A kurkumin enyhíti a kutya csontvelői mezenchimális őssejtek öregedését az in vitro expanzió során 2. rész

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtovábbi információért

2.5. Autofágia inovolok a Cur védő hatásának kifejtésében cBMSC öregedésben

A Cur-indukálta autofágia cBMSC öregedésére kifejtett hatásának feltárása érdekében az autofágia szintjét RAP (200 nM) vagy 3-MA (5 mM) alkalmazásával módosítottuk.3-A MA jelentős gátló hatást fejt ki. az autofág aktivitásra, ami a mikrotubulusokhoz kapcsolódó protein 1 könnyűlánc 3 (LC3), az autofágiával kapcsolatos gén (ATG)7, ATG12 és az unc51-szerű autofágiát aktiváló kináz{ mRNS expressziójának jelentős csökkenésében nyilvánul meg {14}}(ULK1); a csökkent microtubulus-asszociált protein 1 könnyű lánc 3 típusú Ⅱ/I (LC3-I/I) expressziós arány; és a p62 fokozott expressziója a kontrollcsoporthoz képest (5A, B ábra). Ennek megfelelően a Cur-csoporthoz képest az autofág aktivitás csökkenése volt megfigyelhető a 3-MA plusz Cur csoportban (5A, B ábra). Ezzel szemben az autofág aktivitás növekedését figyelték meg a RAP csoportban, amit az LC3, ATG12 és ATG7 fokozott mRNS expressziója bizonyít; az LC3-I fokozott átalakítása LC3-II-vé; és a p62 lebomlása (5A., B. ábra).

Először is szisztematikusan vizsgáltuk az autofág aktivitást. Az autofág vakuolák (más néven autofagoszómák) képződését morfológiai megfigyeléssel értékeltük, és az eredmények azt mutatták, hogy a Cur-csoportban és a RAP-csoportban több autofág vakuólum és LC3-pont volt a kontrollcsoporthoz képest, míg az autofág vakuolák száma csökkent, ill. kevesebb LC3 pont volt megfigyelhető az 3-MA és 3-MA plus Cur csoportokban (5C. ábra, E). Ezenkívül a LysoTracker festés azt jelezte, hogy a lizoszómális savasodást a RAP és a Cur fokozta a cBMSC-kben, és csökkent az 3-MA és 3-MA plusz Cur csoportok (5D. ábra). Az eredmények azt mutatják, hogy a Cur és a RAP hasonló pozitív hatást fejt ki az autofágia aktiválására, és hogy az autofágiás aktivitást elnyomja az 3-MA.cistanche pénisz mérete,A 3-MA autofágiára kifejtett gátló hatása azonban részben megmenthető Cur alkalmazásával.

További információért kattintson ide

Annak igazolására, hogy az autofágia részt vesz-e a CB MSc öregedésének szabályozásában, tovább vizsgáltuk az öregedéssel összefüggő fenotípusokat az autofágia farmakológiai kezeléssel történő elősegítése vagy elnyomása után. Az eredmények azt mutatták, hogy kevesebb SA- -gal-pozitív sejt volt jelen a Cur és RAP csoportokban, míg az SA- -gal-pozitív sejtek száma megnövekedett a {{5} }MA csoport összehasonlítva a kontrollcsoporttal. Figyelemre méltó, hogy az SA- -gal-pozitív sejtek száma szignifikánsan megnőtt az 3-MA plusz Cur csoportban a Cur csoporthoz képest (ábra). Az RT-qPCR elemzés eredményei azt mutatták, hogy a RAP és Cur kezelés növelte az SOX-2 és a Nanog expressziós szintjét, valamint csökkentette az IL-6, a TNF-a, a p21 és a p16 expressziós szintjét összehasonlítva. a kontrollcsoporttal. Az autofágia 3-MA általi gátlása azonban fokozta a p16, p21, TNF- és IL-6 expresszióját (6C-E. ábra). Továbbá a kontroll csoporthoz képest a cBMSC-k kolóniaképző hatékonysága nőtt a Cur és RAP csoportban, míg a CFU-F száma és mérete jelentősen csökkent az 3-MA csoportban. Ezenkívül kimutatták, hogy a Cur fokozott hatása a cBMSC-k kolóniaképző számára megszüntethető 3-MA-val végzett előkondicionálással (6B. ábra).cisztanche porEz a bizonyíték arra utal, hogy a RAP és a Cur javíthatja a cBMSC öregedését, míg a 3-MA súlyosbítja a cBMSC öregedését, és gyengíti a Cur által kifejtett jótékony hatásokat.

