A dízel kipufogógáz expozíciója megváltoztatja a zebrahal agyában a neurodegenerációban szerepet játszó hálózatok kifejezését 2. rész

Fehérjeminta előkészítése

A fehérjeminták elkészítéséhez a 8{4}} és 100 altatott lárva fejét (5 pdf) gondosan izoláltuk, és PBS-sel mostuk, majd lízispufferbe vitték át, amely 15% előhűtött TCA/acetont tartalmazott, amely 0,07% béta-merkaptoetanolt (ME) tartalmazott. ) és proteáz inhibitor koktél (gyártó szükséges) összesen 500 ul mennyiségben.

Az elmúlt években jelentős érdeklődés mutatkozott a fehérjeminták memóriára gyakorolt ​​hatása iránt. Egyre többen kezdik felismerni az étrend fontosságát az egészség szempontjából, különösen a fehérjék fontos szerepét az emberi szervezetben.

A fehérjék az emberi szervezet alapvető építőanyagai, és fontos szerepet töltenek be az emberi szervezetben. Emiatt a fehérjeminták sok ember számára fontos csatornává váltak az egészségre és szépségre való törekvésben. Az izomépítés és a test formázása mellett a fehérjeminták javíthatják az ember memóriáját is.

Egyes tudósok tanulmányozták a fehérjék és a memória közötti kapcsolatot. Azt találták, hogy a megfelelő mennyiségű fehérje hosszú távú bevitele jótékony hatással van a fizikai egészség minden aspektusára, különösen a memóriára. Egyre több bizonyíték támasztja alá, hogy az étrendi fehérjebevitel jelentős hatással van az agyműködésre és a memóriára.

A fehérje az emberi agy neuronjainak fontos összetevője, így a napi fehérjebevitel jelentős hatással van az emberek memóriájára és gondolkodási képességére. A hosszú távú fehérjebevitel nemcsak kielégíti a szervezet fehérjeszükségletét, hanem segíti az agy aktív és egészséges megőrzését is.

Ezenkívül a fehérje segíthet a szervezetnek fenntartani a vércukorszintet és fenntartani a stabil hangulatot. Ez nagyon fontos a memória és a gondolkodási készségek megőrzéséhez. Ezért a fehérje mérsékelt bevitele javíthatja az emberi test különböző kognitív funkcióit és érzelmi állapotait.

Összességében erős kapcsolat van a fehérjeminták és a memória között. A fehérjebevitel növelése segít megőrizni az agy és a test egészségét, javítja a gondolkodási készségeket és a memóriát. Azok számára, akiknek javítaniuk kell a memóriájukat, nagyon fontos a megfelelő mennyiségű fehérje fogyasztása. Megfelelően fogyasszunk fehérjetartalmú ételeket, és ügyeljünk az ésszerű étkezésre az egészséges test és az éles elme megőrzése érdekében. Látható, hogy javítanunk kell a memórián, a Cistanche deserticola pedig jelentősen javíthatja a memóriát, mivel a Cistanche deserticola antioxidáns, gyulladáscsökkentő és öregedésgátló hatással bír, ami segíthet csökkenteni az oxidációt és a gyulladásos reakciókat az agyban, ezáltal védi a az idegrendszer egészsége. Ezenkívül a Cistanche deserticola az idegsejtek növekedését és helyreállítását is elősegítheti, ezáltal javítva a neurális hálózatok összekapcsolhatóságát és működését. Ezek a hatások segíthetnek javítani a memóriát, a tanulást és a gondolkodási sebességet, valamint megakadályozhatják a kognitív diszfunkciók és a neurodegeneratív betegségek kialakulását.

Kattintson a Tudnivaló kiegészítőkre a memória javításához

Rövid homogenizálás után a fehérjéket 12 órán át 20 fokon kicsaptuk, majd centrifugáltuk 12, 000 fordulat/perc mellett 5 percig 4 fokon. A felülúszót eltávolítottuk, és a fehérjepelletet kétszer mostuk hideg acetonnal (amely 0.07% ME-t és proteáz inhibitor koktélokat tartalmazott). A végső fehérjepelletet 7,0 M karbamidot tartalmazó lízispufferben oldottuk, és 2,0 M tiokarbamidot jégen végzett ultrahanggal.

