A Cistanche Tubulosa-ból származó kalkon-szintáz klónozása, funkcionális azonosítása és expressziós elemzése

Absztrakt: Cél

Funkciójának tanulmányozásárakalkon-szintáz a Cistanche tubulosa-bólvalamint a CtCHS gén expressziós mintázata fehér, piros és lila virágokban.

MódA CtCHS gént RT-PCR-rel klónoztuk és bioinformatikai analízist végeztünk. A pET-28a-CtCHS plazmidot Escherichia coliba vittük át, hogy IPTG-vel fehérjeexpressziót indukáljunk. A CtCHS rekombináns fehérjét p-kumaroil-CoA és malonil-CoA szubsztrátokkal inkubáltuk, és a termékeket HPLC-vel és MS-sel detektáltuk. A pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS plazmidot az Arabidopsis thaliana protoplasztjába vittük át, hogy megfigyeljük a CtCHS fehérje szubcelluláris lokalizációját. A CtCHS gén expressziós mintázatát a C. tubulosa virágaiban három színnel qRT-PCR-rel detektáltuk.

EredményekEgy CtCHS gént klónoztak. A nyitott leolvasási keret (ORF) hossza 1173 bp volt, amely 390 aminosavat kódol, a fehérje molekulatömege pedig 42 8000 volt.

SZERVES CISTANCHE KIVONAT 30% ECHINAKOZIDAL ÉS 12% AKTEOZIDAL

A CtCHS a Cys164, His303, Asn336 katalitikus maradékokat tartalmazza, amelyek kalkonszintázban konzerváltak. A CtCHS fehérjét E. coliban expresszáltuk és tisztítottuk, hogy megkapjuk a rekombináns fehérjét. A CtCHS fehérje katalizálhatja a p-kumaroil-CoA-t és a malonil-CoA-t naringenin-kalkon előállítására. A CtCHS fehérje főként a citoplazmában lokalizálódott. A CtCHS gén erősen expresszálódott a lila és piros virágokban, és a relatív expressziós szintek 8,44-szer, illetve 3,21-szer magasabbak voltak, mint a fehér virágokban.

Következtetések A C. tubulosa virágából CtCHS gént klónoztunk, és fehérjét expresszáltunk. A CtCHS fehérje kalkon szintáz funkcióval rendelkezik, és a CtCHS gén expressziója magasabb a sötétebb virágokban, ami azt jelzi, hogy a CtCHS gén szabályozhatja a C. tubulosa virágszínét, ami megalapozza a C virágszín szabályozási mechanizmusának további kutatását. tubulosa.

Kulcsszavak: Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; kalkon-szintáz; enzimaktivitás elemzése; szubcelluláris lokalizáció; kifejezés elemzése

Cistanche Tubulosa(SCHENK) A WIGHT a Pyrealis növény nemzetség, amely természetes elterjedt Hszincsiang déli részén [1], Hszincsiang Hetian területén [2]. A pipavirágok gyógyászati ​​értékűek. Hússzára a 2020-as verzió egyik forrása.Kínai Gyógyszerkönyv". [3] A pipavirágok cordonus hússzárának kutatása megnövekedett, de virágaira viszonylag kevés biológiai kutatás létezik. A pipavirágok virágzási ideje áprilistól májusig tart [4], főként A fehérnek három színe van , piros és lila A pipavirágok színben gazdagok, de a virágszín szabályozási mechanizmusukról nem számoltak be és genetikai tényezők [5] A növényi virágokban található pigment főként három kategóriát foglal magában: a flavonoidokat, a karotint és a színt, a legszélesebb körben. A flavonoidok típusai és tartalma sok növény színét befolyásolja mint a Paeonia Lactiflora Pall három fajtája.