Összességében ezek az eredmények azt sugallják, hogy az autofágia 3-MA-val történő gátlása felgyorsítja a cBMSC-k öregedését, míg az autofágia Cur-vel és RAP-pal történő aktiválása enyhíti a cBMSC öregedését (6F ábra). Nevezetesen, a Cur által kifejtett védőhatások gyengültek az 3-MA-val végzett előkezeléssel (6F ábra), ami arra utal, hogy a Cur-indukált autofágia potenciális molekuláris mechanizmus a cBMSC öregedésének enyhítésére.

3. Vita

Az élőlények folyamatosan javítják a sérült szöveteket és késleltetik az öregedéssel kapcsolatos folyamatokat az MSC-k sajátos funkcionális jellemzői miatt, amelyek kiterjedten megtalálhatók a különböző szövetekben és szervekben [15]. Sajnos az életkor és a betegség kulcsfontosságú tényező az MSC öregedésében in vivo, és a sejtkörnyezet belső és külső különbségei felgyorsítják az MSC öregedését in vitro tenyésztésében, mindkettő negatívan befolyásolja az immunszuppresszió, a differenciálódás és a migráció képességét, végső soron csökkentve az én hatékonyságát. -javítás és transzplantáció MSC-ben [7,14,49-51].cistanche salsa kivonatOja és munkatársai jelezték, hogy a humán BMSC-k proliferációja megszűnt a klinikai minőségű tenyészetek ötödik-kilencedik passzálásakor, és tipikus öregedési fenotípusokat mutattak, például hipertrófiás és lapos morfológiát, a p16 és p21 sejtciklus-kináz-inhibitorok aktiválódását, csökkent proliferációs rátát. és az SA- -gal [52] fokozott aktivitása. Nyilvánvaló, hogy az in vitro expanzió elkerülhetetlenül az öregedés idő előtti megjelenését idézi elő az MSC-kben, amelyeket az in vitro sejtöregedés-kutatás fontos modellrendszerének tartanak [42, A4, A5]. Jelen tanulmányunk azt találta, hogy a cBMSC-k a 3. passzázs előtt egységes morfológiát mutattak, de megfigyelték, hogy a 6. passzázst követően számos változáson mentek keresztül a sejtmorfológia, fiziológia és a génexpresszió tekintetében (2. és 7. ábra), ami összhangban van a korai öregedéssel. .

A Cistanche öregedésgátló hatású

Egyre több bizonyíték utal arra, hogy a farmakológiai stimuláció ígéretes megközelítés az MSC-k öregedéstől való megmentésére [53,54]. Ezt szem előtt tartva számos természetes és szintetikus vegyületet alaposan megvizsgáltak annak érdekében, hogy meghatározzák gyulladáscsökkentő, antioxidáns és öregedésgátló potenciáljukat in vivo és in vitro [15,55]. Természetben előforduló fenolos vegyületként a Cur nagy figyelmet keltett az MSC biológiájára gyakorolt ​​jótékony hatásai miatt [36,37,56,57]. A Cur expozíciónak az MSC-kre gyakorolt ​​összetett hatásait azonban alaposan mérlegelni kell a különböző orvosbiológiai kutatások végrehajtása előtt. Yang és munkatársai arról számoltak be, hogy a Cur magas koncentrációja (50 és 100 uM) in vitro akut toxikus hatásokat válthat ki humán BMSC-ben, míg a 10 uM Cur folyamatos expozíciója (7 nap) gátolja a humán BMSC proliferációt és sejtapoptózist indukál [58]. Érdekes módon egy másik tanulmány kimutatta, hogy a Cur<20 um)for="" 5="" days="" ameliorates="" h,="" o,-induced="" oxidative="" stress="" in="" human="" adscs[56].="" additionally,="" cur="" preconditioning="" （1="" μm="" and5um）="" for="" 24="" or="" 48h="" can="" help="" to="" maintain="" cellular="" viability="" and="" improve="" the="" lifespan="" of="" rat="" adscs[36,57.="" our="" results="" demonstrated="" that="" cur(1="" um="" and="" 10="" μm）="" was="" able="" to="" maintain="" the="" viability="" of="" cbmscs="" and="" alleviate="" cbmsc="" senescence="" after="" exposure="" for="" 24="" h,="" while="" the="" colony-forming="" efficiency="" of="" cbmscs="" was="" significantly="" decreased="" at="" a="" dose="" of="" 10="" μm（figure="" 3）.="" therefore,="" the="" beneficial="" effects="" of="" cur="" （10="" umd="" may="" be="" attributed="" to="" short-term="" stimulation,="" and="" it="" can="" impair="" the="" proliferation="" potential="" of="" cbmscs="" in="" the="" long="">