A szolubilizált fehérjemintákat 15, 000 fordulat/perc mellett 10 percig 4 fokon centrifugáltuk az oldhatatlan részecskék kicsapása érdekében, és a végső fehérjeminták koncentrációját Bradford-módszerrel mértük.

TMT-alapú nagy áteresztőképességű proteomikai elemzés

A mintákat redukáltuk, alkileztük és emésztettük tripszin és lys-C proteázok egymás utáni hozzáadásával. A peptideket ezután 10-plexTMT izobár címkékkel jelöltük a gyártó utasításai szerint. A jelölt mintákat összekevertük, majd nagy pH-jú fordított fázisú kromatográfiával finomra frakcionáltuk.

Az egyes frakciókat ezután LC-MS/MS módszerrel elemeztük online fordított fázisú kromatográfiával és tandem tömegspektrometriával, Thermofsher Fusion Lumos tömegspektrométerrel. Az adatokat a szinkron prekurzorszelekción alapuló MS3 módszerrel szereztük be, a korábban leírtak szerint (McAlister et al. 2014). Az adatbázisban való keresést és a TMT riporterion információinak kinyerését a MaxQuant szoftverplatform segítségével végeztük (Cox és Mann 2008).

A minták TMT-adatainak összehasonlítását MSStats (Choiet al. 2014) segítségével végeztük. Transzkriptomikai analízis Körülbelül 80-100 fejet izoláltunk elaltatott embriókból (120 óra), mostuk PBS-sel, és Trizol (Sigma Aldrich, Saint Louis) segítségével teljes RNS extrakciónak vetettük alá. , USA) reagens a gyártó utasításait követve.

Az RNS minőségét és mennyiségét NanoDrop2000 spektrofotométerrel (Thermo Scientific, MA), majd Agilent 2100 Bioanalyzerrel értékeltük, hogy biztosítsuk a minimális 50 ng/ul koncentrációt és 8-as RNS-integritási számot (RIN). a protokoll: "TruSeqStranded Total RNA Library Prep workflow with Ribo-Zero Gold", és a minták sorrendje a következő feltételekkel történt: "Paired End run, R1=75 ciklus (antiszensz szál), Index=8 ciklus, R2=75 ciklus (érzéki szál)."

Adatelemzés

A proteomikai és a transzkriptomikai vizsgálatokhoz szükséges mindkét adatkészletet egyidejűleg töltötték fel és elemezték a Metascape online eszközzel, amely lehetővé teszi a génjegyzetek készítését különböző fajokhoz, beleértve a Danio rerio-t (Zhou és mtsai, 2019). A proteómák vagy a transzkriptomprofil-módosítások inspecifikus útvonalak hozzájárulásának értékeléséhez adatokat használtunk. az Ingenuity Pathways Analysis (IPA) szoftver segítségével elemezték (Krämer et al. 2014).

A gén- vagy fehérjeazonosítókat és a megfelelő expressziós értékeket tartalmazó adatsorok feltöltésre kerültek az alkalmazásba. Az Ingenuity tudásbázisában minden azonosító hozzá lett rendelve a megfelelő objektumhoz.

Az expressziós változás 1.{1}}szeres határértékét állítottuk be, hogy azonosítsuk azokat a molekulákat, amelyek expressziója eltérően szabályozott. A funkcionális elemzés azonosította azokat a biológiai funkciókat és/vagy betegségeket, amelyek a legjelentősebbek az adathalmazban. Az elemzés során figyelembe vették az adatkészletből származó molekulákat, amelyek megfeleltek a küszöbértéknek és biológiai funkciókhoz kapcsolódnak. A Right-tailedFisher-féle egzakt tesztet egy p-érték kiszámítására használták, amely meghatározza annak valószínűségét, hogy az adatkészlethez rendelt egyes biológiai funkciók és/vagy betegségek pusztán a véletlennek köszönhetők.

Útvonal elemzés

Mindkét adatkészletet feltöltöttük az IPA szoftverbe (Krämer et al. 2014), hogy kiértékeljük a proteom-ortranszkriptom profil változásainak hozzájárulását bizonyos útvonalakhoz. A legjobban szignifikánsan megváltozott kanonikus útvonalakat ezután tovább értékeltük és értelmeztük PCR és Western blot segítségével az alábbiakban leírtak szerint.

