Mikrobuborékos kontrasztanyag kombinálása pulzáló lézeres besugárzással transzdermális gyógyszeradagoláshoz, 1. rész

Absztrakt: A folyadékok lézerrel indukált mikrobuborékos (MB) kavitációjának optodinamikai folyamatát különféle orvosi alkalmazásokban használják. Azonban ritkán becsülik meg, hogy a beeső lézersugárzás hogyan lép kölcsönhatásba az MB-kkel, mint ultrahang-kontrasztanyagokkal, ha a folyadék már tartalmaz stabil MB-ket. Jelen tanulmány az albuminhéjú MB-k lézer-mediált kavitációjának hatékonyságát vizsgálta a transzdermális gyógyszerleadás fokozásában. Először az MB-k lézer-közvetített inerciális kavitációjának különböző típusait és feltételeit értékelték. Az in vitro és in vivo kísérletekben CO2 frakcionált impulzuslézert választottunk az MB-kkel való kombináláshoz. Az -arbutin in vitro bőrpenetrációja 2 óra elteltével kétszerese volt a lézert MB-kkel kombináló csoportban, mint a kontrollcsoportban. Kisállatokon végzett kísérletekben a C57BL/6J egerek bőrének fehérítő hatása abban a csoportban, ahol lézert MB-kkel és behatoló -arbutinnal kombináltak a bőrön, (szignifikánsan) 480 százalékkal nőtt a 11. és 5. napon. 0,0 százalék a 14. napon, majd stabilizálódott a 20-napos kísérleti időszak hátralévő részében. A jelen eredmények azt mutatják, hogy a CO2 lézer és az albuminhéjú MB-k kombinálása növelheti a bőr permeabilitását, hogy fokozza az -arbutin szállítását, hogy gátolja a melanogenezist egerekben a bőr károsítása nélkül.

A vonatkozó tanulmányok szerintcistancheegy közönséges gyógynövény, amelyet "az életet meghosszabbító csodanövényként" ismernek. Fő összetevője azcisztanozid, melynek különféle hatásai vannak, mint plantioxidáns, gyulladáscsökkentő, ésaz immunrendszer működésének elősegítése. A mechanizmus a cistanche ésbőrfehérítésantioxidáns hatásában rejlikcisztanche glikozidok. Az emberi bőrben a melanint a tirozin oxidációja katalizáljatirozináz. Az oxidációs reakcióhoz oxigén részvétele szükséges, így a szervezetben lévő oxigénmentes gyökök a melanintermelést befolyásoló fontos tényezővé válnak. A Cistanche cisztanozidot tartalmaz, amely antioxidáns, és csökkentheti a szabad gyökök képződését a szervezetben, ígygátolja a melanin termelését.

Kattintson a Cistanches Herba For Whitening elemre

további információért:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

1. Bemutatkozás

A kavitáció a folyadékban lévő üregek kialakulását jelenti, és általában akkor következik be, amikor a folyadékot gyors nyomásváltozásoknak teszik ki. Az ilyen nyomásváltozások sokféle módszerrel indukálhatók, akusztikus kavitáció akkor indul be, ha az alkalmazott akusztikus nyomás amplitúdója meghalad egy bizonyos küszöböt [1]. Az akusztikus kavitáció magában foglalja a folyadékokban lévő mikrobuborékok (MB) képződését, növekedését, pulzálását és összeomlását a nagy intenzitású ultrahang (US) hullámokkal végzett ultrahangos kezelés során. Úgy gondolják, hogy ezek a jelenségek felelősek a keveredésért, töredezettségért, erózióért, nedvesedésért, szonokapillárisért és egyéb hatásokért, amelyeknek különféle gyakorlati ipari alkalmazásai vannak [1].

Az MB kontrasztanyagok US által kiváltott kavitációja szintén fontos szerepet játszik mind a diagnosztikai, mind a terápiás orvosi alkalmazásokban. Az UH kontrasztanyagok stabilizált és bevont MB-k, amelyeket intravaszkulárisan fecskendeznek be a diagnosztikus UH képalkotás felbontásának javítása érdekében [2]. Számos tanulmány bizonyítja, hogy az MB-kontrasztanyagok vérben való jelenléte csökkentheti a különböző, UH által kiváltott biológiai hatások küszöbét mind in vitro, mind in vivo, mint például a hemolízis, a kapilláris ruptura és a sonoporáció [3]. Egyes tanulmányok kimutatták, hogy az MB kontrasztanyagok jelenléte a vérben szignifikánsan csökkenti az UH által kiváltott korai szívösszehúzódások küszöbét [4,5]. Az MB-k rezonanciája (stabil kavitáció) nemlineáris harmonikus emissziót eredményez, amely az MB-specifikus kontrasztos képalkotásban hasznosítható. Az inerciális kavitáció és az MB-k pusztulása erős mechanikai feszültségeket idézhet elő, amelyek növelik a sejtmembránok és a vér-agy gát permeabilitását, és javítják a terápiás szerek szállítását. Korábbi tanulmányainkban az USA által indukált MB-k inerciális kavitációját alkalmaztuk a transzdermális gyógyszerleadás (TDD) fokozására, mivel az inerciális kavitáció sokkal nagyobb permeabilitást eredményez a stratum corneumban, mint a stabil kavitáció [6–8] .

