Megkülönböztető útdíj-szerű receptorok génexpresszió és gliális válasz a természetes surlókór különböző agyi régióiban 2. rész

2.2. Neuropatológiai jellemzők a Serapie-val természetesen fertőzött juhok hippokampuszában

A surlókórral fertőzött és a kontroll juhoknál a következő négy hippocampális területet vizsgáltuk meg részletesebben az összes kóros marker tekintetében: a CA1, CA3 és CA4 piramissejteket, valamint az SLM-et (3. ábra).

A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy a piramis sejtréteg fontos szerepet játszik a memóriában. A piramis sejtréteg az agyban neuronális, főként a külső környezet érzékeléséért és a memória tárolásáért felelős.

A tanulás és a memória során a piramis sejtréteg felszabadít néhány neurotranszmittert, amelyek serkenthetik a neuronok közötti kommunikációt, ezáltal javítva a memória tárolását és előhívását. Emellett a piramis sejtréteg képes információkat szűrni és integrálni a tanulási és memóriafolyamatba, segítve az új ismeretek és készségek gyors elsajátítását.

A tanulmányok azt is kimutatták, hogy a piramis sejtréteg funkciója és egészsége nagy hatással van a memória teljesítményére. Ha a piramis sejtréteg megsérül vagy súlyosan igénybe veszi, a memória nagymértékben károsodhat. Ezért oda kell figyelnünk a piramis sejtréteg egészségére és karbantartására, hogy fenntartsuk a jó tanulási és memóriaképességeket.

A piramis sejtréteg egészségére és karbantartására vonatkozó ajánlások közé tartozik az étrend, a testmozgás és az alvás. Például a zsírsavakban és antioxidánsokban gazdag étrend elősegítheti a piramis sejtréteg egészségét; a rendszeres testmozgás fokozhatja az idegrendszer működését és ellenálló képességét; és a jó alvási szokások segíthetnek csökkenteni a piramissejtek rétegére nehezedő stresszt, és elősegítik a memória megszilárdulását és visszanyerését.

Röviden, a piramis sejtréteg fontos szerepet játszik a tanulásban és a memóriában. Figyelnünk kell a piramis sejtréteg egészségére és karbantartására, hogy javítsuk tanulási és memóriaképességünket.

Kattintson a Ismerje meg a rövid távú memória javításának módját

Ugyanakkor kerülni kell a túlzott fáradtságot és stresszt, biztosítani kell az agy számára a megfelelő pihenést és felépülési időt, valamint lehetővé kell tenni memóriánk folyamatos fejlesztését, tökéletesítését.

Látható, hogy javítanunk kell a memóriánkat. A Cistanche jelentősen javíthatja a memóriát, mert antioxidáns, gyulladáscsökkentő és öregedésgátló hatása van, ami segíthet csökkenteni az oxidációt és a gyulladásos reakciókat az agyban, ezáltal megóvva az idegrendszer egészségét. Ezen túlmenően, a Cistanche elősegítheti az idegsejtek növekedését és helyreállítását is, ezáltal javítva a neurális hálózat összekapcsolhatóságát és működését.

Ezek a hatások javíthatják a memóriát, a tanulási képességet és a gondolkodási sebességet, valamint megelőzhetik a kognitív diszfunkciók és a neurodegeneratív betegségek előfordulását.

3. ábra: A neuropatológiai léziók (HE), a PrPSc lerakódás, az asztrogliózis (GFAP) és a mikrogliózis (Iba1) megoszlása ​​négy különböző hippocampális régióban surlókórral fertőzött és kontroll juhokban: piramis sejtrétegek CornuAmmonis (CA) 1, 3 és 4 és a stratum lacunosum-moleculare (SLM).

A grafikonok szemikvantitatív értékelési értékeket mutatnak be minden elemzett paraméterhez. (A) Enyhe szivacsos elváltozásokat figyeltek meg minden vizsgált hippocampalis régióban. (B) Intraneuronális PrPSc mintázat (L42) a CA1-ben, CA3-ban és CA4-ben, és széles körben elterjedt finom szemcsés PrPSc mintázat az SLM-ben. (C) Fokozott Iba1-festődés a surlókórral fertőzött juhoknál, mint a kontroll juhoknál.