Western blot

Összesen 25 µg fehérjét töltöttünk fel 12%-os NuPAGE-ra (Novex, CA), és PVDF-membránokra (Novex, CA) vittük át a leírtak szerint (MahmoudianSani et al. 2017; Rafee et al. 2019). A membránokat 5% sovány tejjel Tris-pufferolt sóoldatban és 0,01% Tween 20-ban (TBST puffer) blokkoltuk 30 min szobahőmérsékleten, majd egy éjszakán át 4 fokon inkubáltuk nyúl poliklonális anti-Cyp1A1-gyel (Abcam, CA) vagy egér monoklonális anti-GA PDH-val. Abcam, CA), 1% sovány tejet tartalmazó TBST pufferrel hígítva.

TBST-ben történő mosás után a blotokat másodlagos szamár anti-nyúl-HRP (Abcam, CA) vagy kecske anti-egér-HRP (Santa Cruz, CA) antitestekkel inkubáltuk 2 órán át, majd Pierce™ ECL Plus Western blotting szubsztráttal ( Thermo Fisher Scientific, USA). A sávokat LI-COR szkennerrel végzett képalkotással vizualizáltuk, és denzitometriával (LI_COR Biosciences, NE) elemeztük.

Valós idejű PCR

A teljes RNS-t a fejekből TRIzol reagenssel (Sigma Aldrich, Saint Louis, USA) izoláltuk a gyártó utasításait követve, majd NanoDrop 2000 spektrofotométerrel (Thermo Scientific, MA) megmértük. Minden RNS-mintából 1 µg-ot reverz átírtunk iScript™ reverz transzkripciós szuperkeverékkel (Bio-Rad, CA), és valós idejű PCR-t hajtottunk végre SsoAdvancedUniversal SYBR Green szupermix (Bio-Rad, CA) használatával, és a primerek listája. A relatív expressziós szintet a 2−ΔΔCT módszerrel számítottuk ki, és a statisztikai T-tesztet használtuk a szignifikáns különbségek értékelésére.

Eredmények és vita

A proteomikai és transzkriptomikai elemzések két fő eszközt jelentenek a betegségi folyamatok mögött meghúzódó molekuláris mechanizmusok és a környezeti ingerekre adott válaszok megértésében (Duan et al. 2017; García-Estrada et al. 2013; Jami et al. 2014a, b, 2015; Kosalková et al. 2012). . Itt mély expressziós elemzéseket végeztünk a DEPe-nek kitett zebrahal embriók fejében mind a transzkriptomikus, mind a proteomikus szinten.

A túlnyomórészt agyszövetből álló fejeket azért izoláltuk, hogy kiküszöböljük más szövetek expressziós profilját, mivel a központi idegrendszer belső patológiás útvonalainak meghatározása érdekel bennünket.

A zebrahalak fejének expressziós profilja

A profilanalízis 11 172 kimutatott fehérjét és 14 748 mRNS célpontot eredményezett a több mint 26,{5}} kódoló gén közül (Howe és mtsai. 2013). A TMT-vel jelölt mintákból azonosított 11 172 fehérje közül (2. kiegészítő táblázat) 141 fehérje szignifikánsan felszabályozott, 607 pedig alulszabályozott (3. kiegészítő táblázat és 1a. ábra). Hasonlóképpen, 367 transzkriptumot szabályoztak, és 149-et csökkentettek az RNS-seq elemzésben kimutatott 14 748 transzkriptum közül (4. kiegészítő táblázat) (1b. ábra és 5. kiegészítő táblázat).
A legtöbb esetben a felszabályozott proteomikai és transzkriptomikai elemzések eredményei konzisztensek voltak. Például a fokozottan szabályozott fehérjék közé tartozik a citokróm P450 Cyp1a, Cyp1c1, a guaninennukleotid-kötő fehérje gamma alegysége, az Annexin, a Plexin B2b rövid izoformája, a dehidrogenáz/reduktáz (SDR család) 13-szerű 1, S-antigén a reland grófság/pinegén (arrestin) b és szulfotranszferáz6B1.