Fehérként jelenik meg, a szín fő színe pedig a piros színét tartalmazza és a szép kompetencia lila-piros színben jeleníti meg a virágokat [8]. A virágszín sok dísznövény fontos jellemzője, és ez a kulcsfontosságú tényező, amely vonzza a rózsaszín rovarokat [9]. Tanulmányok kimutatták, hogy öröklődik. A rovarok leggyakrabban látogatói a mélylila cisztancse növény [10]. A csővirág Cistanosaurus virágaiban előforduló cisztanoidok szintetikus genetikai kutatásával kapcsolatos biológiai kutatások számára elősegíti a csővirágkordon színezési szabályozási mechanizmusának tisztázását, elméleti alapot adva a géntechnológiai technológia színének javításához, gazdagabb színeinek elősegítéséhez, a láthatóság növeléséhez, az alkalmazások körének bővítése.

A bioszintetikus útjaflavonoidok-vel kezdődikfenilpropanoid útvonal. A fenilalanin először fahéjsavvá alakul a fenilalanin-ammonializ (PAL) hatására, és a fahéjsavat a fahéjsav 4-hidroxilálja. Az enzim (fahéjsav-4-hidroxiláz, C4H) és a 4-kumarát-koenzim-A-ligáz (4-kumarát-koenzim-A ligáz, 4CL) katalizálja a reakciót 4-kumaroil-CoA előállítására. [11]. Egy molekula 4-kumaroil-CoA és három malonil-CoA molekula katalizálódik a kalkon szintáz (CHS) által, így naringenin kalkon keletkezik, amelyflavonoid vegyületek.A kalkon-izomeráz, a flavanon-3-hidroxiláz, a dihidroflavonol-4-reduktáz stb. alapváza számos flavonoidot termel, mint például izoflavonokat, flavonolokat, antocianinokat stb. [12]. A flavonoidok bioszintetikus folyamatában kulcsenzimként a CHS szabályozza a flavonoidok tartalmát a növényekben, és fontos szerepet játszik a növények virágszínének szabályozásában is [13]. Például a Gentiana scabra Bunge CHS transzkripciós géncsendesítése gátolhatja az antocianinok bioszintézisét, és a corolla lebenyek specifikus fehéredését okozhatja [14]. Az Actinidia eriantha Benth CHS géncsendesítése. A CHS csökkenti a szirmok antocianin tartalmát és okoz A piros szirmok színe világosabbá válik [15]. Ezért ebben a tanulmányban egy CtCHS gént klónoztak Cistanche deserticola virágaiból, és bioinformatikai elemzést, prokarióta expressziót és tisztítást, enzimaktivitás-analízist, szubcelluláris lokalizációs analízist és expressziós elemzést végeztek három virágszínben a CtCHS funkciójának feltárására. fehérjét és a CtCHS gén expressziós mintázatát használtuk a CtCHS és a Cistanche deserticola virágszín közötti kapcsolat előzetes feltárására, amely megalapozta a Cistanche deserticola virágszín szabályozási mechanizmusának tanulmányozását.

1 Anyagok és eszközök

1.1 Anyagok

A Cistanche tuberosa virágait Yutian megyéből, Hotan prefektúrából, Hszincsiangból gyűjtöttük 2018 májusában. A mintavétel során a véletlenszerű elvet követtük, és jó fiziológiai állapotú és állandó növénymagasságú Cistanche tuberosa virágokat választottunk ki. Tu Pengfei, a Pekingi Egyetem Gyógyszerészeti Iskola professzora három Cistanche deserticola törzset vett ki három virágszínnel: fehér, piros és lila, és Cistanche tubulosa (Schenk) Wight néven azonosította őket. Gyorsan lefagyasztották őket folyékony nitrogénben, szárazjégen tárolták és Pekingbe szállították. Az E. coli DH5 kémiailag kompetens sejteket a Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd.-től, az E. coli BL21 (DE3) kémiailag kompetens sejteket pedig a Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.-től vásároltuk; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP A vektort a Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd.-től vásároltuk. A malonil-CoA-t a Sigma Company-tól vásároltuk, 4-kumaroil-CoA, naringenin - a kalkont a Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.-től, a naringenint pedig a Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.-től vásárolták.

