A Cistanche Tubulosa-ból származó kalkon-szintáz klónozása, funkcionális azonosítása és expressziós elemzése Ⅱ
Mar 25, 2024
3 Eredmények és elemzések
3.1 A CtCHS gén klónozása
Négy „kalkon-szintáz”-ként jelölt szekvenciát szűrtünk ki a Cistanches tubulosa virágok transzkripciós adatai alapján. Az NCBI Blast-összehasonlítása során azt találták, hogy csak egy szekvencia rendelkezik a CHS gén teljes hosszúságával, és csak egy szekvencia rendelkezik 10-nél nagyobb FPKM-értékkel. E szekvencia alapján specifikus primereket terveztünk, és egy körülbelül 1200 bp méretű fragmenst kaptunk PCR-amplifikációval. Cistanches tubulosa virág cDNS-e templátként (1. ábra). A PCR-terméket gélből kinyerjük, és a pCE2TA/Blunt-Zero vektorhoz kapcsoljuk. A szekvenálási eredmények összhangban voltak a transzkriptomanalízissel. A gént CtCHS-nek nevezték el. A szekvencia hossza 1173 bp, és 390 aminosavat kódol.
A Wecistanche támogató szolgáltatása – a legnagyobb kínai exportőr:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel.:+86 15292862950
Vásároljon további specifikációkért:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
3.2 A CtCHS bioinformatikai elemzése
3.2.1 A CtCHS fizikai és kémiai tulajdonságai és a transzmembrán domén analízise
A ProtParam online szoftvert használták a CtCHS gén által kódolt fehérje fizikai és kémiai tulajdonságainak elemzésére. A CtCHS 390 aminosavat kódol, molekulaképlete C1908H3041N511O562S22, relatív molekulatömege 42 836,54, elméleti izoelektromos pontja 5,85, és instabil. A II koefficiens 43,24, ami instabil fehérje, és az általános átlagos hidrofilitás (GRAVY) -0,052, ami egy hidrofil fehérje. A Prot Scale online eszközt használták tovább a fehérje hidrofil/hidrofób jellegének elemzésére. Az elemzési eredmények azt mutatták, hogy a CtCHS fehérje hidrofilitás/hidrofóbicitás maximális értéke 2,422 (342), a minimális érték pedig –2,489 (119). A CtCHS gén által kódolt aminosav peptidlánc több hidrofil aminosavból áll, mint hidrofób aminosavból, tehát hidrofil fehérje. A TMHMM online szoftvert használták a fehérje transzmembrán szerkezetének előrejelzésére. A CtCHS fehérjének nincs transzmembrán doménje.
1. ábra CtCHS gén PCR amplifikációja
3.2.2 A CtCHS fehérje másodlagos és harmadlagos szerkezetének előrejelzése
A SOPMA online eszközt használták a fehérje másodlagos szerkezetének előrejelzésére. Az eredményeket az 2-A. ábra mutatja. 44,87% -hélix, 31,03% véletlenszerű tekercs, 15,64% kiterjesztett lánc és 8,46% -lap alkotja a CtCHS fehérje másodlagos szerkezetét. szintű szerkezet. A SWISS-MODEL online elemzőszoftvert használták a fehérje harmadlagos szerkezetének előrejelzésére, a rizs CHS1 kristályszerkezetét pedig templátként a CtCHS fehérje háromdimenziós szerkezetének előrejelzésére. Az eredményeket a 2-B. ábra mutatja. A Cistanche tubulosa CtCHS és a rizs CHS1 konzisztenciája 83,55%.
3.2.3 Szekvencia-összehasonlítás és filogenetikai faelemzés és alkalmazás
A DNAMAN szoftver homológia összehasonlítást végez a CtCHS és más fajok CHS aminosavszekvenciái között. Az eredményeket a 3-C. ábra mutatja. A CtCHS aminosavszekvenciája összhangban van a Sesamum indicum L. (XP_011091402.1) és az Antirrhinum majus L. (P06515. 1), a Mazus pumilus (NL Burman) Steenis (AAN05791.1), az Erythranthe lewisiiG fajokkal. L. Nesom & NS Fraga (AHJ80976.1), Perilla frutescens (L.) Britton (O04111.1 ) és Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (NP_196897.1). A CHS aminosavszekvenciája nagyon hasonló, a hasonlóság 90,93%, 90,68%, 90,18%, 89,42%, 89,42% és 81,61%.