Hasonlóképpen, a legmagasabb transzkriptomikus szabályozású gének közé tartozik a citokróm P450 (Cyp1a), a kemokin (C–C motívum) ligandum 27a, az aril-szénhidrogén-receptor represszor A, a citokróm P450 (Cyp1b), és az Rh család C glikoproteinje. nem mindig voltak szoros összefüggésben.

Például a Complexin 2, a Spectrin alfa, a szívmiozin könnyű lánc-1, a SEC23 kölcsönhatásba lépő fehérje, az EA ATP-szintáz membrán alegység, a citokróm b és a NAD-függő fehérje-dezacetiláz az erősen leszabályozott fehérjék közé tartoznak, míg a retinaluter szegmens membránfehérje 1a , az 5. oldott anyaghordozó család (jodid transzporter), az FBJ egér osteosarcoma vírus onkogén B homológja, a komplexin 4c, a FOSlike antigén 1a, az opsin 1 és a v-fos mutatja a transzkripció legmagasabb downregulációját (1. és 2. táblázat).

A zebrahal fehérjéket felismerő antitestek száma korlátozott, de Western blot analízissel megerősítettük ezeket a változásokat. A Cyp1A fehérje fokozódását és a Complexin 2 (CPLX2) downregulációját GAPDH-val terheléskontrollként igazoltuk (2a. ábra). A TAT és UGT1B1 transzkripció magasabb szintjét, valamint a CHNRB és TH2 alacsonyabb szintjét qPCR is megerősítette, belső kontrollként Elf-alfát használva (2b. ábra).

Gén annotáció

Számos online bioinformatikai eszköz és szoftver létezik, amelyek hasznos információkkal szolgálhatnak a genetikai megjegyzésekben. Ezek közül a Metascape-et használták, amely képes Danio rerio génannotációjára (Zhouet al. 2019).

A proteomikai és transzkriptomikai vizsgálatok mindkét adatkészletét egyidejűleg töltötték fel és elemezték ezzel az online eszközzel. A szoftverben a proteomikai és a transzkriptomikus változások kimenetének egyesítése után számos folyamat, például a xenobiotikus ingerre adott válasz, a xenobiotikumok metabolizmusa a citokróm P450 által, és a circadian expresszió szabályozása DEPe kezelés hatására indukáltak (3a. ábra).

Ez az elemzés az olyan biológiai folyamatok elnyomott szintjére is utalt, mint a "vizuális észlelés", "fényképtranszdukció" és "G-fehérje-kapcsolt receptor internalizáció". A látással kapcsolatos kifejezési profilokban bekövetkezett változások nem voltak váratlanok, mivel a korai fejlődés során a DEPe-kezelés kisebb szemeket eredményezett (az adatokat nem mutatjuk be).

Xenobiotikus anyagcsere jelzés

A xenobiotikumok, amelyek idegen természetes vagy szintetikus kémiai vegyületek, kiválthatják a celluláris stresszválaszt, ami differenciálódáshoz, proliferációhoz, apoptózishoz vagy nekrózishoz vezethet. Valójában a szervezetnek aktívan védekeznie kell a xenobiotikumokkal, valamint a toxikus endogén vegyületekkel és metabolitjaikkal szemben, az eliminációjukban és méregtelenítésükben részt vevő enzimek és transzporterek expressziója révén.

Ezeket az enzimeket három csoportba sorolják: PhaseI enzimek (CYP, ALDH, FMO), amelyek polaritást visznek be a xenobiotikumokba; fázisú enzimek (UGT, GST, SULT), amelyek hidrofil molekulák, például szulfát, glükuronsav és glutation, xenobiotikumokhoz való konjugálásával hidrofilitást hoznak létre; és a III. fázisú enzimek (MDR1, OATP2, MRP), amelyek a II. fázis során képződött xenobiotikumokat vagy konjugátumokat szállítják az extracelluláris területre.

Ezeket az enzimeket a specifikus receptorok (CAR, PXR, AHR) és a MAPK által közvetített transzkripciós faktorok aktiválása (NRF2, MAF) jelátviteli kaszkádok indukálják (Omiecinski et al. 2011).

