csírasejteket a hipoxiától.

Annak vizsgálatára, hogy a Cis GC-1 sejtekre gyakorolt ​​védő hatása összefüggésben áll-e a túlzott ROS eltávolításával, a DCFH-DA fluoreszcens festéket használtuk a ROS szintjének kimutatására minden csoportban. A 3A. és 3B. ábrákon látható módon a DMSO-val végzett kezelés nem változtatta meg az intracelluláris ROS-tartalmat vagy az LPO-szintet a modellcsoporthoz képest. Azonban a GC-1 sejtekben a ROS szintje jelentősen csökkent a cisz-kezelt csoportokban (3A. ábra). Ezenkívül az LPO csökkenése is megfigyelhető volt a Cis-nek alávetett GC-1 sejtekben (3B. ábra).

Annak a mechanizmusnak a további feltárására, amellyel a cisz megvédi a csírasejteket a hipoxiás sérülésektől, TUNEL festést és Western blot analízist végeztünk az apoptózis értékelésére. A TUNEL festés (3C. ábra) szignifikáns apoptózist mutatott a modell- és a DMSO-csoportban. A Cis kezelés során azonban kevesebb apoptotikus sejtet figyeltek meg, ami arra utalt, hogy a cis kezelés csökkentette a GC-1 sejt apoptózisát. Ezenkívül megmértük a PARP, a kaszpáz-3, a Bax és a Bcl-2 expresszióját, hogy megerősítsék a molekuláris mechanizmust. A 3D. ábrán látható módon a kaszpáz-3 és a PARP aktiválódott a GC-1 sejtekben hipoxia alatt, és ezt az aktiválást a Cis kezelés gátolta. Ezenkívül a Bax/Bcl-2 arány magasabb volt a modellcsoportban, mint a kontrollcsoportban, és a cis kezelés csökkentette a Bax/Bcl-2 arányt (3D. ábra). Ezek az adatok azt mutatták, hogy a cisz potenciálisan képes csillapítani a hipoxia által kiváltott oxidáns károsodást, és ez a védőhatás a ROS felhalmozódás csökkentésével és a kaszpázzal kapcsolatos apoptózis útvonal aktiválásának gátlásával érhető el.

Az OS-t gátló enzimatikus mechanizmus olyan szabad gyökfogókat foglal magában, mint a glutation-reduktáz (GR), glutation-peroxidáz (GPx) és szuperoxid-diszmutáz (SOD) [23]. Az OS-t gátló enzimatikus mechanizmus alapvető szerepet játszik a sejtek és szövetek oxidatív károsodásának megelőzésében [23]. A GC-1 sejtekben a hipoxia által kiváltott OS Cis gátlásának lehetséges mechanizmusának további validálása érdekében megmértük a GR, GPx és SOD aktivitását. Az eredmények azt mutatták, hogy a GR, GPx és SOD aktivitások mind szignifikánsan (P < 0.01, 3E ábra) csökkentek hipoxia alatt a kontrollcsoportokhoz képest, és a Cis-kezelés jelentősen helyreállította az aktivitásukat A hipoxiának kitett GC-1 sejtek (P < 0,05, 3E. ábra), ami arra utal, hogy ezek a vegyületek aktiválhatják az erős endogén antioxidáns rendszert.

CISTANCHE TUBULOSA a spermiumtermelődéshez PHGS75% ECH 30% ACT 12%

A cis hatása a reprodukcióra hypobaric hypoxia által kiváltott patkányokban.

A hipobáriás hipoxia hím patkányokra gyakorolt ​​hatásának meghatározásához először a herék morfológiai változásait teszteltük hipobáriás hipoxia által kiváltott patkányokon. A HE-festés eredményei azt mutatták, hogy a kontrollcsoportban a normál spermatogén sejtek különböző stádiumokban rendezetten helyezkedtek el az alapmembrántól a lumenig, és az érett spermiumok láthatók voltak a tubulus lumeneiben (4A. ábra). A kontrollokhoz képest a modellcsoportban a hereszövet kóros elváltozásait figyelték meg, a herehámsejtek alapmembránja lazán rendeződött, a spermatogén hám rendkívül vékony volt, a csírasejtek szintje és száma jelentősen csökkent (4A. ábra). . A cisz-kezelés azonban jelentősen javította a hypobaric hypoxia által kiváltott herekárosodás szövettanát in vivo (4A. ábra). Mértük a testsúlyt, a herék tömegét, a mellékhere tömegét és a húgyhólyag mirigy tömegét is, ami a szaporodási szerv indexének (a szaporítószerv/testtömeg arány) kiszámításához vezetett. Amint a 4B-D ábrán látható, a szaporodási szervek indexe (herék, mellékhere és ondóhólyag) jelentősen alacsonyabb volt a modellcsoportban (P < 0,01), mint a kontrollcsoportban. A hipobáriás hipoxiának a patkányok szaporodási szervi indexére gyakorolt ​​hatása azonban megfordult a cis-kezeléssel (4B-D ábra).