A lézeres besugárzás egy alternatív megközelítés a gyógyszeráteresztés fokozására, és ezáltal a gyógyszer bőrbe vagy a bőrön keresztül történő bejuttatásának megkönnyítésére. Ha egy bizonyos küszöbérték feletti intenzitású lézerimpulzust egy folyadékra fókuszálunk, a folyadék robbanásszerű párologtatása is MB-kavitációt válthat ki [9,10]. A lézerrel kiváltott kavitáció agresszív természete azt eredményezte, hogy számos alkalmazási területen alkalmazzák, beleértve a sejtlízist, a sejtmembrán-porációt és a szemsebészetet [11]. A közelmúltban frakcionált ablatív és nem ablatív lézerek alkalmazásával olyan stratégiákat mutattak be, amelyek biztonságosan javítják a posztoperatív, atrófiás és aknés hegek megjelenését [12]. Az ablatív lézeres bőrfelújítás biztosítja a legnagyobb klinikai javulást, de a műtét utáni felépülés több hetet vesz igénybe [13]. A nem-nablatív lézeres eljárások alkalmasabbak lehetnek olyan betegek számára, akik nem képesek vagy nem hajlandók elviselni a hosszan tartó posztoperatív gyógyulást. A korábbi herpes simplex fertőzés azonban újra aktiválódhat a nem lézeres bőrremodelláció után a lézer vagy más fényforrás által termelt intenzív hő hatására [13].

Kifejlesztettek néhány módszert a lézeres besugárzás által termelt hő csökkentésére, például kontakthűtő kézidarabok vagy dinamikus kriogén eszközök alkalmazása, amelyek képesek változó időtartamú hűtőpermet kibocsátására [14]. Arról azonban továbbra sincs egyetértés, hogy melyik hűtési módszer a leghatékonyabb a kezelés során. Ezen túlmenően, az Egyesült Államokkal ellentétben, a folyadékokban lévő stabilizált bevonatú MB-k lézer-indukált kavitációjának hatásai mögött meghúzódó mechanizmus továbbra is tisztázatlan.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Albumin-héjas MB-k gyártása

Az albuminhéjú MB-ket a korábbi vizsgálatainkban alkalmazott eljárás szerint állítottuk elő [7,15]. Röviden, albuminhéjú MB-ket állítottunk elő ultrahanggal 10 ml oldatban, amely 140 mg albumint (Octapharma, Bécs, Ausztria) és perfluor-szénhidrogén gázt tartalmazott fiziológiás sóoldatban (pH 7,4, { {21}},9 százalékos nátrium-klorid) szonikátorral (Branson Ultrasonics, Danbury, CT, USA) 2 percig. Az oldatban lévő perflfluor-szénhidrogénnel töltött albumin MB-k számát a MultiSizer III készülékkel (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) 30-µm-es apertúrájú szondával és 0,6–20 µm-es méréshatárokkal mértük. A szuszpenzióban a méreteloszlást dinamikus fényszórás alapján mérték (Zetasizer Nano, ZS90, Malvern, UK), ami azt mutatta, hogy az albuminhéjú MB-k átmérője 1,02 ± 0,11 µm (átlag ± SD) és koncentrációja 1,40 × 108 MBs/ml.

2.2. Lézer által kiváltott MB megszakítás 

Korábbi tanulmányok azt sugallták, hogy az USA által közvetített MB zavar (azaz inerciális kavitáció) szükséges a hatékony TDD-hez [8,16,17]. Jelen tanulmány az MB megszakítás hatékonyságát mérte különböző típusú lézerek különböző körülmények között történő alkalmazásakor. Az MB-k koncentrációját 2,8 × 107 MBs/ml-re (ötszörös hígítás) és 1,4 × 107 MBs/ml-re (tízszeres hígítás) állítottuk be Eppendorf-csőben, és a besugárzást négyféle lézerrel biztosítottuk: Léghűtéses argon-ion lézer. (515 nm, folyamatos hullám), szuperkontinuum szálas lézer (1064 nm, impulzushullám), Nd: YAG lézer (532 nm, impulzushullám) és CO2 frakcionált lézer (10 600 nm, impulzushullám). A különböző típusú lézerek részletes feltételeit az 1. táblázat tartalmazza.