Aktivátorok hiányában a konstitutívan aktív receptor (CAR) a citoplazmában található, mint CCRP-vel és HSP90-nel alkotott komplex. Ha azonban aktivátor van jelen, a CAR a sejtmagba transzlokálódik, és az RXR-hez kötődik, hogy heterodimert képezzen, valamint az ismétlődő motívum számos változatához, például a DR3-hoz, DR4-hez, ER6-hoz és ER8-hoz kötődik, és hozzájárul a génexpresszió szabályozásához (2. kiegészítő táblázat).

Proteomikai elemzésünk a xenobiotikus anyagcsere aktiválódását tárta fel. Valójában a CYP1A1, CYP3A7, HMOX1 (hem oxigenáz 1), CAT (kataláz) és CES1 (karboxilészteráz 1) egyértelmű felszabályozása az I. fázisú metabolizmus indukcióját mutatja, míg az UGT1A1 (UDP glükuronoziltranszferáz család 1 tagja A1) és a GSTP1 (GSTP1) fokozott expresszióját. glutationS-transzferáz pi 1) a PhaseII metabolizmus aktiválását jelzi.

Érdekes módon a szulfát-transzferázok, például a SULT1A1 (1A szulfotranszferázcsalád 1-es tagja), SULT1C2 (1C szulfotranszferáz-család 2-es tag) és SULT2B1 (2B szulfotranszferázcsalád 1-es tagja) leszabályozása azt sugallja, hogy a hidrofilitás növekedése a fázis II-es gluta-hikuronsav-metabolizmussal és előnyösen a glutáthikuronsav-metabolizmussal. , de nem szulfát konjugáció (4. ábra).

A transzkriptomikus vizsgálat eredményei meglehetősen konzisztensek, mivel a CYP1A, a CYP1B, a CYP3A7, a GSTO1, a GSTP1 és az UGT1A1 mind felszabályozott az RNS szintjén. A SULT2B1 azonban RNS-szinten felülszabályozást mutat (míg a fehérjeszinten alulreprezentált).

Ennek oka lehet más mechanizmusok részvétele, amelyek a szulfát-transzferáz enzim lebomlását vagy inaktiválását idézik elő DEPe-kezelés után. Ami különösen meglepő, az az, hogy a xenobiotikus anyagcsere változásai a halak fejében (feltehetően agyában) következtek be. A xenobiotikus gének expresszióját emlősök idegrendszerében írták le, de ez az első jelentés ezekről a zebrahal agyában (McMillan és Tyndale 2018).

Ezek az eredmények összhangban vannak Shankar és munkatársai által végzett hasonló tanulmányokkal, akik a környezeti policiklusos aromás szénhidrogének (PAH) különböző csoportjainak az embriók fejlődésére gyakorolt ​​hatását vizsgálták, és továbbértékelték az egyes kezelési rendek hatását a transzkriptom profiljára.

A 48 hpost-fertilization (hpf) embrió teljes testén kimutatták, hogy a Cyp1a felszabályozása mind a transzkripciós, mind a fehérjeszinten a xenobiotikus AHR aktiváció és a transzkriptomikus változások korai megbízható biomarkere (Shankar et al. 2019).

Az NRF{0}}közvetített oxidatív stresszválasz

Az oxidatív stressz apoptózist és nekrózist válthat ki, és úgy gondolják, hogy részt vesz a neurodegenerációban (Ahmadinejad és mtsai. 2017; Jami és mtsai. 2014b, 2015). Az oxidatív stresszre adott legfontosabb sejtvédelmi válasz az antioxidáns és méregtelenítő enzimek indukciója.

A nukleáris faktor-eritroid 2-kapcsolódó 2-es faktor (Nrf2) a promoter antioxidáns válaszelemeihez (ARE) kötődik, és aktiválja azok transzkripcióját. Az inaktív Nrf2 egy aktinkötő fehérjéhez, a Keap1-hez kapcsolódik, és megmarad a citoplazmában.

Az oxidatív stressz által kiváltott Nrf2 a protein kináz C, a foszfatidilinozitol 3- kináz és a MAP kináz útvonalakra reagálva foszforilálódik. A foszforilált Nrf2 ezután átjuthat a sejtmagba, és megkötheti az ARE-t, hogy transzaktiválja a méregtelenítő és antioxidáns enzimeket (3. kiegészítő táblázat) (Ma 2013).

For more information:1950477648nn@gmail.com