1.2 Műszerek

Nanodrop 2000C spektrofotométer (Thermo Fisher Company, USA); gradiens PCR készülék (Eppendorf Company, Németország); CFX 96 fluoreszcencia kvantitatív PCR műszer, UVP gél képalkotó, gélelektroforézis műszer, fehérje elektroforézis műszer (BioRad Company, USA); EnSpire

Mikrolemez olvasó (PerkinElmer Company, USA); állandó hőmérsékletű inkubátor (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D nagy kapacitású, teljes hőmérsékletű oszcillátor (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82Vízfürdő állandó hőmérsékletű oszcillátor (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); AIRTECH ultra-tiszta munkapad (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); nagynyomású gőzsterilizáló (TOMY Company, Japán); Milli Q tisztavizes műszer (Millipore, Egyesült Államok); LC-20Nagy hatásfokú folyadékfázisú kromatográf (Shimadzu Company, Japán); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap nagy felbontású tömegspektrometria (Thermo Fisher Company, USA); FV1200 lézeres konfokális mikroszkóp (Olympus Company, Japán).

2 Kísérleti módszerek

2.1 RNS extrakció és cDNS szintézis. A Cistanche deserticola virágait folyékony nitrogénben őröltük, majd RNS extrakciós vizsgálatnak vetettük alá.

A teljes RNS-t egy kit (Norgen, Cat 17200) segítségével extraháltuk, az RNS koncentrációját és minőségét NanoDrop 2000C-vel detektáltuk, és 1,8 és 2,1 közötti A260/A280 arányú RNS-mintákat választottunk ki a cDNS reverz transzkripciós szintéziséhez. M-MLV reverz transzkriptázt (Promega, M170B) használtunk a minősített teljes RNS cDNS-vé történő reverz átírására. A kísérleti műveleteket az utasítások szerint végeztük.

2.2 A CtCHS gén klónozása

Kutatócsoportunk Cistanche deserticola virágátírási adatai alapján [16] egy teljes nyitott leolvasási kerettel rendelkező CtCHS-t szűrtünk ki, és SnapGene szoftverrel terveztünk specifikus primereket a génszekvencia alapján (1. táblázat). A PCR-amplifikációt Cistanche deserticola virág cDNS-sel, mint templáttal végeztük. Az amplifikációs rendszer 2×Phanta Max Buffer 25 μL, dNTP Mix (10 mmol/L) 1 μL, upstream és downstream primerek (10 μmol/L) egyenként 2 μL, cDNS 2 μL, Phanta Max Super-Fidelity

DNS-polimeráz 1 μL, ddH2O 17 μL. A reakciókörülmények a következők voltak: elődenaturálás 95 °C-on 3 percig; 25 denaturációs ciklus 95 fokon 15 másodpercig, lágyítás 55 fokon 15 másodpercig, és meghosszabbítás 72 fokon 1 percig; és a reakciót 72 °C-on 5 percig meghosszabbítjuk. A PCR terméket 1%-os agaróz gélelektroforézissel detektáltuk, és a DNS-tisztító készletet (Novizan, Cat DC301-01) használtuk a gél kinyerésére, majd a kinyert DNS-t gyorsklónozó kittel (Novizan, Cat) tisztítottuk. C601-01). A DNS-fragmenst a pCE2 TA/Blunt-Zero vektorral ligáltuk, Escherichia coli DH5 kompetens sejtekbe transzformáltuk, és egy éjszakán át 37 °C-on végzett tenyésztést követően az egyklón törzseket kiválasztottuk, és elküldtük a cégnek szekvenálás céljából.

1. táblázat Primer szekvenciák

2.3 Bioinformatikai elemzés

Használja a ProtParam online szoftvert a fehérje fizikai és kémiai tulajdonságainak elemzéséhez; használja a Prot Scale online eszközt a fehérje hidrofil/hidrofób jellegének elemzésére; a SOPMA online eszköz használata a fehérje másodlagos szerkezetének előrejelzésére; használjon online elemző szoftvert SWISS-MODEL a fehérje harmadlagos szerkezetének előrejelzésére; online szoftver használata TMHMM A fehérje transzmembrán szerkezetének előrejelzése; használja a DNAMAN szoftvert a CtCHS homológiájának összehasonlítására más fajok CHS aminosavszekvenciájával; használjon MEGA-X szoftvert filogenetikai fa megalkotásához, szomszéd-illesztés (NJ) és Poisson-korrekció segítségével. Az evolúciós távolság kiszámítása Bootstrap módszerrel történik, és a Bootstrap ismétlések száma 1000-szer.

