A dízel kipufogógáz expozíciója megváltoztatja a zebrahal agyában a neurodegenerációban szerepet játszó hálózatok kifejezését 1. rész

Absztrakt

A neurodegeneratív betegségek a fogyatékosság egyik fő oka a világon, de etiológiájuk nagyrészt megfoghatatlan. A genetikai tényezők a legtöbb betegség kockázatának csak kis részét teszik ki, ami arra utal, hogy a környezeti tényezők jelentős szerepet játszanak e betegségek kialakulásában.

A neurodegeneratív betegségek olyan betegségekre utalnak, amelyek különböző okok miatt az agysejtek degenerációját okozzák. A gyakori betegségek közé tartozik az Alzheimer-kór, a Parkinson-kór, a Huntington-kór stb. Ezek a betegségek az agy idegsejtjeit érintik, ami károsodott agyműködéshez és olyan tünetekhez vezet, mint a memória, a gondolkodás és a viselkedésbeli változások.

A pozitív hozzáállásunkat azonban nem kell elveszítenünk ezek miatt a betegségek miatt. Számos módja van annak, hogy a betegek javítsák a memóriát és enyhítsék a tüneteket. Nézzünk meg néhány ilyen módszert:

Először is végezzen fizikai gyakorlatokat. A kutatások azt mutatják, hogy a fizikai aktivitás javítja az agy vérkeringését, és fokozza az olyan vegyi anyagok felszabadulását, mint a dopamin és az endorfin, amelyek segítenek megvédeni és javítani a neuronok működését. Ugyanakkor a testmozgás segíthet csökkenteni az olyan problémákat is, mint a szorongás, a depresszió és az álmatlanság, így a betegek kellemesebbé teszik az életet.

Másodszor, tartsa fenn a társas kapcsolatokat. Az is nagyon fontos, hogy közösségi hálózataink szorosan kapcsolódjanak az agy kapcsolódó területeihez, és a társas interakció nemcsak a stresszt csökkentheti, hanem javíthatja az agy egészségét is a boldogság fokozása, a depresszió elleni küzdelem stb. révén.

Végül egyél jól és aludj eleget. Mindkét szempont fontos hatással lehet az agy egészségére. A jó étrendnek nemcsak elegendő tápanyagot kell tartalmaznia, hanem kerülnie kell a túl sok cukor, telített zsírok és koleszterin ismételt fogyasztását is. Ezenkívül az elegendő alvás segíthet a memóriaproblémák leküzdésében különböző szakaszokban, különösen az olyan betegségek, mint az Alzheimer-kór.

Röviden, a neurodegeneratív betegségek nem jelentik az életre vonatkozó elvárások feladását. A pozitív attitűd megőrzése mellett tudományos és hatékony módszerek átvételére is szükség van az életminőség javítására. Több nevetés és több napsütés segít abban, hogy egészséges maradjon. Látható, hogy javítanunk kell a memórián, a Cistanche deserticola pedig jelentősen javíthatja a memóriát, mert a Cistanche deserticola egy hagyományos kínai gyógyászati ​​anyag, amelynek számos egyedi hatása van, amelyek közül az egyik a memória javítása. A Cistanche deserticola hatékonysága a benne található számos hatóanyagnak köszönhető, beleértve a csersavat, poliszacharidokat, flavonoid glikozidokat stb. Ezek az összetevők számos úton elősegíthetik az agy egészségét.

Kattintson a Tudjon meg 10 módszerre a memória javítására

A közelmúltban megállapították, hogy a levegőszennyezésnek való hosszan tartó kitettség növeli az Alzheimer- és a Parkinson-kór kockázatát, de a hatás molekuláris mechanizmusai nem teljesen ismertek.

A dízel kipufogórészecske-kivonatnak (DEPe) kitett zebrafishembryok diszfunkcionális autofágiához és idegsejtek elvesztéséhez vezetnek. Itt zebrahal embriókat tettünk ki a DEPe hatásának, és nagy áteresztőképességű proteomikai és transzkriptomikus expressziós elemzéseket végeztünk az agyukból, hogy azonosítsuk a levegőszennyezés által kiváltott patogén útvonalakat. A DEPe-kezelés számos, a neurodegeneratív folyamatokkal kapcsolatos biológiai folyamatot és jelátviteli útvonalat megváltoztatott, beleértve a xenobiotikus anyagcserét, a fagoszóma érését és az amiloid feldolgozást. A génexpresszió legnagyobb indukciója a Cyp1A-ban volt (több mint 30--szer).

