Új fenilpropanoiddal helyettesített diglikozidok dereplikáció által vezérelt izolálása a Cistanche Salsából és a makrofágok NO-termelését gátló hatásuk

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtöbbért

Absztrakt:

A dereplikáció lehetővé teszi az ismert és ismeretlen vegyületek gyors azonosítását a növényi kivonatokban. Ebben a tanulmányban folyadékkromatográfiás-tömegspektroszkópiás (LC-MS) alapú dereplikációt végeztünk az ESI plusz QTOF-MS adatainak felhasználásával afenilpropanoiddal szubsztituált glikozidok, a Cistanche salsa (CA Mey.) fő aktív összetevői Beck. A TOF-MS önmagában történő alkalmazásával ezeknek a vegyületeknek az alstruktúrái egyértelműen megerősíthetők a különböző termelések jellegzetes fragmentációs mintái alapján. A C. salsa HPLC-MS alapú profilozása újak kimutatását is lehetővé tettefenilpropanoid-helyettesítettszármazó glikozidokezt a növényt. Közülük öt új fenilpropanoid-szubsztituáltdiglikozidokAz A–E (5, 6, 12, 17 és 18) cisztansalsidokat izolálták. Szerkezetüket spektroszkópiai módszerekkel, köztük NMR és MS analízissel tisztázták. Az összes izolátumot megvizsgáltuk az NO-termelés elleni gátló aktivitásra LPS-sel stimulált RAW 264.7 sejtekben. A vizsgált vegyületek közül az 5., 11., 13. és 18. vegyület mérsékelt gátló hatást mutatott az indukálható NO-szintázra. A 11., 13. és 18. számú vegyületek szintén gátolták az NF-κB foszforilációját makrofágokban. Egyik vegyület sem mutatott szignifikáns értéketcitotoxicitás. 

Kulcsszavak:dereplikáció; fenilpropanoiddal szubsztituált diglikozidok; Cistanche salsa; gyulladáscsökkentő

További információért kattintson ide

Bevezetés

A Cistanche salsa (CA Mey.) Az Orobanchaceae családjába tartozó Beck egy parazita növény, amely táplálékát a Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae) és más sivatagi növények gyökeréből nyeri [1]. Ezt a növényt a hagyományos gyógyászatban neuraszténia, szexuális diszfunkció és veseelégtelenség kezelésére használták [2,3]. Korábbi fitokémiai vizsgálatokban beszámoltak arról, hogy a C. salsa egész növénye különféle típusú vegyületeket tartalmazott, beleértve a fenil-etanoid-glikozidokat és az iridoid-glikozidokat [4–7]. A feniletanoid-glikozidok, mint például az akteozid és az echinakozid, a növény fő aktív összetevői [8]. A C. salsa kivonatai előnyös tulajdonságokat mutattak, beleértve az immunmoduláló, rákellenes és gyulladásgátló hatásokat [9,10]. A dereplikáció egy olyan folyamat, amelynek során a minta keverékeit tesztelik, hogy megkülönböztessék az ismeretlen összetevőket az ismert vegyületektől. A dereplikációs stratégiák analitikai technikákon és adatbázis-keresésen alapulnak a másodlagos metabolitok azonosítására a fitokémiai kutatási folyamat korai szakaszában [11]. Az analitikai technikák közül az ESI-QTOF-MS (elektrospray ionization-quadrupol-time of flight-mass spectroscopy) értékes információkat szolgáltathat a másodlagos metabolitok kémiai szerkezetéről. Az LC-MS-alapú dereplikáció-vezérelt frakcionálásról kimutatták, hogy nagy hatékonysággal teszi lehetővé a cél metabolitok nyers növényi kivonatokból történő extrakcióját és tisztítását [12–15]. Ez a vizsgálat az LC-MS-alapú dereplikációt végezte el az ESI plusz TOF-MS adatainak felhasználásával a fenilpropanoiddal szubsztituált diglikozidok, a C. salsa fő aktív összetevőinek elemzéséhez. A TOF-MS adatok a különböző termékionok jellegzetes fragmentációs mintázatai alapján sugallhatják e vegyületek alstruktúráit. E dereplikáció alapján elemeztük az etil-acetát (EtOAc) frakció és a vízoldható frakció LC-MS profilját. Az EtOAc frakciót dereplikációs stratégiának vetettük alá a további elválasztás érdekében, melynek eredményeként öt új fenilpropanoiddal szubsztituált diglikozidot és 13 ismert vegyületet izoláltunk (1. ábra). Megerősítették, hogy a fenilpropanoid-szubsztituált diglikozidok feltételesen megjósolt szerkezetei helyesen illeszkedtek valós szerkezetükhöz. Emellett az izolátumok gyulladásgátló hatását is feltárták.