A további kimutatáshoz UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS-t használtunk. A folyadékfázis: Waters Acquity UPLC BEH Sheild RP18 oszlop (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), oszlop hőmérséklete 40 fok, naringenin , kalkon és naringenin. A kontrollanyag töltőtérfogata 4 μL, az enzimreakciótermék töltési térfogata 7 μL. Mozgófázisként vizet (A)-acetonitrilt (B) használunk. Az elúciós gradiens: 0-5 perc, 30% B; 5-15 perc. 30-60% B; 15-20 perc, 60-100% B; 20-25 perc, 100% B; 25-31 perc, 100-30% B. A térfogatáram 0,3 ml/perc. A tömegspektrometriás feltételek a következők: elektropermet ionforrás, nitrogén mint vivőgáz, védőgáz nyomása 3,5 MPa, segédgáz nyomása 1,0 MPa, permetezési nyomás 3500 V, kapilláris hőmérséklet 350 fok, segédgáz fűtési hőmérséklet 200 fok, pozitív és negatív ion módok, pásztázás iontartomány m/z 100-1500, teljes MS felbontás 35 000, dd-MS2 felbontás 17 500, (N)

CE/lépcsős nce 35-re, 60-ra állítva.

2.6 A CtCHS fehérje szubcelluláris lokalizációja

A CtCHS szekvencia és a zökkenőmentes klónozás elve alapján Kpn Ⅰ és BamH Ⅰ enzimvágó helyekkel rendelkező primereket terveztünk, és a megfelelő célfragmenseket PCR-rel amplifikáltuk. A pCAMBIA1300-35S-GFP plazmidot Kpn Ⅰ és BamH Ⅰ restrikciós endonukleázokkal emésztettük, és a célfragmenst és a vektort a zökkenőmentes klónozó készleten (Novizan, Cat C115-01) keresztül összekapcsoltuk, majd átvittük. E. coli DH5 kompetens sejtekbe. , válasszon ki egy klón törzseket a szekvenáláshoz, és vonja ki a plazmidokat a megfelelő törzsekből. A pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS és pCAMBIA 1300-35S-GFP plazmidokat Arabidopsis thaliana protoplasztokba transzformáltuk PEG4000 segítségével, és gyenge fényben tenyésztettük 8-10 órán át. A CtCHS fehérje szubcelluláris lokalizációját lézeres konfokális mikroszkóp alatt figyeltük meg.

2.7 CtCHS expressziós mintázat elemzése

A CtCHS szekvencia alapján a DNAMAN-t használtuk valós idejű fluoreszcens kvantitatív primerek tervezésére, az F-box belső referenciagénnel. A primer szekvenciákat az 1. táblázat mutatja be. A CtCHS relatív expresszióját különböző színű Cistanche deserticola virágokban valós idejű fluoreszcens kvantitatív PCR-rel detektáltuk. Használja a TransStart Green qPCR SuperMixet (teljes arany, AQ101-02) a SYBR Green fluoreszcens festékmódszerrel történő méréshez, reakciórendszer: 2×TransStart Green qPCR SuperMix 5 μL, upstream és downstream primerek (10)

μmol/L) {{0}},2 μL egyenként, cDNS templát 0,5 μL, nukleotidázmentes víz 4,1 μL, a reakcióhoz kétlépéses módszert alkalmaztunk, a reakcióeljárás a módszeren alapult Dong Xianjuan et al. [18]. Minden minta 3 biológiai ismétlést tartalmazott, és a kísérletet háromszor megismételtük. A kísérleti adatokat Excel to 2 segítségével elemeztük

A CtCHS relatív expresszióját a −ΔΔCt módszerrel számítottuk ki, a GraphPad Prism 8 segítségével pedig szignifikanciaanalízist végeztünk és hisztogramokat rajzoltunk.