A nagyított képek a megfigyelt morfológiai különbségek egy részét mutatják. (D) Mérsékelt reaktív asztrogliózis jelei surlókórral fertőzött juhokban a kontrollokhoz képest. A pontszámok 0 (negatív) és 5 (maximális intenzitás) között mozognak.

A szignifikáns különbségeket a Student-féle t-próba, illetve a Mann–Whitney U-próba segítségével határoztuk meg normál, illetve nem normál eloszlású adatok esetén. * p < 0.05, ** p < 0,01. Skálasáv=200 µm.

A hippocampusban a spongiosis nagyon enyhe volt, és alkalmanként vakuolákat figyeltek meg a CA1, CA3 és CA4, valamint az SLM-ben (3A. ábra). Ez a korlátozott neuronális veszteség ellentétben állt a CA1 és CA3 ritka, de fokálisan intenzív PrPSc lerakódásával (3B. ábra).

Nagyon enyhe PrPSc festődés volt megfigyelhető a CA4-ben és az SLM-ben. Különleges PrPSc mintákat figyeltek meg ezeken az agyterületeken (S2 ábra). Míg a CA1-ben és CA3-ban az intraneuronális és a neuropil-asszociált PrPSc mintázatok domináltak, addig az SLM-ben az intragliális lerakódás volt a fő morfológiai mintázat.

Enyhe intraneuronális és neuropil-asszociált PrPSc mintázatok következetesen megfigyelhetők voltak a CA4-ben, bár az intenzitás alacsonyabb volt, mint a CA1-ben és CA3-ban. Az Iba1 konstitutívan expresszálódott és ritkán oszlott el a kontroll mintákban. Kontraszttal kifejezett mikrogliózist figyeltek meg a CA1-ben, CA3-ban és CA4-ben, valamint az SLM-t súrlókórral fertőzött birkákban.

A mikroglia morfológiai jellemzői azonban jelentősen eltértek ezen agyi régiók között. A CA1 piramisrétegben a legtöbb mikroglia sejt rövid folyamatokat mutatott, megnagyobbodott sejttestekkel, ami a hipertrófiás morfológiára jellemző.

A CA4-ben a mikroglia sejtek szintén hipertrófiások voltak, de hosszabb és vékonyabb ágakat mutattak, mint a CA1 mikroglia sejtek. Eközben az SLM-ben a hipertrófiás mikroglia rövid és vékony folyamatokat mutatott, duzzadt sejttestekkel. Ezzel szemben a CA3-ban a fent említett pálcika-mikroglia morfológiát figyeltük meg [42].

Ezeknek a mikroglia sejteknek megnyúlt sejttestei voltak, hosszú párhuzamos elsődleges folyamattal, amely merőleges a CA3 piramissejtek rétegére, és a mellékágakkal, amelyek rövidebbek voltak, mint a hosszú primer folyamatok.

A GFAP immunfestődés szignifikánsan megnövekedett a súrlókórral fertőzött, illetve a kontroll juhok CA1 és CA3 piramissejtek rétegében. Érdekes módon a PrPSc pontszám a CA1-ben és a CA3-ban volt a legmagasabb. Nem volt különbség a CA4 piramis sejtrétegben vagy az SLM-ben.

2.3. Scrapie-fertőzött tg338 egerek neuropatológiája

A juhoknál elemzett spongiosis, PrPSc-lerakódás, mikrogliózis és asztrogliózis neuropatológiai markereit vizsgáltuk klinikailag érintett tg338 egerek talamuszában, amelyeket intracerebrálisan fertőzöttek surlókórral (4. ábra).

A kontrollokhoz képest szignifikáns különbségeket (p < 0,05) figyeltek meg a spongiosisban a thalamusof scrapie-fertőzött egerekben, amelyekben a vakuolák a neuropilre korlátozódtak.

