Az echinakozid meghatározása Cistanche Herba vizes kivonatában HPLC-vel

XU Shanshan1 ,WU Kangyu2 ,TU Xingming2 （1. Guangzhou Kínai Orvostudományi Egyetem Harmadik Klinikai Orvosi Főiskolája, Guangzhou 510405 Guangdong, Kína; 2. A Guangzhou Kínai Orvostudományi Egyetem Harmadik Társult Kórháza,Guangzhou 510378 Guangdong,Kína） 

Absztrakt: Célkitűzés Meghatározására HPLC módszert hoztak létreEchinakozidC vizes kivonatábanistanche deserticola. MódAz echinakozidot HPLC-vel határoztuk meg. Az elválasztást Inertsil ODSSP C-vel végeztük18 A mozgófázisú oszlop acetonitrilt tartalmazott（A）és 0,4 százalékos foszforsav oldat（B）,gradiens elúcióval. A detektálási hullámhosszt 333 nm-re állítottuk be,és az oszlop hőmérséklete 30 fok volt. Az áramlási sebesség 1,0 ml·perc volt-1 és az injekció térfogata 10 μL volt.EredményekAz echinakozid lineáris összefüggése a 44-es koncentrációtartományon belül.939 7-539.276 4 ug ·mL- 1 jó volt（r = 0.999 8）. A felépülések 94,59 százalékos -105,31 százalékosak voltak（RSD{0}},93 százalék,n = 9）. A Cistanche herba vizes kivonatának echinakozid tartalma 15,527 volt,7.347,12,267 mg·g-1 . 

Következtetés: A bevált, jó ismételhetőségű HPLC módszer pontos,egyszerű és megvalósítható. Alkalmas echinakozid meghatározására vizes kivonatbanCistanche deserticola ma. 

Kulcsszavak:HPLC;vizes kivonataCistanche deserticola;Echinakozid;a tartalom meghatározása

Cistanche deserticolaa hagyományos kínai orvoslásban a klinikai gyakorlatban gyakran használt tonik, és a "sivatagi ginzeng". A Kínai Gyógyszerkönyv 2015-ös kiadásában szereplő Cistanche deserticola a Cistanche deserticola YC Ma vagy Cistanche tubulosa (Schenk) Wright Orobaceae növény szárított, pikkelyes, húsos szára. Meleg természetű, édes és sós ízű, a vese- és vastagbél meridiánokhoz tartozik. Tonizálja a vese yangot, javítja az esszenciát és a vért, nedvesíti a beleket és enyhíti a székrekedést. [2]. 

Sivatagi ginzeng

A "Shennong Materia Medica Classic" kijelenti, hogy "táplálja a középsőt, táplálja az öt belső szervet, erősíti a jint és táplálja az esszenciát".A Cistanche deserticola főként fenil-etanol-glikozidokat, iridoidokat és glikozidokat, lignánokat és glikozidokat, poliszacharidokat, észtereket és alkaloidokat tartalmaz [3].Feniletanol-glikozidokfő aktív összetevőiCistanche deserticola, amelyek közül az echinacea és a medencepart a Cistanche deserticola azonosításának és tartalmának meghatározásának indikátorkomponensei a kínai gyógyszerkönyvben. 

A fenil-etanol-glikozid a Cistanche deserticola fő aktív összetevője

Farmakológiai vizsgálatok [4] azt mutatják Cistanche deserticolakülönféle farmakológiai hatásai vannak, mint például a belek nedvesítése és a székrekedés enyhítése, a máj védelme, a csontritkulás elleni küzdelem, az antioxidáns, az öregedés és a fáradtság elleni küzdelem. A vizes kivonat aCistanche deserticolaelősegítheti az oszteoblasztok csontmorfogenetikus protein 2 génjeit patkányokban, valamint a tartarát-rezisztens savas foszfatázt és az oszteokalcint petefészek-eltávolított egerek szérumában, valamint a Smad1 és Smad5 gének és a transzformáló növekedési faktorok a csontvelőben- A stb.oszteoporózis elleni hatás [5-6]. Echinoside elősegítheti az oszteoblasztok proliferációját és elősegítheti a csontvelői mezenchimális őssejtek oszteoblasztokká történő differenciálódását in vitro[7-9]. 