Az optikai elrendezés egy példája az 1. ábrán látható. A lézeres besugárzás során bekövetkezett hőmérsékletváltozást hőmérővel mértük (Optris LS, Optris, Berlin, Németország). Ezután a lézerrel való érintkezés után 100 µl MB-oldatot adtunk egy mikroszkóp tárgylemezre megfigyelés céljából. A lézeres besugárzás előtti és utáni fénymikroszkópos képeken az MB-k számát MATLAB (The MathWorks, Natick, MA, USA) segítségével 8-bites szürkeárnyalatos képekké konvertálták, hogy megkönnyítsék az MB-megszakítás megfigyelését. Az MB-k pusztulási sebességét a sérült területek szerint számszerűsítettük a következő egyenlet segítségével:

2.3. Behatolási mélység a disznóbőrben

2.4. In vitro bőrpenetráció -arbutin oldattal

Egy {{0}} mm vastag sertésbőrmintát Humby-késsel gyűjtöttünk, gondosan megtisztítottuk PBS-sel, és négyzet alakú darabokra vágtuk (2 cm × 2 cm). A bőrminták 1,5 cm sugarú és 5 mm magas kör alakú területeit géllel vettük körül, hogy megakadályozzuk a szivárgást, amikor a mintát 5{{30}}0 µl MB-vel töltöttük fel. A minta hétszeri besugárzása után (a körülményeket az 1. táblázat tartalmazza) CO2 frakcionált lézerrel, a bőrbe való behatolást statikus Franz diffúziós cellák segítségével teszteltük 2,14 cm2-es területen a korábban leírt kísérleti terv szerint [7]. A diffúziós egység hőmérsékletét 37 ◦C-on tartottuk. -arbutin (30 mg/ml, 500 µL, 4-hidroxifenil- -D-glükopiranozid, molekulatömege=272,25 Da; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a bőr epidermális oldalára alkalmazva, és parafilmmel elzárva (Pechiney Laboratory Safety Products and Apparel, Chicago, IL, USA). A dermális oldal felé néző receptor diffúziós kamrát 12 ml PBS-sel (pH 7,4) töltöttük meg, amelyet 600 fordulat/perc sebességgel forgó mágnesrúddal kevertünk. Az MB-t nem tartalmazó tesztoldatokat 02-µm-es mikropórusos szűrőn (Nalgene, Rochester, NY, USA) vagy 022-µm-es mikropórusos szűrőn (Millex, Darmstadt, Németország) szűrtük. A receptoroldat alikvotjait (200 µl) 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 és 24 óra elteltével vettük, és ugyanolyan térfogatú friss receptoroldattal helyettesítettük.

2.5. Az -arbutin HPLC analízise

Egy Inspire™ C18 oszlopot (250 mm × 4,6 mm, 5 µm részecskeméret; Dikma Technologies, Lake Forest, CA, USA) használtunk az -arbutin-koncentrációk mérésére. A HPLC rendszert bináris szivattyúval (PU-2089, Jasco, Tokió, Japán) szerelték fel, és az ultraibolya (UV) detektor (UV-2075, Jasco) hullámhosszát 280 nm-re állítottuk. A mozgófázis metanolból és desztillált vízből állt (pH 5,5, 70:30 v/v) [18], 0,6 ml/perc sebességgel. Minden elemezni kívánt mintát 20 µl térfogatban injektáltunk. Az -arbutin retenciós ideje körülbelül 4,3 perc volt.

2.6. Állatkezelések

Az organoidok melanintartalmát C57BL/6J egérmodellben vizsgáltuk [19]. Az öthetes, 20–25 g tömegű egereket a Bio Lasco-tól (Taipei, Tajvan) szereztük be. A kísérleti protokollt a tajpeji Nemzeti Védelmi Egészségügyi Központ intézményi állatgondozási és felhasználási bizottsága hagyta jóvá. Az állatgondozási eljárások megfeleltek az intézményi irányelveknek és előírásoknak (IACUC-17-092 számú jóváhagyás). A kísérletek során az állatokat rozsdamentes acél ketrecekben tartottuk egy légkondicionált szobában, ahol a hőmérsékletet 25–28 ◦C között tartottuk, és 12 órás váltakozó fény-sötét ciklusokkal.