A PrPSc lerakódások széles körben eloszlottak a citoplazma és a neuropil szintjén. A gliózis vizsgálata szignifikáns különbségeket mutatott ki az Iba1 és GFAP immunfestésben a surlókórral fertőzött és a kontroll egerek között, mind az asztrociták, mind a mikroglia hipertrófiás morfológiát mutatott.

A PrPres-felhalmozódást WB-vel is értékelték minden surlókórral fertőzött egérben, ami állandó 19 kDa-os sávmintázatot mutatott ki (5. ábra). A PrPres jel intenzitása a tg338 egerekben homogénebb volt az egyedek között, mint a birkákban, amint az a kísérleti fertőzésnél várható volt, amelyben a dózist, az oltás korát és az elpusztítás idejét szabályozták.

A normál agyhomogenizátummal beoltott kontroll egerekben nem észleltünk jelet, ami nem ért egyet a negatív IHC eredménnyel.

4. ábra: Thalamus metszetek surlókórral fertőzött (intracerebrális oltás) és korban egyező tg338 kontroll egerekből, immunfestéssel a spongiosis (hematoxilin-eozin), a PrPSc lerakódás (R486 antitest), az asztrociták (glia fibrilláris savas fehérje; GFAP) és a mikroglia értékelésére. -kötőadapter molekula-1; (A, E) Súlyos szivacsos elváltozások, amelyek főként a surlókórral fertőzött, illetve a kontroll egerek neuropillében találhatók. (B, F) Számos PrPSc-pozitív neuron látható súrlókórral fertőzött egerekben, de hiányoznak a kontrollokból. (C, G) Intenzívebb immunfestést és vastagabb folyamatokat mutató aktivált mikroglia súrlókórral fertőzött egerekben a kontrollokhoz képest. (D, H) Fokozott asztrogliózis hipertrófiás sejttestekkel és folyamatokkal surlókórral fertőzött egerekben a kontrollokhoz képest. A pontszámok 0(negatív) és 5 (maximális intenzitás) között mozognak.

A szignifikáns különbségeket a Student-féle t-tesztor Mann–Whitney U teszttel határoztuk meg normál, illetve nem normális eloszlású adatokra. * p < 0.05,** p < 0,01. Skálasáv=200 µm.

5. ábra: A PrPres felhalmozódásának Western blot kimutatása a központi idegrendszerben olyan klinikailag érintett tg338 egerek esetében, amelyeket intracerebrálisan oltott be surlókórral, összehasonlítva a megfelelő kontrollokkal.

A megfelelő összehasonlítás érdekében ekvivalens fehérjemennyiségeket töltöttünk be, és immunblotokat futtattunk SHA31 monoklonális testtel. A molekulatömeg-markerek (kDa) az immunblot bal oldalán vannak feltüntetve.

A TLR expressziójának felszabályozásáról a Prpsc hatására korábban már beszámoltak kísérleti in vivo és in vitro körülmények között, ezért, miután jellemeztük a prionok által kiváltott fő neuropatológiai elváltozások jelenlétét a központi idegrendszerben természetes és kísérleti betegségek összefüggésében, megvizsgáltuk. hogy ezek a változások korrelálnak-e a TLR génexpresszió változásaival.

Ebből a célból qPCR-t végeztünk a juhok négy agyi régiójából származó minták felhasználásával, hogy felmérjük a MyD8g és a Trif expresszióját, a TLR jelátvitelben szerepet játszó két fő adapter fehérje; CD36, egy scavenger receptor, amely együttműködik a TLR-ekkel; és TLR mRNS.

Ezen kívül négy pro- és anti-szintet mértünk. gyulladásos citokinek a juhok talamuszában és hippokampuszában a gyulladásos válasz további értékelésére. Tg338 egerekben mértük a MyD88 és a TLR1-9 mRNS szintjét a talamuszban.

Azokat a géneket, amelyeknél szignifikáns különbségeket figyeltek meg a kontrollok és a megfelelő hajtásváltozások tekintetében, a $l. táblázat mutatja be, a kontroll és a surlókórral fertőzött juhok ACt értékeit pedig a $3.