A közelmúltban a Cur biológiai aktivitásairól széles körben beszámoltak különféle in vitro vagy in vivo modelleken, különösen az MSC-k biológiai jellemzőinek modulálásával kapcsolatban. A Cur öregedésgátló hatását gyakran vitatták meg, és azt találták, hogy a Cur jótékony hatással van az öregedésre és az öregedéssel összefüggő betegségekre szervezeti és sejtszinten. A szabályozás alapjául szolgáló mechanizmus azonban bonyolult a Cur különböző dózisai és formái, valamint az öregedés mechanizmusa miatt [19]. A molekulák lebomlásának és az organellák forgalmának egyik fő intracelluláris mechanizmusaként az autofágia fontos szerepet játszik az MSC-k stresszhelyzetekkel szembeni védelmében és a celluláris homeosztázis fenntartásában. Az autofágia modulációja az MSC-funkciók javításának újszerű stratégiája [59]. Jelentős vizsgálatokból gyűjtött adatok szerint az autofágia Cur általi elősegítése vagy elnyomása különböző sejtmodellekben kielégítő citoprotektív hatást fejt ki [38-40].cistanche szárAdataink azt mutatták, hogy megnövekedett autofág aktivitást figyeltek meg Cur expozíciót követően, amit az autofágiával kapcsolatos gének (LC3, ULK1, Atg7 és Atg12) felszabályozása, az LC3-II képződése, a gének számának növekedése azonosít. autofág vakuolák és savas hólyagos organellumok, valamint a p62 fehérjeszint jelentős csökkenése (4. ábra). Ezenkívül a lizoszómát az autofágia nélkülözhetetlen organellumának tekintik, míg a lizoszómális pH szabályozási zavarát és a vakuoláris H plusz -ATPáz (v-ATPáz) aktivitás megváltozását figyelték meg az MSC öregedési folyamatában, így elősegítve a lizoszómális savasodást és az autofágiát, és hozzájárul az MSC öregedésének késleltetésére [60]. Yan és munkatársai jelezték, hogy a Cur aktiválhatja az egérembrionális fibroblasztok (MEF) lizoszóma funkcióját, és autofágiát indukálhat, ami kulcsfontosságú túlélési jelként szolgál [38]. Hasonlóképpen megfigyeltük, hogy a Cur-kezelés fokozza a lizoszómális savasodást a cBMSC-ben (4. ábra), ami arra utal, hogy a Cur részt vehet a lizoszómafunkció aktiválásában, ami nélkülözhetetlen az autofág aktivitás fokozásához.