Echinozid, a Cistanche deserticola fő kémiai összetevője

Kattintson ide a Natural Cistanche Echinacoside termékek megtekintéséhez

【Ask for more】 Email: xue122522@foxmail.com /  Whats App:  0086 18599088692 /  Wechat:  18599088692

Az elmúlt években számos jelentés érkezett a Cistanche deserticola alkoholos kivonatában és összetett készítményeiben [10-12] található echinakozid- és medencepart-tartalmának meghatározásáról, de kevés jelentés érkezett indikátorkomponensek a Cistanche deserticola vizes kivonatában. Ebben a vizsgálatban nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát (HPLC) alkalmaztak a Cistanche deserticola vizes kivonat echinakozid-tartalmának meghatározására.

1. Anyag

1.1 Berendezés

LC-20AT nagy teljesítményű folyadékkromatográfia, SPD-20A detektor, SIL-20Automatikus mintavevő, CTO-10ASvp oszlophőmérséklet-doboz, LCsolution folyadékkromatográfiás munkaállomás, Shimadzu Corporation Japán; MES125P-OCE-DU elektronikus analitikai mérleg, Sartorius, Németország; SHZ-D (III) keringető víz többcélú vákuumszivattyú, Henan Yuhua Instrument Co., Ltd.;

1.2RC2BSO25 rotációs elpárologtató hűtőcirkulációs rendszer, RV10DS96 rotációs elpárologtató, IKA, Németország; DK-S26 elektromos termosztatikus vízfürdő, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.; UPR sorozatú ultra-tiszta vízgép, Sichuan Youpu Ultra Pure Technology Co., Ltd.

1.2 Gyógyászati ​​anyagok és reagensek

Meat Rong gyógyászati ​​anyag, a Guangzhou Lingnan Traditional Chinese Medicine Slices Co., Ltd.-től vásárolt, tételszám: 18010011806001, 181001. A Leobaceae Cistanche deserticola nevű növény szárított, pikkelyes, húsos szárát a Thirdating Chinese Herbalilist által azonosított XXI. A Hagyományos Kínai Orvostudományi Kuangcsou Egyetem Kórházát a Guangzhoui Hagyományos Kínai Orvostudományi Egyetem Harmadik Kapcsolt Kórházának Gyógyszervizsgáló helyiségében tárolják; Echinozid referenciaanyag, tartalom 89,7 százalék, Kínai Élelmiszer- és Gyógyszerellenőrzési Intézet, tételszám: 111670-201706; Az acetonitril kromatográfiailag tiszta (Merck, Németország); A metanol és a foszforsav analitikailag tiszta (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); A víz rendkívül tiszta víz.

2. Módszerek és eredmények

2.1 Vízkivonat készítése Cistanche deserticolából

Vegyük acisztanche por, adjunk hozzá 10-szeres mennyiségű desztillált vizet, melegítsük és forraljuk vissza, hogy kétszer extraháljuk, minden alkalommal 1 órán keresztül. Szűrje le, egyesítse a szűrletet, és forgó bepárló segítségével koncentrálja a szűrletet 0,100 g · ml-1 nyers gyógyszertartalomra. 4 fokon tárolja készenléti állapothoz. 2.2 Kromatográfiás körülmények és rendszeralkalmasság Kromatográfiás oszlop: InertsilODS SPC18 oszlop (150 mm × 4,6 mm, 5 μ m）; mozgófázis: acetonitril (A) - 0,4 százalékos foszforsav oldat (B), gradiens elúció: 0~ A μ L. Ilyen kromatográfiás körülmények között az echinacea csúcsai és a szomszédos komponensek közötti felbontás nagyobb, mint 1,5, az oszlopok elméleti száma pedig nem lehet kevesebb 4000-nél az echinacea csúcsoknál. A kromatogram az 1. ábrán látható.