Az állatokat a kísérlet előtt 7 napig akklimatizáltuk. Miután a szőrüket 2 cm × 2 cm-es területről eltávolították, a bőr színét kromaméterrel (CR-400, Konica Minolta Sensing, Tokió, Japán) mérték meg. Az állatokat ezután ultraibolya B (UVB) sugárzásnak (G8T5E, Sankyo, Tokió, Japán) tették ki, hogy hiperpigmentációt váltsanak ki (teljes energiadózis expozíciónként=1 J/cm2, hullámhossz=306 nm, háromszor per héten 2 hétig), majd ismét megmérték a bőrszínt.

Az állatokat a következő öt csoportba osztották (n {0}} csoportonként, a kezelést 3 naponta egyszer alkalmazták 20 napon keresztül): (1) nincs kezelés (C csoport); (2) önmagában behatoló -arbutin (300 µg/ml, 0,2 ml/cm2) alkalmazása (A csoport); (3) a bőr közvetlen lézeres besugárzása behatoló -arbutin (300 µg/ml, 0,2 ml/cm2) alkalmazásával (L+A csoport); (4) a sóoldattal borított bőr lézeres besugárzása és behatoló -arbutin (300 µg/ml, 0,2 ml/cm2) alkalmazásával (L csoport plusz S plusz A); és (5) a bőr lézeres besugárzása MB-kkel kombinálva a bőrön és behatoló -arbutin (300 µg/ml, 0,2 ml/cm2) alkalmazásával (L csoport plusz MB plusz A). Az egyes kezelések által kiváltott bőrszín változást előre meghatározott időpontokban értékeltük kromaméter segítségével. Az L [20] luminozitási indexet minden mérési napon a kezelés előtt és után számítottuk ki.

2.7. Szövettani vizsgálat

Közvetlenül a kísérletek után bőrszövetmintákat (körülbelül 8 mm × 8 mm) vettünk a kezelt területről, és 10 százalékos formalinoldatban tároltuk. Hematoxilin és eozin (HE; Sigma-Aldrich) festést alkalmaztunk, és a mintákat szakértő dermatopatológus (HWG) elemezte. Néhány más mintát Fontana-Masson ezüst-nitráttal (Kojima Chemical, Kashiwabara, Japán) festettek 30 percig 60 ◦C-on, majd desztillált vízzel mostuk, és 5%-os nátrium-tioszulfát-oldatban (Duksan, Szöul, Korea) rögzítették 2 percig. perc, mielőtt ismét desztillált vízzel mossuk. A mintákat ezután nukleáris gyorsvörös oldattal (Fluka, Buchs, Svájc) festettük 5 percig, és kétszer mostuk desztillált vízzel. Végül a mintákat 95 százalékban dehidratáltuk, majd 100 százalékos etanollal, majd kétszer mostuk xilollal (Duksan) [21].

2.8. Statisztikai analízis

A kapott adatokat statisztikailag elemeztük Student-féle t-próbával. A p < 0,05 valószínűségi érték szignifikáns különbséget jelez.

3. Eredmények

3.1. Lézer által kiváltott MB megszakítás

A 10,8 mW-os folyamatos (léghűtéses argon-ion) lézerrel és 10,8 mW-os impulzusos (szuperkontinuális szálas) lézerrel 60, 120 és 180 másodpercig tartó, ötszörösére hígított MB-k mikroszkópos felvételeit a 2. ábra mutatja be. az impulzuslézer megsemmisítési aránya 17,66 százalékkal, 20,52 százalékkal és 39,05 százalékkal nőtt a folyamatos lézerhez képest 60, 120 és 180 másodpercnél. A 3. ábra az ötszörösen és tízszeres hígítású MB-k megsemmisítési hatékonyságát mutatja Nd: YAG impulzuslézer használatakor 60, 120 és 180 másodpercen. Az ötszörösen hígított MB-k megsemmisülési aránya 60 másodpercnél 72,46 százalék, 88,06 százalék, 120 másodpercnél 96,10 százalék, 180 másodpercnél 85,22 százalék és 98,80 százalék 98,80 százalék volt. A 4. ábra a tízszeres hígítású MB-k megsemmisítési hatékonyságát mutatja be egyszer, háromszor és hétszer a klinikai CO2 frakcionált impulzuslézerrel. A pusztulási sebesség a besugárzási idővel nőtt, hétszeres besugárzás esetén közel 100 százalék volt, így ezt a körülményt alkalmaztuk a következő in vitro és in vivo kísérletekben.

további információ: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501