Az autofágia túlnyomórészt citoprotektív mechanizmus, és egyre több bizonyíték utal arra, hogy a természetes és szintetikus vegyületek öregedésgátló tulajdonságai korrelálnak az autofágia modulációval [29,54,61,62]. Az autofágia moduláció MSC öregedésére és a megfelelő mechanizmusokra gyakorolt ​​hatásait azonban még nem értékelték és tárták fel teljesen. A kezdeti jelentések azt mutatták, hogy az autofágia túlnyomórészt citoprotektív mechanizmus, és az autofágia megnövekedett szintje késleltetheti a sejtek öregedését azáltal, hogy csökkenti a toxikus metabolitok felhalmozódását és helyreállítja az organellumok működését [63]. Érdekes módon a közelmúltban végzett vizsgálatok azt is kimutatták, hogy megnövekedett számú autofágiás vakuólum és autofágiával kapcsolatos fehérje (LC3-}II, ATG7 és ATG12) figyelhető meg az MSC öregedése során, míg az autofágia gátlása bafilomicin A1 és {{11 }}Az MA-ról kimutatták, hogy csökkenti az SA- -gal-pozitív sejtek százalékos arányát, valamint a p16 és p21 expresszióját [35]. A Cur-indukált autofágia és a cBMSC öregedésére gyakorolt ​​hatása közötti kapcsolat további tisztázása érdekében az autofágiát rapamicinnel vagy 3-MA-val végzett előkezeléssel moduláltuk. Nyilvánvalóan az autofágiás aktivitást gyengítette az 3-MA, míg a RAP és a Cur (1 uM) szignifikánsan fokozza az autofágiát (5. ábra). A korábbi jelentésekkel [5] összhangban eredményeink azt is mutatják, hogy az autofágia 3-MA általi gátlása felgyorsította a sejtek öregedését cBMSC-ben. Az autofágia aktiválására csaknem következetes hatást fejtett ki a Cur(1uMand RAP, míg analóg citoprotektív hatást Ennek megfelelően, amikor az autofágiát az 3-MA gátolta, a Cur által kifejtett védőhatások csökkentek (ábra), ami arra utal, hogy a Cur-indukált autofágia potenciális molekuláris mechanizmus a cBMSC öregedésének javítására (7. ábra).

Fiziológiás körülmények között az autofágia alapszinten fordul elő minden eukarióta sejtben a sejthomeosztázis fenntartása érdekében. Különböző stresszhelyzetek azonban rendellenes autofágiához vezethetnek, ami befolyással van a sejtek sorsára, hacsak nem áll helyre az autofágia optimális szintre [41,44,64]. Bizonyítékaink megerősítették, hogy a Cur-indukált autofágia jótékony hatással van a cBMSC öregedésének szabályozására. Ebben a forgatókönyvben a különféle stressz-termelő ingereket és extracelluláris beállításokat alaposan meg kell fontolni a Cur-kezelés előtt, és érdekes lenne megvizsgálni, hogy a Cur-indukált autofágia szelektíven javíthatja-e az MSC-k működését egy előre meghatározott dózisban és időtartamban. Ezenkívül egy nanotechnológián alapuló kurkumin szállító rendszer jobb vizes fázisban való oldhatóságot és biológiai hozzáférhetőségi szintet mutatott [65,66]; ígéretes eszköz lehet az MSC öregedésének késleltetésére és ellensúlyozására. A válasz arra a kérdésre, hogy vajon az autofágia az elsődleges mögöttes mechanizmus az MSC öregedésének késleltetésében, még további részleteket igényel, amelyeket a jövőbeli kutatások szolgáltatnak.

4. Anyagok és módszerek

4.1.Állatok

A csontvelő-mintákat 6 egészséges felnőtt nőstény kínai vidéki kutyától vettük (12-hónaposak). Az összes vizsgálatot a Szecsuáni Mezőgazdasági Egyetem Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága (jóváhagyási szám:{3}}) hagyta jóvá, és a Kínai Népköztársaság állatvédelmi törvényeinek etikai normái szerint végezték el.

4.2. Kurkumin oldat elkészítése

Cur (HPLC nagyobb vagy egyenlő, mint 98 százalék, CAS-szám:458-37-7; Solar Science& Technology Co., Ltd., Peking, Kína) DMSO-ban oldottuk fel 20 mmol/ törzskoncentrációig. L. 0,22 μm-es szerves mikroporózus szűrőmembránon átszűrjük és -80 fokon tároljuk. Különböző Cur oldatokat állítottunk elő táptalajban in vitro vizsgálatokhoz.