1. ábra Az echinakozid (A) és a Cistanche herba (B) vizes kivonat HPLC kromatogramja

2.3 Az oldat elkészítése

2.3.1. Összehasonlító oldat

Mérjünk le megfelelő mennyiségetEchinacetinreferenciaanyagot, pontosan mérjük le, helyezzük egy 10 ml-es mérőlombikba, adjunk hozzá metanolt, hogy feloldódjon, és 898,794 Echinacetint tartalmazzon milliliter μG referenciaoldatban, 4 fokon, készenléti állapotban tárolva.

A Cistanche deserticola echinozidája

2.3.2 Tesztoldat

Mérjünk ki pontosan 2.0 ml Cistanche deserticola vizes kivonatot, párologtassuk be vízfürdőben, oldjuk fel metanolban, 10 ml-es mérőlombikban állítsuk állandó térfogatra, jól rázzuk össze, 0,22 μM mikroporózus membránszűrés, nevezetesen.

2.4 Lineáris kapcsolat vizsgálata

Mérje meg pontosan a következőt: {{0}}.25, 0.50, 1.00, 2.00, 2.50, és 3.{11}} ml referenciaoldatot a 2.3.1. pontban, és helyezzük egy 5 ml-es mérőlombikba, adjunk hozzá állandó térfogatig metanolt, és jól rázzuk össze, hogy a gradiens koncentrációja 44,9397, 89,8794, 179,7588, 359,5176, 7449,36 legyen. és 539,2764 μ G · mL-1 referenciaoldat, 0,22 μM Mikroporózus membránszűrés. Végezzük el a meghatározást a 2.2. pontban leírt kromatográfiás körülmények szerint, és jegyezzük fel a csúcsterületet. A referenciaanyag tömegkoncentrációját használva abszcisszaként (X, μ G · mL-1), a csúcs területe az ordináta (Y), és a lineáris regressziós egyenletet kapjuk: Y=13185. 0X-32273.0, r=0.9998. Az eredmények azt mutatták, hogy az echinacea 44,9397 és 539,2764 μ között változott. A lineáris kapcsolat a g · mL-1 koncentrációtartományon belül jó.

2.5 Precíziós teszt

Vegyünk 539,2764 μ G · mL-1 referenciaoldatot, fecskendezzük be folyamatosan hatszor a mintát a 2.2. pontban leírt kromatográfiás körülmények szerint, és jegyezzük fel a csúcsterületet. Eredmények Az echinacea csúcsterületének RSD-je 1,81 százalék volt, ami a műszer jó pontosságát jelzi.

2.6 Stabilitási vizsgálat

Mérjen meg pontosan 2.{1}} ml-tCistanche deserticolavizes kivonatot, vízfürdőn szárazra pároljuk, metanolban feloldjuk, 10 ml-es mérőlombikban állandó térfogatra állítjuk, jól összerázzuk, 0.22 μ Mikroporózus membránnal szűrjük, injektáljuk mintákat a 0., 2., 4., 8., 12. és 24. órában történő meghatározáshoz a 2.2. pontban leírt kromatográfiás körülmények szerint, és jegyezzük fel a csúcsterületet. Eredmények Az echinacea csúcsterületének RSD-je 1,16% volt, ami azt jelzi, hogy a tesztoldat 24 órán belül jó stabilitást mutatott.

2.7 Ismételhetőségi vizsgálat

Mérjen pontosan 6 adag 2.{2}} ml vizes oldatotCistanche deserticola kivonata, készítsen el 6 adag vizsgálati oldatot párhuzamosan a 2.3.2. pontban leírt módszer szerint, fecskendezzen be mintákat a meghatározáshoz a 2.2. pontban leírt kromatográfiás körülmények szerint, és rögzítse a csúcsterületet. Eredmények Az echinacea tömegkoncentrációjának RSD értéke 1,28 százalék volt, ami azt jelzi, hogy a módszer jó ismételhetőségű.