TERMÉSZETES SZERVES CISTANCHE KIVONAT 30% ECHINACOSIDAL ÉS 12% AKTEOZIDAL
Ezenkívül a többszörös szekvencia-illesztés azt is megmutatta, hogy a CtCHS megőrizte a Cys164, His303 és Asn336 katalitikus maradékait. Annak érdekében, hogy jobban megértsük a Cistanche tubulosa CtCHS evolúciós helyzetét a növényi CHS családban, MEGA-X szoftvert használtunk egy filogenetikai fa létrehozására más növények CtCHS és CHS fehérjéi között. Az eredményeket a 3-DE lewisii AHJ80976.1) ábra mutatja. Az ElCHS szorosan összefügg.
3.3 CtCHS prokarióta expresszió és tisztítás
A pET-28a-CtCHS plazmidot E. coli BL21 (DE3) expressziós törzsbe transzformáltuk, és a fehérjeexpressziót alacsony hőmérsékleten IPTG indukálta. A fehérjét nikkelion affinitás kromatográfiás oszlopon tisztítottuk, és a tisztított fehérjét 10%-os SDSPAGE-val detektáltuk. Az eredmények a 3. ábrán láthatók. A CtCHS fehérjesáv 40,000 közelében jelent meg, ami összhangban van a CtCHS fehérje 42 800-as relatív molekulatömegével.
3.4 CtCHS enzimaktivitás elemzése
A CtCHS funkciójának azonosítására a tisztított CtCHS fehérjét malonil-CoA-val, 4-kumaroil-CoA-val inkubáltuk, majd a termékeket HPLC és MS segítségével detektáltuk. Természetes körülmények között a naringenin-kalkon oldatban instabil, és könnyen ciklizálódik naringeninné. Ezért a naringenin-kalkont és a naringenint választottuk standard kontrollként.
A HPLC-teszt eredményeit az 4-A és B. ábra mutatja. Az enzimreakciótermék retenciós ideje hasonló a naringenin standardéhez. Mindkettő maximális abszorpciója 289 nm-en van az UV abszorpciós spektrumban, ami eltér a naringenin-kalkon retenciós idejétől. Az idő és az UV abszorpciós spektrum eltérő volt, de negatív kontrollként a magas hőmérsékleten inaktivált CtCHS fehérje szubsztráttal történő inkubálása után a termék nem tartalmazott naringenint, kalkont és naringenint. További tömegspektrometriás kimutatás, az első szintű tömegspektrum (4-C, D ábra) azt mutatta, hogy az enzimreakciótermék [MH]-csúcs m/z271.060 97, míg a naringenin [MH ]-csúcs m/z 271.{13}}.
Az MS2 spektrumokat összehasonlítva (5-E, F ábra), a CtCHS enzim reakcióterméke és a naringenin egyaránt jellegzetes fragmenscsúcsokkal rendelkezik m/z 107, 151 és 177 értéknél, ami összhangban van az irodalmi jelentéssel [19]. jelezve, hogy a CtCHS kalkon komplexet tartalmaz. Enzimaktivitás, katalizálhatja a malonil-CoA és a 4-kumaroil-CoA naringenin-kalkonná történő reakcióját.
3.5 Szubcelluláris lokalizáció elemzése
A CtCHS fehérje sejtekben betöltött szerepének tanulmányozására a pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS plazmidot megszerkesztettük, és Arabidopsis thaliana protoplasztokba transzformáltuk, hogy megfigyeljük annak szubcelluláris lokalizációját. Az eredményeket az 5. ábra mutatja. Kontrollként a pCAMBIA1300-35S-GFP fehérje a sejtmagban és a citoplazmában, míg a pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS fúziós fehérje főként a sejtmagban oszlik el. a citoplazma, ami azt jelzi, hogy a CtCHS fehérje működhet a növényi sejtek citoplazmájában. Funkció.
3.6 CtCHS expressziós mintázat elemzése
A qRT-PCR segítségével kimutatták a CtCHS relatív expresszióját a Cistanche deserticola virágokban három színben: fehér, lila és piros. Az eredményeket a 6. ábra mutatja. A CtCHS expressziója a lila és piros virágokban szignifikánsan magasabb volt, mint a fehér virágokban. Mennyiség. A fehér virágokhoz képest a lila virágokban a CtCHS expressziós szintje 8,44-szer, a piros virágokban a CtCHS expressziós szintje 3,21-szer magasabb. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a CtCHS expressziós szintjének változásai összefüggésben lehetnek a Cistanche deserticola virágszínének különbségével. Minél magasabb az expressziós szint, annál sötétebb a virág színe. , minél alacsonyabb az expressziós szint, annál világosabb a virág színe.