4.3. Sejttenyésztés és expanzió

A cBMSC-ket csontvelőből nyertük. A sejteket alacsony glükóztartalmú Dulbecco's Modified Eagle táptalajból (LG-DMEM, Gibco Grand Island, NY, USA), 10 százalék magzati borjúszérumból (FBS, TransGen Biotech Co., Ltd., Peking, Kína) álló komplett táptalajban tenyésztettük. ), és 1 százalék penicillin/sztreptomicin. 80-90 százalékos összefolyásnál a megtapadt sejtek tripszin emésztőoldattal (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Kína) szabadultak fel, és 1:2-1:3 arányban tovább bővültek [67 ].

4.4. Sejtnövekedés Curie

A cBMSC-k proliferációs képességének meghatározásához a (P)3, 6 és 9 passzázsokban a sejteket három 48-lyukú lemezre oltottuk (2500 sejt/lyuk). 48 órás inkubáció után a sejteket felszabadítottuk Trypsin Digestion Solution oldattal, és hemocitométerrel megszámoltuk. A sejtszámlálási eljárást 48 óránként megismételtük, és 14 napig tartottuk.

4.5. A cBMSC-k immunfenotípusának kimutatása áramlási citometriával

A 3. passzázsban a cBMSC-ket PBS-sel mostuk és tripszineztük. A sejteket (3×105 sejt/ml) újra szuszpendáltuk a festőpufferben, és a sejtszuszpenziókat (100 µl) FITC, PE vagy APC fluoreszcensen jelölt monoklonális antitestekkel inkubáltuk a CD45, CD34 és felületi antigének ellen. ITGB1 (eBioscience, San Diego, CA, USA) és nem fluoreszcens jelölésű CD31, CD90 és CD105 (Biosynthesis Biotechnology Co.Ltd. Peking, Kína) 15 percig 4 fokon. A sejteket PBS-sel mostuk, és FITC-konjugált kecske anti-nyúl IgG-vel inkubáltuk 15 percig 4 °C-on. A felületi antigéneket áramlási citometriával detektáltuk (FACS Calibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Az adatok elemzése a CytExpert szoftverrel történt.

4.6. In vitro differenciálódási vizsgálat

A cBMSC-ket 5×104 sejt/ml sűrűséggel 6-lyukú lemezekre szélesztettük. 70-80 százalékos összefolyásnál a teljes tápközeget oszteogén vagy adipogén differenciálódást kiváltó táptalajra cserélték, és 3 naponta cserélték (Cvagen, Suzhou, Kína). A kalciumlerakódást Alizarin Red S festéssel (Solarbio, Peking, Kína) mutatták ki 3 hetes osteogén indukció után, és lipidcseppek felhalmozódását figyelték meg Oil Red O festéssel (Solarbio, Peking, Kína) 2 hetes adipogén indukció után.

4.7. A Cur hatása a sejtek életképességére

A cBMSC-k sejtes életképességét a CCK{0}}készlet (Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, Kína) segítségével határoztuk meg.cistanche tubulosa előnyei és mellékhatásaiA cBMSC-ket előtenyésztettük egy 96-lyukú lemezen 24 órán keresztül. A cBMSC-ket Cur-dal kezeltük különböző koncentrációkban (0.1, 0.5, 1, 5 és 1{). {14}} umol/L) 12, 24, 48 és 72 órán keresztül. A sejteket 0,1 százalékos DMSO-val kezeltük, amelyet kontrollként használtunk. Miután lyukanként 10 μl CCK-8-oldattal 2 órán át inkubáltuk, az optikai sűrűséget mikrolemez-leolvasóval mértük 450 nm-en (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). A relatív sejtéletképességet a gyártó utasításai szerint számítottuk ki.