A megváltozott gének száma caudalis-rostralis irányban csökkent. A surlókórral fertőzött birkák medulla oblongata volt az a régió, ahol a TLR génexpresszióban a legnagyobb változásokat figyelték meg (6. ábra). Ebben a régióban a TLR2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 és CD36 expressziója szignifikánsan magasabb volt (p < 0,01) a surlókórral fertőzött, mint a kontrollállatoknál.
A thalamusban a TLR6, a MyD88 és a CD36 szignifikánsan felszabályozott a scrapie-fertőzött csoportban (p < 0.05), míg a TLR2 és TLR3 a felszabályozás irányába mutatott (p < {{12} }.1). A frontális kéregben (a legrostralabb terület) a TLR4 és a CD36 voltak az egyetlen túlzottan expresszált gének (p < 0,05).

Figyelemre méltó, hogy a súrlókórral fertőzött birkák hippokampuszában kontrasztos expressziós mintákat találtak, ahol a TLR2 és a MyD88 leszabályozott (p < 0.01), a TLR1 pedig a downreguláció irányába mutatott (p < 0,1). .

Ezenkívül a hippocampus volt az egyetlen olyan terület, ahol a CD36 expressziója nem növekedett. Összességében a TLR4 volt az a gén, amely a legjobban szabályozott súrlókórral fertőzött és kontroll juhokban mind a négy agyi régióban, bár a thalamusban vagy a hippocampusban nem figyeltek meg szignifikáns különbséget az egyeden belüli variabilitás miatt.

A citokinszintek elemzése a TGF-, IL-10 és IL-6 túlzott expresszióját tárta fel a surlókórral fertőzött, illetve a kontroll juhok talamuszában, de a hippocampusban nem volt változás (7. ábra).

6. ábra: TLR 1-10, MyD88, Trif és CD36 génexpressziója a kontroll és surlókórral fertőzött juhok medulla oblongatájában (A), thalamusban (B), frontális kéregében (C) és hippocampusában (D) .

Az adatokat az átlagos szorzás ± SEM növekedés jelenti a kontroll juhokra vonatkozóan (1-es pontszámmal kifejezve). Az átlagos pontszámokat a Student-féle t-próbával vagy a Mann–Whitney U-próbával hasonlítottuk össze normál, illetve nem normális eloszlású adatok esetén. # p < 0.1, * p < 0.05, ** p < 0,01.

7. ábra: A TGF- és IL-10 gyulladásgátló citokinek, valamint a TNF- és IL-6 gyulladásgátló citokinek génexpressziója kontroll és természetes surlókór thalamusában (A) és hippocampusában (B) -fertőzött juhok.

Az adatokat a kontrollokra vonatkozó átlag ± SEM-szeres változásként ábrázoltuk (1-es pontszámként kifejezve). Az átlagpontszámokat a Student-féle t-teszt vagy a Mann–Whitney U-teszt segítségével hasonlítottuk össze normál, illetve nem normális eloszlású adatok esetén. * p < 0.

Annak vizsgálatára, hogy a központi idegrendszerben a TLR expressziójában bekövetkezett változások természetes betegségek esetén összevethetők-e a tg338 egérmodellben indukált változásokkal, intracerebrális scrapie fertőzés után, a TLR-ek és a MyD88 transzkripciós szintjét a thalamus oftg338 egerekben értékelték (8. ábra). A TLR1 és TLR2 mRNS szintje szignifikánsan megemelkedett (p < 0,01) a kontrollokhoz képest, és tendencia volt a TLR7 felszabályozására (p< 0.1). The levels of TLR8 expression were undetected.

8. ábra: TLR1-7, TLR9 és MyD88 génexpressziója súrlókór-pozitív oltóanyaggal intracerebrálisan beoltott, klinikailag érintett tg338 egerek thalamusában a kontrollokhoz képest (scrapie-negativeinoculum). Az eredményeket a kontrollokra vonatkozó átlag ± SEM-szeres változásként fejezzük ki (1-es pontszámként kifejezve). Az átlagpontszámokat a Student-féle t-próbával vagy a Mann–Whitney U-próbával hasonlítottuk össze rendre, illetve nem normális eloszlású adatokra. # p < {{10}},1, ** p < 0,01.