Ezt követően a hím patkánysperma akroszóma enzimaktivitását és élő spermiumok arányát is megmértük a herefunkció károsodásának tisztázása érdekében. Amint a 4E, 4F ábrán látható, az akroszóma enzimaktivitás és a spermiumok mozgékonysága alacsonyabb volt a modellcsoport patkányaiban, mint a kontrollcsoportban (P < 0.01). A modellcsoport patkányaihoz képest azonban az akroszóma enzimaktivitás helyreállt a 8 mg/kg/nap Cis-szel kezelt patkányokban (P < 0,05) (4D. ábra). Ezen túlmenően, amint az a 4F. ábrán látható, a cisz-kezelés isnövelte az élő spermiumok arányát; a 8 mg/kg/nap Cis-szel kezelt patkányok mindegyike szignifikánsan megnövekedett élő spermiumok arányát mutatta (55,83 ± 6.03%, P < 0.05; 69.{101} {8}} ± 2,29%, P < 0,01; 52,33 ± 3,40%, P < 0,05 és 53,67 ± 2,25%, P < 0,05) összehasonlítva a modellpatkányokkal (43,83 ± 4,01%); .

Összességében ezek az eredmények azt sugallják, hogy a hipobárikus hipoxiás környezet herék morfológiai elváltozásokhoz, a szaporodási szervek súlyának csökkenéséhez és a herék funkcióinak károsodásához vezetett hím patkányokban, és a cis hatékonyan megvédheti a nemi szerveket a hipoxia okozta károsodástól.

A cisz hatása az OS-re hypobaric hypoxia által kiváltott patkányok heréiben.

A patkányok heréiben mértük a ROS és LPO szinteket, hogy elemezzük a Cis hipobáriás hipoxia által kiváltott OS-re gyakorolt ​​hatását. A ROS-elemzés feltárta, hogy a kontrollcsoporthoz képest a ROS-szint a herékben szignifikánsan megemelkedett a modellcsoportban (P < 0.01 5A. ábra). Ezzel szemben az LPO drámaian megemelkedett a herékben (P < 0,01) hipobáriás hipoxia esetén a normoxiás állapotokhoz képest (5B. ábra). A cisz-kezelés azonban megváltoztatta a fenti változásokat (P < 0,05), amelyben a Cis-B jobb hatást fejtett ki, mint a többi cisz (5A, 5B ábra). Úgy tűnt, hogy a cisz megvédi a heréket azáltal, hogy csökkenti az OS-t hipobár hipoxiás körülmények között in vivo.

Ezenkívül apoptózisanalízist végeztünk annak érdekében, hogy tovább értékeljük azt a mechanizmust, amellyel a cis véd a hypobaric hypoxia által kiváltott herefunkciós károsodás ellen. A TUNEL festés eredményei (5C. ábra) azt mutatták, hogy a modellcsoportban szignifikáns apoptózis volt jelen a kontrollcsoporthoz képest. A cisz (8 mg/kg/nap) kezelés után azonban kevesebb apoptotikus sejt fordult elő (P < 0,05) (5C. ábra). A Western blot adatok azt is kimutatták, hogy a hipoxia és a hypobariás kezelés a kaszpáz-3 és a PARP aktiválódását, valamint a Bax/Bcl-2 arányának növekedését eredményezte a hereszövetben, ami az apoptózis növekedését jelzi (5D. ábra). Ezen kívül különböző típusúCis kezelésszignifikánsan csökkentette az apoptózist a hereszövetben (5D. ábra). Hasonlóképpen, a hereszövet IHC-analízise hasonló eredményeket mutatott (1. kiegészítő ábra).