4.8. Kolóniaképződési vizsgálat

A cBMSC-k önmegújulási hatékonyságát kolóniaképző egység-fibroblaszt (CFU-F) assay segítségével mutatták ki. A cBMSC-ket (3×10² sejt/lyuk) 6-lyukú lemezekre oltottuk. Kéthetes tenyésztés után a sejteket 4 százalékos paraformaldehiddel fixáltuk 30 percig, és fordított mikroszkóp alatt (LX73, Olympus Corporation, Tokió, Japán) figyeltük meg, miután 10 percig festették 1 százalékos kristályibolyával. A CFU-F esetében több mint 50 sejtet számoltunk meg. A CFU-F hatékonyságát a következőképpen számítottuk ki:

CFU-F hatékonyság=CFU-F száma/magszám (300 sejt)[68].

4.9. Béta-galaktozidáz festési vizsgálat

Az öregedéssel összefüggő -galaktozidáz (SA- -gal) aktivitását cBMSC-ben az SA- -gal festőkészlettel (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Sanghaj, Kína) becsülték meg a gyártó utasításai szerint. . A festés után a sejteket fordított mikroszkóp alatt vizsgáltuk. A pozitívan festődött sejteket megszámláltuk, hogy értékeljük a sejtek öregedését.

4.10. Reverz transzkripciós valós idejű kvantitatív PCR (RT-qPCR)

A teljes RNS-t Trizol reagens módszerrel extraháltuk a sejtpelletekből. A cDNS-t PrimeScriptTM RT reagenskészlettel és gDNA Eraser-rel (Takara, Shiga, Japán) szintetizáltuk. A PCR primereket (2. táblázat) a GAPDH mellett korábbi tanulmányokra hivatkozva [67] a Primer Express szoftverrel (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) terveztük cDNS-szekvenciák alapján. A qPCR-t TB Green PCR Mix (Takara, Shiga, Japán) segítségével hajtottuk végre a CFX96 Touch Real-time PCR Detection System rendszeren (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). A reakciókörülmények a következők voltak: 95 fok 30 másodpercig, majd 39 ciklus 95 fokos 5 másodpercig és 60 fokos ciklus 30 másodpercig. Az olvadásgörbe analízisét 95 foktól kezdve 10 másodpercig végeztük, majd 65 és 95 fok között, ciklusonként 0,5 fokkal növelve. A GAPDH-t belső kontrollként használtuk az összes adat normalizálására, és a relatív expressziót az összehasonlító ciklusküszöb (Ct) módszerrel számítottuk ki.

4.11. A Lusosomal UIsing LysoTracker nyomon követése

A Lyso-Tracker Redet (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Kína) használták a lizoszómák nyomon követésére, amelyek megnövekedett fluoreszcencia intenzitást mutathatnak a lizoszómális savasodás hatására. A cBMSC-ket 12-lyukú lemezekre oltottuk és Cur-vel kezeltük 24 órán át, majd a sejteket Lyso-Trackerrel (60 nM) és Hoechst 33,342-vel (2 ug/ml) kezeltük 20 percig. A fluoreszcenciát fordított fluoreszcens mikroszkóppal figyeltük meg PBS-sel történő mosás után.

4.12. Immunfluoreszcencia

A cBMSC-ket (2×104 sejt/lemez) tárgylemezekre oltottuk, és 30 percig 4 százalékos paraformaldehiddel rögzítettük. 0,5% Triton X-100 5 perces koinkubálása után (Solarbio, Peking, Kína), a metszeteket 30 percre a blokkolóoldatba merítettük. A zárt folyadékot eltávolítottuk, és a sejteket anti-LC3B antitestekkel (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA) inkubáltuk egy éjszakán át 4 fokon, majd fluorokrómmal konjugált másodlagos antitestekkel (Abcam, Cambridge, MA, USA) inkubáltuk. Végül a sejteket DAPI-val (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Kína) ellenfestettük, és konfokális mikroszkóp alatt monitoroztuk.