Eredmények és megbeszélés

A C. salsa-ból izolált fenilpropanoid-szubsztituált diglikozidok általában diszacharid-glikozidokon alapuló szerkezetűek, amelyek egy glükózból és egy Rha (1→3) Glc-kötésű ramnózból és egy cinnamoil-szubsztituensből állnak, például kumársav (Cou), kávé sav (Caf) és feruloilsav (Fer), a glükóz C-4 vagy C-6 pozíciójában. Az aglikon általában a glükóz C-1 pozíciójához kötődik. A glükóz C-2-án acetilcsoportot tartalmazó fenilpropanoiddal szubsztituált diglikozidok szerkezetéről gyakran számoltak be [6,12,16]. A dereplikáció végrehajtásához ezen vegyületek MS fragmentációs mintázatait pozitív módú ESI-QTOF-MS módszerrel elemeztük. Az MS-spektrumokban az összes fenil-propanoiddal szubsztituált diglikozid adduktion csúcsokat hozott létre [M plusz NH4] plusz, [M plusz K] plus és [M plus Na] plus értékeknél, amelyek megadták a molekulatömeget és a képletet. A fragmensionok mintázata az aglikon és glikozid maradékok egymás utáni veszteségeivel ([M plusz H − Aglikon] plus , [M plus H − Aglikon − Rha] plus és [M plus H − Aglikon – 1. ábra. Vegyületek szerkezete) határozható meg. 1-18. mint például a kumársav (Cou), a kávésav (Caf) és a feruloilsav (Fer), a glükóz C-4 vagy C-6 pozíciójában. Az aglikon általában a C{{24 A glükóz C-2 helyén acetilcsoportot tartalmazó fenilpropanoiddal szubsztituált diglikozidok szerkezetét gyakran leírták [6, 12, 16]. Az MS spektrumokban az összes fenilpropanoiddal szubsztituált digliko oldalak addukt ioncsúcsokat produkáltak [M plusz NH4] plus , [M plus K] plus és [M plus Na] plus értékeknél, amelyek megadták a molekulatömeget és a képletet. A fragmensionok mintázata az aglikon és glikozid maradékok ([M plusz H - Aglikon] plusz , [M plusz H - Aglikon - Rha] plus és [M plus H - Aglikon - Rha - Glc (vagy acetil) sorozatos veszteségei alapján állapítható meg -Glc)] plus ), amelyek hasznosak voltak a cinnamoil szubsztituens és a cukrok típusának előrejelzésére. A koffeoilcsoport m/z 163, a kumaroilcsoport m/z 147 vagy a feruloilcsoport m/z 177 fragmens ionjai a fenilpropanoiddal szubsztituált diglikozidok fahéjszubsztituensének jellegzetes jelét adják [4,15] ( 2. ábra). A fragmensionok elemzése hasznos információkkal szolgálhat a fenilpropanoiddal szubsztituált diglikozidok szerkezetének azonosításához. Izomerjeik azonban nem tudták megkülönböztetni önmagában MS spektrometriával. A teljes szerkezetük pontos azonosításához NMR-spektrum szükséges.

Az összes izolátumot megvizsgáltuk az LPS-indukált NO termelésre gyakorolt ​​gátló hatásuk szempontjából RAW 264.7 sejtekben. Pozitív kontrollként dexametazont használtunk, és IC50 értéke 7.0 µM volt. A vizsgált vegyületek közül az 5. (IC50 42,7 ± 6,6 µM), a 11. (IC50 37.3 ± 2,2 µM), a 13. (IC50 40) vegyület.{{2{{ 24}}}} ± 4.0 µM) és 18 (IC50 27,9 ± 0,8 µM) mérsékelt gátló hatást mutatott az indukálható NO-szintázra, míg a többi vegyület inaktív volt ebben a vizsgálatban (IC50). értékek > 100 µM). Annak ellenőrzésére, hogy ezeknek a vegyületeknek van-e citotoxicitásuk, a sejtek életképességét MTT vizsgálattal mértük. Ennek eredményeként egyikük sem mutatott jelentős citotoxicitást (S6-1 kiegészítő ábra). Ezt a négy vegyületet azért választottuk ki, hogy értékeljük az NF-κB útvonal elleni gátló hatásukat LPS-stimulált RAW 264.7 sejtekben. A RAW 264.7 sejtek LPS-sel történő stimulálása 0,5 órás inkubáció után az IκB és NF-κB (p65) foszforilációját váltotta ki. Az NF-κB (p65) foszforilációja szignifikánsan csökkent a 11., 13. és 18. vegyülettel végzett előkezelés hatására, amint azt a Western blot analízis mutatja (5. ábra). Ezért a 11, 13 és 18 vegyületek gyulladásgátló hatást fejthetnek ki az NF-κB makrofágokban történő gátlásán keresztül.

Anyagok és metódusok

Az optikai forgatásokat Jasco P{0}} digitális polariméterrel mértük (Jasco, Tokió, Japán). Az UV-spektrumokat Chirascan plus Circular Dichroism spektrométeren (Chirascan, APL, UK) vettük fel. Az IR-spektrumokat Jasco FT/IR-4200 spektrofotométerrel vettük fel. A nagy felbontású elektrospray ionizációs kvadrupólus repülési idő tömegspektrometriát (HR-ESI-qTOF-MS) egy Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS készüléken végezték, amely Agilent 1260 Infinity sorozattal (Agilent Technologies, Inc.) volt felszerelve. , Palo Alto, CA, USA), és az alkalmazott oszlop egy Jasco SFCpak Crest C18T-5 oszlop volt (id 150 × 4,6 mm, 5 um). Az adatgyűjtéshez MassHunter Workstation szoftvert használtunk.