****P＜0.000 1ábra. 6 CtCHS relatív expressziós szintje különböző színű virágokban
4. Megbeszélés
A CHS akulcsenzim a flavonoidok bioszintézisébenés kapcsolódik a the virágszín szabályozásasok növényben. Például a virág színeDianthus chinensisL.[20] és Petunia × hybrida Hort. exVilm.[22] mindegyiket érinti a CHS. ellenőrzés.Cistanches tubulosafőként három virágszíne van: fehér, piros és lila, de virágszínszabályozó mechanizmusáról még nem számoltak be. Ebben a vizsgálatban egy CtCHS gént klónoztak RT-PCR segítségévelCistanches tubulosa virágok átírási adatelemzése, és annak
Bioinformatikai elemzésAz eredmények azt mutatták, hogy a CtCHS nagy hasonlóságot mutat és szoros genetikai rokonságot mutat a Physalis nigra (AHJ80976.1) ElCHS aminosavszekvenciájával. A CHS egy III. típusú poliketid szintáz (PKSIII), és a vizsgálatok azt találták, hogy a CHS konzervált Cys-His-Asn katalitikus triáddal rendelkezik [23]. Ebben a vizsgálatban az aminosavszekvencia-illesztési analízis kimutatta, hogy a CtCHS konzervált katalitikus oldalláncokat tartalmaz a Cys164, His303 és Asn336, ami azt jelzi, hogy a CtCHS tipikus kalkon szintáz funkcióval rendelkezhet.
képes. Az enzimaktivitás-analízist a CtCHS fehérje prokarióta expressziójával Escherichia coliban végeztük, és HPLC-vel és MS-sel detektáltuk. Azt találták, hogy a CtCHS fehérje képes katalizálni a 4-kumaroil-CoA és malonil-CoA naringenin-kalkon előállítását.
A CHS számos növényben részt vesz a flavonoidok szintézisében, de szubcelluláris elhelyezkedése különböző fajokban eltérő. Például Carthamus tinctorius L. CtCHS1[24], Morus atropurpurea Roxb. MaCHS[25], Eupatorium adenophorum Spreng. Minden egyes eaCHS[26] a citoplazmában található, míg a Paeonia delavayi var. lutea (Delavay ex Franch.) Finet et Gagnep. PdCHS
[27], a padlizsán Solanum melongena L. SmCHS [28] a citoplazmában és a sejtmagban, a szőlőben a Vitis vinifera L. VvCHS a citoplazmában, a sejtmagban és a sejtfalban található [29]. Ebben a vizsgálatban a pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS plazmidot használták Arabidopsis thaliana protoplasztok transzformálására, és megfigyelték, hogy a CtCHS fehérje főként a citoplazmában lokalizálódik, és katalizálhatja a naringenin-kalkon képződését a citoplazmában. elősegíti a flavonoidok felhalmozódását.
A fenilpropanoid útvonal a 4-kumaroil-CoA-ból a flavonoid szintézis útjába és a lignán bioszintézis útjába ágazik. A CHS katalizálja a 4-kumaroil-CoA-t és a malonil-CoA-t, hogy naringenint és kalkont hozzon létre a flavonoidok elindításához. A vegyületszerű vegyületek bioszintetikus útja az első kulcsenzim ezen az úton [30]. Ezért az erősen expresszált CHS előnyös a növények számára, hogy magasabb flavonoidokat halmoznak fel, és sötétebb virágokat hoznak létre. Például a Hosta plantaginea (Lam.) Aschers lila virágú fajtáiban a CHS expressziós szintje magasabb, mint a fehér virágú fajtáké. A Hosta HpCHS-t dohányná alakítják, hogy megkapják. A vad típusú dohányhoz képest a túlzottan expresszált növényeknek sötétebbek a szirmai és magasabb az összes antocianin tartalma [31].
Ebben a vizsgálatban a CtCHS gén expressziós szintje összefügg a Cistanches tubulosa virágok színével. Erősen kifejeződik a sötétebb lila virágokban és a piros virágokban, és kevés a világos színű fehér virágokban. A CtCHS expressziós különbsége a Cistanches tubulosa virágok eltéréséből adódhat. A különböző öltönyök és színek egyik oka. Összefoglalva, ez a tanulmány klónozott egy CtCHS gént a Cistanche deserticola virágaiból, és bioinformatikai elemzést végzett rajta. A CtCHS rekombináns fehérjét Escherichia coliban exogén expresszióval kaptuk. Az enzimaktivitás-analízis bebizonyította, hogy a CtCHS fehérje képes katalizálni a 4-kumaroil koenzimet. Az A és a malonil-koenzim A naringenin-kalkont generál. Azt találták, hogy a CtCHS gén erősen expresszálódik a lila és vörös virágokban, és alacsony a fehér virágokban. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a CtCHS gén szabályozhatja a különböző virágszínek termelődését Cistanche deserticolában, ami előnyös a Cistanche tubulosa virágszín szabályozási mechanizmusának további kutatásában, és referenciaként szolgál a CtCHS szerepének a szabályozásában. virágszín a Cistanche deserticolában.