4.13. Western-blot-elemzés

A sejtmintákat jéghideg PBS-sel történő mosás után proteáz inhibitort tartalmazó szövet- és sejtlizátummal (Solarbio, Peking, Kína) lizáltuk. A mintánként 15 ug fehérjét tartalmazó sejtlizátumokat nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid (SDS-PA) (Solarbio, Peking, Kína) gélekbe töltöttük, és elektroforézissel elválasztottuk. Miután a fehérjéket a polivinilidén-fluorid (PVDF) membránra vittük, az utóbbit nem specifikusan blokkoltuk 5 százalékos zsírmentes száraz tejjel (Solarbio, Peking, Kína) 1 órán át szobahőmérsékleten. A membránokat egy éjszakán át inkubáltuk az anti-LC3B (1:2000, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-p62/SQSTM1 (1:4000, Novus Biologicals, Littleton, NH, USA) elsődleges antitestekkel. ) és anti- -aktint (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA) 4 fokon, és a blotokat TBST-vel (Solarbio, Peking, Kína) mostuk, mielőtt másodlagos antitesttel inkubáltuk őket (1 :2000, Abcam, Cambridge, MA, USA) 37 fokon 1 órán át. Ezt követően a membránokat kemilumineszcenciás reagensekkel (Millipore, Billerica, MA, USA) hozták létre, és a ChemiDocTM Imaging Systems (Tanon{24}}, Shanghai, Kína) segítségével vizualizálták. A sávsűrűséget az Image-Pro Plus 6.0 szoftverrel (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA) számszerűsítettük minden csoportnál, és -aktinnal normalizáltuk.

4.14. Transzmissziós elektronmikroszkópia (TEM)

A sejtpelletet emésztettük és egy 1,5 ml-es centrifugacsőbe gyűjtöttük, majd 2,5 százalékos glutáraldehiddel (Solarbio, Peking, Kína) 2 órán át szobahőmérsékleten rögzítettük. A mintákat PBS-es mosás után 1 órán át utófixáltuk 1 százalékos ozmium-tetroxiddal, majd fokozatosan növeltük a dehidratációt acetonos oldatokban, és 812 epoxigyantába ágyaztuk (Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd., Peking, Kína). Ezt követően 50 nm-es metszeteket vettünk az ultra-mikrotomból (EM UC7, Leica Microsystems Co., Ltd., Heidelberg, Németország). A metszeteket uranil-acetáttal (Zhongjingkevi, Peking, Kína) 10-15 percig és ólom-citráttal (Zhongjingkei, Peking, Kína) 2 percig festettük. Az összes példányt TEM-en nézték meg (EM-1400PLUS, JEOL, Akishima, Tokió, Japán).

4.15. Statisztikai analízis

Az eredményeket három független kísérletből kaptuk, és minden adatot átlag ± standard deviáció (SD) formájában mutattunk be. A statisztikai értékeket az IBM SPSs Statistics 25 segítségével elemeztük, és a GraphPad Prism 9 segítségével illusztráltuk.{2}}(GraphPad Software, San Diego, CA, USA). A statisztikailag szignifikáns különbségeket az egytényezős varianciaanalízis (ANOVA) és a Student-féle t-próba segítségével határoztuk meg. p értékeket<0.05 were="" considered="" to="" be="" significant="">

5. Következtetések

Eredményeink rávilágítanak a Cur, a cBMSC öregedés és az autofágia kapcsolatára. Tanulmányunk adatai azt sugallják, hogy a Cur enyhítheti a cBMSC-k öregedési állapotát, miközben aktiválja az autofágiát és elősegíti a lizoszómális savasodást. Ezenkívül további bizonyítékok igazolták, hogy a Cur-indukált autofágia potenciális mechanizmus a cBMSC öregedésének javítására. A Cur ígéretes aktivátor és konzervátor lehet az MSC-k működésének javítására. Véleményünk szerint nem elhanyagolható a Cur öregedésre gyakorolt ​​pozitív hatása. A jövőbeni tanulmányoknak a Cur szabályozásának az MSC sorsára gyakorolt ​​​​hatására kell összpontosítaniuk, hogy fokozzák az MSC-k terápiás potenciálját különböző betegségekben, például szövetkárosodásban, valamint degeneratív és gyulladásos betegségekben.

Ez a cikk az Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 11356. https://doi.org/10.3390/ijms222111356 https://www.mdpi.com/journal/ijms