Az 1D (H és 13C) és a 2D ('H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) NMR-spektrumokat egy Jeol LA 300 (Jeol, Tokió, Japán), Bruker AVANCE-400, Bruker AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 és Bruker AVANCE 800 HD spektrométerek krio-szondával (Bruker, Ettlingen, Németország). NMR-oldószerként és referenciacsúcsként (6H 2,50 és δc 39,5) DMSO-d6-ot (Cambridge Isotope Laboratories, Inc. Andover, MA, USA) használtunk. Az oszlopkromatográfiát (CC) Sephadex LH-20(25-100 um; Pharmacia, Uppsala, Svédország) vagy Kieselgel 60 szilikagél (40-63 um,230-400 mesh, Art. 9385; Merck, Darmstadt, Németország). A vékonyréteg-kromatográfiát (TLC) előre bevont Kieselgel 60 szilikagél F254 lemezeken (Art.5715; Merck) végeztük. A vékonyréteg-kromatográfiás foltokat UV-lámpával detektáltuk 254 nm-en és 365 nm-en (VL-4.LC, 365). /254;Vilber Lourmat, Torcy, Franciaország). A közepes nyomású folyadékkromatográfiát (MPLC) RediSep 120 g szilika flash oszlopon (lsco, Lincoln, NE, USA) és Kiesegel 60 szilikagélen (40-63 um, 230-400 mesh, Art.9385; Merck) végeztük. )egy Combiflash kísérő (Isco) használatával. A nagynyomású folyadékkromatográfiás (HPLC) rendszer egy Gilson HPLC volt, Gilson 321 pumpával és UV.VIS 151 detektorral (Gilson, Middleton, WI, USA), félpreparatív ODS oszlopokkal (Luna 5 um C18 (2) 100 Å, id 250×10 mm, 5 μm, Phenomenex Inc, Torrance, CA, USA; Hypersil GOLDrM aQ 175A,id250×10mm,5 um, Thermo ScientificTM, Hennigsdorf, Németország;Inno C18column 120 A, id250×10 mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, Korea).The RP-analy A HPLC rendszer egy Waters 2695 szövetségi rendszer volt 996 Photodiode Array (PDA) detektorral (Waters Corp, Milford, MA, USA), az alkalmazott oszlop pedig egy HypersilTM BDS C18 oszlop volt (130 A, id150 × 4,6 mm, 5 μm, Thermo). TudományosTM). A hangyasavat a Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd.-től (Szöul, Korea) vásároltuk. A HPLC minőségű oldószereket a Fisher Scientific Korea Ltd.-től (Szöul, Korea) vásároltuk. A HSOA-t, Na,CO-t és az extrakcióhoz, frakcionáláshoz és izoláláshoz használt első osztályú oldószereket a Daejung Chemical & Metals Co. Ltd.-től (Szöul, Korea) vásároltuk. Az L- és D-cisztein-metil-észter-hidrokloridot és az o-tolilizotiokvanátot a Tokyo Chemical Industry-tól (Tokió, Japán) vásároltuk.

Következtetések

Ebben a vizsgálatban öt új fenilpropanoid-szubsztituált diglikozid szerkezetét izoláltuk és tisztáztuk, a cisztansalsid AE(5,6, 12, 17 és 18) néven, továbbá 13 ismert vegyületet izoláltunk és azonosítottunk, dereplikációs stratégia alkalmazásával. Az ismert vegyületek a következők: lipedozid AI(1)[21], 2'-acetil-lakteozid (2)[22], izocisztanozid C(3)[15], ozmantusid B (4)[21], epimeridinozid A(7). [15], cisztanozid D(8)[23], salzazid B(9) [6l, tubulozid E (10)[16] cisztanozid M(11)[15], izomartynozid(13) [24], salzazid C(14) )[6], jionozid C(15)[25] és salsazid F (16)[6]. Szerkezetüket kiterjedt spektroszkópiai adatok elemzésével és az irodalomban közölt adatokkal való összehasonlítással állapították meg. Megerősítették, hogy a fenilpropanoid-szubsztituált diglikozidok feltételesen megjósolt szerkezetei helyesen illeszkedtek valós szerkezetükhöz.

Az NO-gátló vizsgálatban az 5. vegyületek （IC50 42,7±6,6 μM）, 11（IC50 37.3±2,2 μM）,13 （IC50 40.0 ±4.{14}} μM） és 18（ICs0 27.9±0.8 uM mérsékelt gátló hatást mutatott. Ezen vegyületek közül a 11., 13. és 18. számú vegyületekről azt találtuk, hogy gátolják az NF-kB foszforilációját a makrofágokban, és így gyulladásgátló hatást fejthetnek ki, amelyet további kísérletekben kell igazolni.

Kivonat innen: https://creativecommons.org/licenses/by/4.{1}}/ (a "Licenc"). A ProQuest Általános Szerződési Feltételei ellenére ezt a tartalmat a Licenc feltételeinek megfelelően használhatja.