Cistanche deserticola kísérlet

2.8 Minta hozzáadása helyreállítási teszt

Mérjen meg pontosan 9 adag 1.{2}} ml-tCistanche deserticolavizes kivonatot, adjunk hozzá {{0}}.8, 1.0 és 1,2 ml összehasonlító oldatot (101,552 mg · ml - 1), párologtassuk be vízfürdőben, oldjuk fel metanollal, és egy ml-es mérőlombikban térfogatra töltjük; Jól rázza fel, 0,22 μ Szűrje m mikropórusos szűrőmembránnal a nagy, közepes és alacsony koncentrációjú vizsgálati oldat elkészítéséhez. Minden koncentrációból készítsen 3 részt párhuzamosan, mérje meg a 2.2. pontban szereplő kromatográfiás körülmények szerint, rögzítse a csúcsterületet, és számítsa ki a mintafüggőség felépülését. Az eredményeket az 1. táblázat tartalmazza.

2.9 A mintatartalom meghatározása

Mérjen pontosan 3 adag 20 ml-tvíz kivonat a Cistanche deserticolából, vízfürdőben szárazra pároljuk, metanolban feloldjuk, 10 ml-es mérőlombikban állandó térfogatra tesszük, jól összerázzuk, 0,22 μ Mikroporózus membránnal szűrjük, mérjük a 2.2. pontban leírt kromatográfiás körülmények szerint, rögzítse a csúcsterületet, és számítsa ki az echinacea tartalmát. Az eredményeket a 2. táblázat tartalmazza.

1. táblázat Az echinakozid visszanyerési tesztjeinek eredményei

2. táblázat A Cistanche herba vizes kivonatában lévő echinakozid-tartalom meghatározásának eredményei

3.Vita

3.1 A vizsgálati cikk elkészítési módja

A vizes kivonat aCistanche deserticolakülönböző kémiai komponenseket tartalmaz, például fenil-etanol-glikozidokat és poliszacharidokat, amelyek bizonyos interferenciát okoznak a vizsgálandó összetevőkkel. Ez a tanulmány két különböző koncentrációjú oldószert, 50 százalékos metanolt és metanolt vizsgált. Az eredmények azt mutatták, hogy a vizsgált termék kromatogramján a csúcsok elválasztó hatása 50% metanolt alkalmazva oldószerként gyenge volt az echinacea és a szomszédos komponensek között; Oldószerként metanolt használva az echinacea-glikozid csúcs felbontása jó, és nincs interferencia más szennyeződéscsúcsoktól. Ezért a metanolt választottuk a vizsgálati oldat oldószereként. Oldószerként metanolt használva a Cistanche deserticola vizes kivonatát vízfürdőben szárazra pároltuk. Két kezelési módszert alkalmaztunk: metanolos oldást, állandó térfogatú rázatást és metanolos ultrahangos (10 perc) oldást. Az eredmények azt mutatták, hogy nincs szignifikáns különbség a két módszer között. Ezt a módszert választottam a tesztoldat elkészítéséhez a metanol oldás egyszerű működése és az állandó térfogatú rázás miatt.

Kínai gyógynövény-cistanche

3.2 A mozgófázis kiválasztása

Ebben a tanulmányban hivatkoztak a kínai gyógyszerkönyvben (I. kötet) (2015) a Cistanche deserticola tartalom meghatározásához használt mozgófázisra (metanol{0}},1 százalék hangyasav). Az eredmények azt mutatták, hogy az echinacea-glikozid csúcsa kiszélesedett, és egy élvonalbeli jelenség mutatkozott, ami összefüggésben lehet a mozgófázis gyenge elúciós képességével; A vonatkozó irodalomra hivatkozva [12-13], acetonitril-0,5 százalékos ecetsavat használtak mozgófázisként, de az echinacea csúcsformája gyenge volt, és volt egy farokjelenség. A mozgófázis pH-értékét figyelembe véve végül acetonitril-0,4%-os foszforsavat használtunk mozgófázisként. Ennek eredményeként az echinacea csúcsok elméleti lemezszáma nagyobb volt, mint 4000, és az echinacea és a szomszédos komponenscsúcsok közötti felbontás nagyobb volt, mint 1,5. A csúcs alakja szimmetrikus volt, a szennyezőcsúcsok zavarása nélkül, és az alapvonal stabil volt. Ezért ebben a vizsgálatban acetonitrilt - 0,4 százalékos foszforsavat használtunk kromatográfiás mozgófázisként az echinaceatartalom meghatározásához. Ebben a tanulmányban,HPLC módszert alkalmaztunk az Echinacea meghatározására Cistanche deserticola vizes kivonatban.