A hipobáriás hipoxia által kiváltott cisz-redukált OS mechanizmusának ellenőrzésére tovább teszteltük a GR, GPx és SOD aktivitását a hereszövetben. Amint az 5E. ábrán látható, a kontrollcsoporthoz képest a hipobárikus hipoxia kezelés jelentősen csökkentette a GR, GPx és SOD aktivitásokat (P < 0.01). A cisz-kezelés azonban helyreállította a herék szövetének enzimaktivitását (GR, GPx és SOD) hipobáriás hipoxiával kezelt patkányokban (P < 0,05). Összefoglalva, úgy tűnt, hogy a cisz megvédi a heréket azáltal, hogy aktivál egy erős endogén antioxidáns enzim védekező mechanizmust hipobáriás hipoxiás körülmények között.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA A SZEXUÁLIS FUNKCIÓ JAVÍTÁSÁRA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Vita

A magaslati területeken a hipobárikus hipoxiáról ismert, hogy az emberek több rendszerét érinti, beleértve a férfiak reproduktív rendszerét is [4, 20]. A közelmúltban végzett kísérleti vizsgálatok arra irányulnak, hogy megértsék azokat a mechanizmusokat, amelyek azt mutatják, hogy a hipobárikus hipoxia hogyan károsítja a férfi reproduktív rendszert. Ebben a vizsgálatban a Cistanches Herba cisz-kivonatának terápiás hatását vizsgálták a hipoxia által kiváltott reproduktív károsodásra. Az eredmények azt mutatták, hogy a cisz megvédheti a hím reproduktív rendszert a hipoxiás károsodástól azáltal, hogy csökkenti a hipoxia által kiváltott ROS-felhalmozódást és az OS-t az endogén antioxidáns enzimek aktivitásának fokozásával.

A ROS oxigénből származó szabad gyökök, amelyek létfontosságú szerepet játszanak az emberi fiziológiában és patológiában. Az alacsony dózisú ROS elengedhetetlenspermium kapacitás, az akroszóma reakció és a spermium-petesejtek fúziója [24, 25]. A ROS túlzott felhalmozódása azonban gyakran a csírasejtek és a stromasejtek károsodásához vezet, ami férfi meddőséghez vezet [26]. A ROS könnyen károsíthatja a sejtmembránokat, nukleinsavakat, fehérjéket, enzimeket és más biológiai makromolekulákat a peroxidáció révén. Ezenkívül potenciális sejt- és DNS-károsodáshoz is vezethetnek, ha meghaladják az antioxidáns-szállító kapacitást. A felhalmozott bizonyítékok alátámasztják a ROS kulcsfontosságú szerepét a férfiak termékenységének patogenezisében [27, 28]. A ROS termelését az oxigénfeszültség szabályozza. Hipoxiás körülmények között csökken a rendelkezésre álló oxigén a környezetben, és nő a vér viszkozitása, ami hatással van számos oxigénfüggő anyagcsere-folyamatra a szervezetben [29, 30]. A nagy magasságban tapasztalható alacsonyabb légköri nyomás azonban rossz vénás visszaáramlást és a véráram által a szervezet összes sejtjébe szállított oxigén mennyiségének csökkenését okozza, ami tovább fokozza a szervek és sejtek hipoxiáját [29, 30]. Így a nagy magasságnak való kitettség egy sor hipoxiás fiziológiai reakciót vált ki, beleértve a ROS termelését és felhalmozódását, amikor az oxigénigény meghaladja az érrendszeri ellátást. Amint azt korábban említettük, a ROS felhalmozódása számos intracelluláris hatáshoz vezet, amelyek közül a legkritikusabb az OS előidézése a sejtekben.