Ennek az expressziós változásnak a jelentőségét megerősítette az indukció blokkolása a CRISPR/Cas9 használatával, ami a DEPe toxicitással szembeni érzékenység drámai növekedését eredményezte, megerősítve, hogy a Cyp1A indukció egy kompenzáló védőmechanizmus.

Ezek a tanulmányok olyan megzavart molekuláris útvonalakat azonosítottak, amelyek hozzájárulhatnak a neurodegeneratív rendellenességek patogeneziséhez. Végső soron a légszennyezés molekuláris alapjainak meghatározása, hogyan növeli a neurodegeneráció kockázatát, elősegíti a betegségmódosító terápiák kifejlesztését.

Kulcsszavak

Légszennyezés · Demencia · Parkinson-kór · Alzheimer-kór · Transzkriptomika ·Proteomika.

Bevezetés

A légszennyezettség nagymértékben hozzájárul a halálozáshoz, és összefügg a légúti megbetegedésekkel, szívbetegségekkel, szélütéssel, tüdőrákkal és cukorbetegséggel. Az újonnan megjelenő epidemiológiai bizonyítékok alátámasztják a kapcsolatot a légszennyezettség és a neurodegeneratív betegségek, köztük az Alzheimer- és a Parkinson-kór (AD és PD) kialakulása között (Fu et al. 2019). Kevés kutatás foglalkozik azon mechanizmusokkal, amelyek révén a levegőszennyezés növelheti az AD és a PD kockázatát, de néhány létezik, amely alátámasztja az ok-okozati összefüggést (Fu et al. 2019).

A fehérjezárványok felhalmozódása az agyban a neurodegeneratív rendellenességek univerzális jellemzője, és valószínűleg az idegrendszeri diszfunkcióhoz és halálhoz vezető gyakori út. Például az amiloid-béta (A-béta) és tau struktúrák kialakulása az AD és -synuclein (-syn) aggregátumok vagy Lewy-testek patológiás jellemzői a PD-ben (Ross és Poirier 2004; Woulfe 2008).

Úgy tűnik, hogy a proteosztázisban bekövetkezett változások legalább részben támasztják alá ezeknek az aggregátumoknak a kialakulását, de a pontos mechanizmusok még mindig ismeretlenek, és egyénekben változhatnak a genetikai és környezeti kockázati tényezőktől függően. Tudjuk, hogy az A-betaor -syn fokozott expressziója vagy csökkent lebomlása AD-hoz és PD-hez vezethet (Bostancıklıoğlu2019; Johnson et al. 2019).

A neurodegeneratív rendellenességek további közös jellemzői a gyulladás és az oxidatív stressz. Az aktivált mikroglia, a központi idegrendszer gyulladásos sejtjei könnyen értékelhetők az AD és PD agy boncolásai során, és valószínűleg hozzájárulnak a neurodegeneráció patogeneziséhez (Kannarkat et al. 2013). Úgy gondolják, hogy ez a gyulladás és esetleg mitokondriális diszfunkció oxidatív stresszhez vezet, amelyet a boncolt agyak is értékelnek (Picca és mtsai. 2020).

A légszennyezéssel és neurodegenerációval foglalkozó mechanikai tanulmányok többsége eddig a gyulladásra összpontosított (Jayaraj et al. 2017). Úgy tűnik, hogy a levegőszennyezés fokozza a központi idegrendszer gyulladását és az oxidatív stresszt egyaránt az állati és az emberi agyban (Calderón-Garcidueñas és mtsai 2004, 2007, 2008a, b és c; Levesque és mtsai 2011a, b, 2013; Moulton és Yang 2012; Mumaw et al. 2017; Yokota et al.2013a, b).

Különösen érdekesek azok az eredmények, amelyek szerint a levegőszennyezés fokozza egyes gyulladásos gének expresszióját az egerek olfactory bulb (OB) sejtjeiben, egy olyan agyi régióban, ahol a PD patológiát a betegség korai szakaszában észlelik (Levesque et al. 2011a, b; Yokota et al. 2013a). . A gyulladást a városi területeken élő kutyáknál is észlelték, összehasonlítva a vidéki területeken élőkkel, és a szerzők azt feltételezték, hogy ezek a változások a levegő magas szintű szennyezettségének tudhatók be (Calderón-Garcidueñas et al. 2003).