Cistanche kivonat por

A módszer egyszerű, pontos és reprodukálható. Alkalmas echinacea meghatározására cistanche deserticola vizes kivonatban, és minőségellenőrzési módszerként használható a cistanche deserticola vizes kivonathoz.Ez a vizsgálat csak az echinacea tartalmát határozta meg a Cistanche deserticola vizes kivonatában.A jövőben,a Cistanche deserticola összetett főzetének echinacea tartalmának meghatározását tervezik, hogy feltárják a különböző tényezők hatását az echinacea tartalomra, referenciaként szolgálva a Cistanche deserticola tartalmú főzet minőségellenőrzéséhez.

referencia:

[1] Zhong Ping sivatagi ginseng és cistanche [J] Forest and Human Beings, 2004, 24 (11): 25

[2] Nemzeti Gyógyszerkönyvi Bizottság Gyógyszerkönyve a Kínai Népköztársaságról (I. rész) [M] Peking: China Medical Science and Technology Press, 2015:135-136

[3] Chen Fei, Chen Zhuo, Xing Xuefei és munkatársai Kutatási előrehaladás a Cistanche deserticola területén [J] Drug Evaluation Study, 2013, 36 (6): 469-475

[4] Fang Jian előrelépés a Cistanche deserticola farmakológiai kutatásában [J] Guangming Traditional Chinese Medicine, 2017, 32 (14): 2140 - 2142

[5] Xing Xiaoxu, Liu Zhongjie, Han Bo A cistanche deserticola vizes kivonat hatása a csont morfogenetikus protein 2 génexpressziójára patkány osteoblastokban [J] China AnimalHusbandry and Veterinary Medicine, 2013, 40 (1): 17-21

[6] LIANG H,YU F,TONG Z, et al. Cistanches herba vizes kivonat, amely befolyásolja a szérum BGP és TRAP, valamint a csontvelő Smad1 mRNS, Smad5 mRNS, TGF- 1 mRNS és TIEG1 mRNS expressziós szintjét csontritkulásos betegségben[J]. Molecular Biology Reports, 2013, 40 (2):757-763.

[7] Fang Hailin, Li Junkao, Yao Senming és munkatársai Megfigyelés az echinosidról, amely elősegíti a patkányok oszteoblasztok szaporodását az ERK/BMP aktiválásával-2 Jelút [J] Grassroots Medical Forum, 2015, 19 (4): {{5 }}

[8] Tian Yuan tanulmány a csontvelői mezenchimális őssejtek echinazid által indukált oszteoblasztokká történő differenciálódásáról és annak mechanizmusáról [D] Shenyang: Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 2015

[9] Wei Dawei, Ge Ziyu, Liu Yihan stb. Tanulmány a csontvelői mezenchimális őssejtek echinozidok által indukált differenciálódásáról oszteoblasztokká [J] Pharmacology and Clinic of Traditional Chinese Medicine, 2017, 33 (2): 48-52

[10] Tian Yubiao, Yang Guang'an, Huang Weijie és munkatársai Echinozid és pilozid meghatározása Cistanche deserticola mikroporban HPLC-vel [J] Anhui Agricultural University, 2015, 43 (3): 171-173

[11] Yang Sude, Hu Junhua, Li Jiachun és munkatársai Az echinosid, piloside és izopilozid egyidejű meghatározása HPLC-vel összcistanche glikozid kapszulákban [J] World Science and Technology – Modernization of Traditional Chinese Medicine, 2015, 17 (3) : 609-613

[12] Xu Xiaoxue farmakodinamikai és metabonómiai vizsgálatok a Cistanche deserticola és hatékony összetevőinek csontritkulás elleni hatásairól [D] Yinchuan: Ningxia Medical University, 2017

[13] Yan Yao, Meng Xinyuan, Xu Huanhuan és munkatársai Az echinozid és pilozid meghatározása Qirong Runchang orális folyadékban nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával [J] Journal of Xinjiang Medical University, 2018, 41 (7): 886-888892