Az OS az oxidációs és redukciós reakciók közötti egyensúlyhiányra utal, ami oxidálószerek vagy molekulák feleslegéhez vezet, amelyek elektront fogadnak el egy másik reagenstől, ami viszont ROS-t termel [31, 32]. Jól ismert, hogy az operációs rendszert számos endogén és exogén tényező váltja ki, beleértve a nagy magasságnak való kitettséget. A spermiumok olyan sejtek, amelyek különösen érzékenyek az OS-re, tekintettel a nem megfelelő sejtjavító rendszerre és a többszörösen telítetlen zsírsavak magas plazmamembrántartalmára [33]. Ez alól a here és a mellékhere szövetei sem kivételek, mivel hipoxiának kitett patkányok kerek spermatidjaiban súlyos OS jelenlétét figyelték meg [4]. Az OS befolyásolja a DNS stabilitását, ezáltal veszélyezteti az ivarsejtek genetikai anyagának integritását [34-36]. A hím ivarsejtekben tapasztalható magas szintű DNS-károsodás azonban bebizonyosodott, hogy az apoptózis jelátvitel aktiválásához vezet, ami az epididimális spermiumok számának csökkenését és a hibás sejtek százalékos arányának növekedését eredményezi [28, 37]. Jelen tanulmányban a hipoxia szignifikánsan csökkentette a GC-1 sejtek életképességét az apoptózis indukciója és a sejtciklus leállása révén. Ennél is fontosabb, hogy az FCM analízis szignifikánsan megnövekedett ROS-szintet mutatott ki hipoxiás stimulációt követően, megnövekedett apoptózisaránnyal, valamint a kaszpáz-3, PARP és Bax/Bcl-2 arány magasabb aktiválódásával, ami azt jelzi, hogy a ROS aktiválódhat. apoptózist a kaszpáz jelátviteli útvonal aktiválásával a hipoxia által kiváltott termékenységi károsodás során. A jelen eredmények azt mutatták, hogy a hipoxia túlzott ROS-felhalmozódáshoz vezetett, ami oxidatív károsodást okoz a reproduktív sejtekben. Ezért érdemes új antioxidánsokat azonosítani, amelyek hatékony megközelítésként szolgálhatnak a hipoxia által kiváltott termékenységi károsodások enyhítésében.

Az OS elleni védelem érdekében a szervezetben egy összetett antioxidáns rendszer létezik, amely főként enzimatikus faktorokból áll. Fiziológiás körülmények között a ROS-tartalom és az antioxidáns rendszer bizonyos egyensúlyt tart fenn. A ROS túltermelés azonban kimeríti a spermiumok antioxidáns rendszerét, ami OS-hez vezet, ami a spermium DNS-ének károsodását okozza, és alacsonyabb termékenységet és terhességi arányt eredményez [23]. Így a ROS-túltermelés és az ezzel összefüggő káros hatások kezelésére a sejtek szintjén a férfi reproduktív rendszerben különböző antioxidáns stratégiákat teszteltek [23]. Jelenleg az antioxidáns hatású vegyületek alkalmazására vonatkozó szakirodalom illa spermiumok működésének javításakiterjedt. Fontos, hogy a legtöbb jelentés a spermaparaméterek javulását írja le orális antioxidáns bevitel után, beleértvea spermiumkoncentráció javulásaés a motilitás vagy a DNS-károsodás csökkenése [38]. Így egyre több urológus ír fel orális antioxidánsokat az OS-problémák miatti meddőségre [39]. Ezek az antioxidánsok főként karnitineket, vitaminokat, cinket, melatonint és természetes vegyületeket tartalmaznak [23, 40]. Jelenleg a gyógyszerkivonási technológia fejlődésével egyre több TCM-kivonat is felmerül a férfi meddőség enyhítésére, mivel ezek az antioxidánsok csökkenthetik az OS pusztító hatásait [41]. Yüce A. et al. 2013-ban beszámoltak arról, hogy a fahéj jótékony hatással van a herék oxidatív és antioxidáns egyensúlyára és a spermium minőségére [42]. Zhang L et al. kimutatták, hogy a kurkumin szignifikánsan javítja a spermiumok mozgékonyságát a betegekben és csökkenti a H2O2-t [43]. Ezenkívül számos más növényi kivonatról, mint például az áfonya, a crocus sativus, a gránátalma magvak és a zöld tea, szintén kimutatták, hogy antioxidáns mechanizmusokon keresztül védik a reproduktív rendszert [27, 44-47]. A Cistanches Herba egy fontos TCM, amely kedvező biztonsági profillal és széles körű gyógyászati ​​funkciókkal rendelkezik többek között a meddőség kezelésében [13]. A modern farmakológiai vizsgálatok kimutatták, hogy a Cistanches Herba különféle aktivitásokkal rendelkezik, például antioxidáns, gyulladáscsökkentő, májvédő és neurodegeneratív betegségek elleni hatással [13, 48]. Ezért a Cistanches Herba kivonatai, frakciói vagy vegyületei potenciális antioxidáns tulajdonságokkal rendelkezhetnek a meddőség kezelésére.