Ugyanezek a szerzők azt is felvetették, hogy a -syn felhalmozódott a városokban élő emberek agyában a levegőszennyezés miatt (Calderón-Garcidueñas et al. 2004, 2008a,b). Egy közelmúltbeli, zebrahal modellen végzett vizsgálatban a DEPe-nek való kitettségről számoltak be, hogy neurotoxicitást és az idegsejtek számának jelentős csökkenését okozza az autofágia megzavarásával (Barnhill et al. 2020).

A DEPe a levegőszennyezés számos toxikus komponensét tartalmazza, és általánosan használják a sejttenyésztő rendszerekben való expozíció modellezésére (Costa és mtsai 2014; Hesterberg és mtsai 2010; Levesque et al. 2011b). Az autofágia egy esszenciális intracelluláris mechanizmus a rosszul hajtogatott fehérjék és a sérült organellumok eltávolítására és felszámolására.

Valójában pontos autofág aktivitás szükséges a sejt homeosztázisához, és a neuronok diszfunkcionális autofágiája megváltozott túléléshez és neurodegenerációhoz vezet (Kesidou et al. 2013). Sok ilyen tanulmánynak egyértelmű korlátai vannak, de mindegyik arra utal, hogy a légszennyezettség növeli az AD kockázatát. és PD. Korlátozottan ismerjük azokat a mechanizmusokat, amelyek révén a szennyezés növeli ezt a kockázatot, de az ultrafinom részecskék és a levegőszennyezés számos összetevője közvetlenül a szaglógömbön keresztül, a tüdőn keresztül a véráramon keresztül juthat az agyba (Kilian és Kitazawa 2018).

Ezek a részecskék szénmagból és adszorbeált vegyületekből, például policiklusos aromás szénhidrogénekből, fémekből, nitrátokból, szulfátokból és más elemekből állnak, és a légszennyező anyagok jelentős részét alkotják, különösen a városi területeken. Sok ilyen vegyület szerepet játszik az oxidatív stresszben és a sejtekben. toxicitás, amely valószínűsíti a levegőszennyezés és a neurodegeneráció okozati összefüggését.

A részletes multidiszciplináris vizsgálatok, beleértve a sejt- és állatmodelleket is, betekintést nyújthatnak a betegségek okaiba és irányíthatják a jövőbeni terápiás megközelítéseket (Cannon és Greenamyre 2011). Az in vivo vizsgálatokhoz használt modellszervezetek közül a Danio rerio (zebrahal) hatékony modell a toxikológia, a molekuláris genetika, a toxikogenomika és a gyógyszerkutatás tanulmányozására.

A legtöbb biológiai útvonal erősen konzervált gerincesekben, és a funkcionális emberi gének többsége homológokkal rendelkezik a zebrahalban (Vaz et al. 2018). Ezenkívül a zebrahal embriói gyorsan és függetlenül fejlődnek, lehetővé téve az elemzést a kívánt fejlődési szakaszban. Ezek a tulajdonságok, valamint a gyors szaporodás és az alacsony tartási költség a zebrahalat kedvező modelljévé teszik a környezeti expozíció toxikus hatásainak tanulmányozására.

A betegség patogenezisében rejlő molekuláris mechanizmusok jobb megértése érdekében a nagy áteresztőképességű génexpressziós profilalkotási megközelítések széles skáláját fejlesztették ki. A tömegspektrometrián alapuló proteomika és a nagy áteresztőképességű RNS-szekvenálás különösen ígéretes az érdeklődésre számot tartó biológiai útvonalak azonosításában. Ezeket a technikákat széles körben alkalmazták sejt- és állatmodellek környezeti ingerekre adott válaszának megértésére (Duan és mtsai. 2017; García-Estrada és mtsai. 2013; Jamiet al. 2014a, b, 2015; Kosalková et al. 2012).

Ebben a tanulmányban expressziós elemzéseket végeztünk a DEPe-kezelés hatásairól a zebrahalak fején belüli proteom- és transzkriptomprofilokra egyaránt. A főként agyszövetből álló fejből származó minták izolálása lehetővé tette a szövetspecifikus profilok elérését és a más szövetekből származó hatások minimalizálását. Itt leírtuk a megváltozott génexpressziót és fehérjeprofilokat számos olyan útvonalon, amelyek szerepet játszanak a neurodegenerációban a DEPe-nek kitett zebradán fejében. Ezek az eredmények új betekintést nyújtanak azon lehetséges mechanizmusokba, amelyek révén a légszennyezés növeli az AD és a PD kockázatát.