A növények termékenységét javító hatóanyagai közé tartoznak a különféle kémiai csoportok, például a PhG-k, a szaponinok, az oxigénes illékony vegyületek és az alkaloidok [41]. A PhG-k farmakológiai aktivitásának vizsgálatai kimutatták, hogy a PhG-k számos biológiai aktivitást mutatnak, például antioxidáns, sugárzás elleni neuroprotektív és szexuális funkciójavító hatású [49, 50]. E tevékenységek közül az antioxidáció fokozatosan felkelti a figyelmet. A PhG-k egyes komponenseiről vagy frakcióiról beszámoltak arról, hogy gátolják a különféle vegyszerek által kiváltott csírasejt-apoptózist, és in vitro antioxidáns képességüket in vivo is igazolták több állatmodellben [51, 52]. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a PhG-k vonzó jelöltek lehetnek aférfi meddőség kezelése. A cis egy aktív PhG, amely a Cistanches Herbából izolálható. Jelen tanulmányban feltártuk a Cis hipoxiával kezelt sejtekre vagy patkánymodellre gyakorolt ​​hatásait, és megvizsgáltuk a mögöttes molekuláris mechanizmusokat. A cisz protektív hatást mutatott a hipoxia által kiváltott életképesség csökkenésével és az apoptózis növekedésével szemben a GC-1 sejtekben, valamint protektív hatást mutatott patkányok reproduktív rendszerének hipoxia által kiváltott károsodására in vivo. A GR, GPx és SOD aktivitások szignifikáns csökkenése hypoxia esetén a normoxiás csoportokhoz képest, míg a GR, GPx és SOD fajlagos aktivitása szignifikánsan nőtt a Cis-szel kezelt herékben vagy GC-1 sejtekben. Úgy tűnt, hogy a cisz megvédi a heréket és a GC{5}} sejteket hipoxiás körülmények között azáltal, hogy fokozza az antioxidáns enzimek aktivitását.

Az enzim antioxidánsok főként a szuperoxid-anionok megkötésével működnek, így megakadályozzák a lipidperoxidációt és a DNS-károsodást a meddőség megelőzésére. Az enzimatikus antioxidáns mechanizmusok döntő szerepet játszanak az oxidatív károsodások megelőzésében [23]. Az OS elleni enzimatikus mechanizmus szabad gyökfogókból és glutation-függő enzimekből áll, beleértve a GR-t, GPx-t és SOD-t [12]. Köztudott, hogy az antioxidáns enzimek nélkülözhetetlenek a férfiak reproduktív rendszeréhez. A jelenlegi tanulmányban a csökkent antioxidáns enzimaktivitások hipobáriás hipoxia esetén a ROS és LPO növekedésével jártak együtt a modellcsoportban, ami összhangban van a korábbi jelentésekkel [12]. A cisz beadása azonban az antioxidáns enzimaktivitások helyreállását eredményezte a GC-1 sejtekben és a patkányok heréiben, lehetővé téve a Cistanches Herba beadására vonatkozó stratégiák kidolgozását a hipobárikus hipoxia által kiváltott károsodások megelőzésére, amint azt korábban javasoltuk. Bár a jelen eredmények azt mutatták, hogy a Cis-kezelés részben csökkentette a hipoxia által kiváltott csírasejt-károsodást patkányokban, további vizsgálatok szükségesek a reprodukciós védőhatások teljes képének feltárásához. Például a cisz specifikus mechanizmusa befolyásolja az antioxidáns enzimek aktivitását. Ezenkívül kérdéses, hogy más mechanizmusok is helytállóak lehetnek-e, mivel a Cis csak részben gyógyult a hipoxia okozta reproduktív károsodásból. Végül azt is mérlegelni kell, hogy a cisznek van-e közvetlen növekedést serkentő hatása a csírasejtekre.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA A SPERMA AKTIVITÁS FENNTARTÁSÁRA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Következtetések

Általánosságban elmondható, hogy a tanulmány eredményei hangsúlyozzák a cisz antioxidáns potenciálját a hipoxia által kiváltott férfi reproduktív károsodások kezelésében. A cisz az antioxidáns enzimaktivitás helyreállításával, a ROS által kiváltott OS-vel, egyidejűleg növeli a sejtek életképességét és csökkenti az apoptózist, védelmet nyújthat a hipoxia által kiváltott hím reproduktív károsodás ellen. Fontos, hogy az ebben a vizsgálatban vizsgált Cis altípusok (Cis-A, Cis-B, Cis-C és Cis-H) mindegyike bizonyos védőhatást mutatott a reproduktív rendszerre, a Cis-B pedig a legjelentősebb hatást. Ezért azt feltételezzük, hogy a cisz jó antioxidáns jelölt lehet ahipoxia által kiváltott férfi reproduktív károsodások kezelése, bár a pontos mögöttes mechanizmus további vizsgálatot igényel.