Anyag és módszerek

Halkezelés és CRISPR/Cas{0}}közvetített geneknockdown

Minden vizsgálatot jóváhagyott az UCLA Állatjogi Bizottsága. A zebrahalakat (AB) fénystimulációval tenyésztjük 1 órán át, és összesen 200 tojást inkubáltak 24 órán át 28 °C-on. A kapott embriókat pronázban (2 mg/ml) dechorionáltuk, és vagy DEPe-vel (Standard Reference Materials, NIST, Gaithersburg, MD) kezeltük 20 ug/ml végső koncentrációban, vagy vivőanyaggal a megtermékenyítést követő 5 napig (DPF).

Ezt a koncentrációt választottuk ki, mivel az idegsejtek elvesztését eredményezte, amint azt korábban közölték, de jelentős mortalitás nélkül (Barnhillet al. 2020). A Cyp1A leütött halat a következőképpen készítettük el. A http://crispr.mit.edu webhelyen elérhető eszközök segítségével a CRISPR RNS (Cyp1A-crRNA) ) a Cyp1A gén első exonjában lévő megfelelő PAM helyek elhelyezkedése alapján tervezték.

A legjobb tervet az IDT DNS-től (www.idtdna.com) vásároltuk a szabványos CRISPR-Cas9 tracrRNS-sel együtt. A Cyp1Agene és a tracrRNS crRNS-ét külön-külön reszuszpendáltuk 10 mM Tris-EDTA-ban, hogy 100 µM végső koncentrációt kapjunk. Ezután a tracrRNS-t crRNAin 1×duplex pufferrel (100 mM kálium-acetát; 30 mM HEPES, pH 7,5; IDT DNS) kombináltuk, így 10 µM végső koncentrációt kaptunk. Az elegyet 95 fokra melegítettük 5 percig forrásban lévő vízfürdőben, majd lassan szobahőmérsékletre hűtöttük, hogy lehetővé tegyük a komplementer incrRNS és tracrRNS nukleotidszekvenciák összekapcsolódását és a funkcionális vezető RNS (gRNS) képződését.

Ezután 3 μl annealedgRNS-t kombináltunk ugyanolyan térfogatú donor egyszálú DNS-sel (ssDNS; 200 μM), mint a Cyp1A mutáns templátszekvenciája. 3 ug Cas9 nukleázt (IDT) 1×injekciós pufferben (5 mM KCl; 0,1 M nátrium-foszfát, pH 6,8) adtunk az elegyhez, hogy a végső CRISPR/Cas9 ribonukleoprotein (Cyp1A-RNP) komplexek keletkezzenek.

A Scramble RNP (SC-RNP) előállításához a specifikus Cyp1A-crRNS-t kereskedelmi Scramble-crRNS-sel helyettesítettük, célpont nélkül a genomon. Az ebben a munkában használt összes oligonukleotid szekvenciáját az 1. kiegészítő táblázat tartalmazza. A tojásokat sztereomikroszkóp alatt injektáltuk körülbelül 3 nl RNP injekciós keverékkel.

Öt biológiai ismétlődő injekciót (minden ismétlés 400-600 Cyp1A-RNP-vel és 100-200 SC-RNP-vel injektált tojást tartalmazott) végeztünk, és az összes mikroinjekciót 60 percen belül befejeztük. A tojásokat 100 mm-es műanyag Petri-csészékbe helyeztük és 28 fokos tojásvízben inkubáltuk. Az embriók túlélési arányát 7 napig követtük.

A túlélő halak képeit felülvizsgálták a fejlődési rendellenességek értékelése céljából. Mindegyik lárvát vakon értékelték 4 fejlődési rendellenesség jelenlétére, beleértve a fej fejlődési rendellenességét, a farokfejlődési rendellenességet, a szívödémát és a tojássárgája ödémát. A mind a 4 fejlődési rendellenességgel rendelkező lárvák 4-et kaptak, míg a normálisan fejlődő lárvák 0 pontot kaptak. A szignifikáns különbségek értékelésére a statisztikai T-próbát alkalmaztuk.

For more information:1950477648nn@gmail.com