2.5. A TLR4 fehérjeszintek felmérése megerősíti a qPCR által kimutatott felszabályozást a surlókórral fertőzött juhokban

Annak igazolására, hogy a TLR4 mRNS megfigyelt növekedése a fehérjeszint változását jelenti, a TLR4-et WB-vel értékelték négy súrlókórral fertőzött birka és négy kontroll bárány medulla oblongata, thalamus, hippocampus és frontális kéregben (9. ábra).

A qPCR eredményekkel összhangban a TLR4 fehérje szintje szignifikánsan megemelkedett (p < 0,05) a surlókórral fertőzött birkák mind a négy agyi régiójában.

9. ábra: A TLR4 fehérje expressziója a súrlókórral fertőzött juhok medulla oblongatájában (Mo), thalamusban (Th), hippocampusban (Hc) és frontális kéregben (Fc) a kontroll juhokkal szemben (n=4 csoportonként). -aktint használtak terhelési kontrollként.

A grafikon a denzitometriás értékeket ábrázolja, és a TLR4 expressziójának szignifikáns növekedését jelzi a surlókórral fertőzött juhok minden régiójában a kontrollhoz képest. Az adatokat témában ± SEM-ben fejezzük ki. Az átlagos pontszámokat Student-féle t-próbával hasonlítottuk össze. * p < 0.05.

3. Megbeszélés

Az elmúlt években a prionbetegségek neurogyulladásos válaszának vizsgálata a mögöttes mechanizmusok és következmények jobb megértését eredményezte.

Az ideggyulladás reaktív mikrogliózist és asztrogliózist [43] foglal magában, mindkettő a klinikai tünetek megjelenése előtt észlelhető, és megelőzi a spongiózist és az idegsejtek elvesztését [7, 8, 18].

Továbbra is vita tárgya, hogy a mikroglia aktiválása prionbetegségekben előnyös vagy káros. Egyes szerzők azzal érvelnek, hogy a mikroglia aktivációja és proliferációja hozzájárul a neuroinflammatorikus folyamatokhoz és ennek következtében a neurodegenerációhoz [8,18,44].

Mások azonban rámutatnak a mikroglia általános védő szerepére, és in vitro vizsgálatok azt mutatják, hogy a mikroglia képes internalizálni és lebontani a PrPSc-t [27,45]. Ezekkel az eredményekkel összhangban az in vivo kísérletek kimutatták, hogy a mikroglia kimerülése csökkenti a túlélési periódust, valószínűleg a PrPSc-clearance csökkenése miatt [46,47].

Ezért valószínű, hogy a betegség folyamata során több reaktív mikroglia fenotípus létezik, amelyek neuroprotektív hatást fejtenek ki a betegség korai stádiumaiban, és a betegség előrehaladtával átadják helyét egy proinflammatorikus fenotípusnak, amely káros hatásokat vált ki [9,10]. Az egyik hipotézis azt sugallja, hogy a TLR jelátvitel közvetíti a gliasejtek aktivációját prionbetegségekben.

Ismeretes, hogy Alzheimer-kórban az amiloid rostok mikroglia felvételét elősegíti a TLR aktiválása [48,49]. Így, míg a TLR-ek gliasejteken történő aktiválása szerepet játszhat az aggregált vagy abnormális fehérjék (pl. prionfehérje) kiürülésében, a krónikus aktiváció káros lehet a gazdaszervezetre nézve, ami neurotoxicitást és neuronális sejthalált eredményezhet [50].

A TLR-ek prionpatogenezisben betöltött szerepére vonatkozó adatok jelenleg nagyon korlátozottak. Kevés tanulmány mérte a TLR-expresszió változását a központi idegrendszerben egérmodellekben, egy pedig a bárányvérben a TLR-expresszió változásáról számolt be, minden esetben prionbetegséggel kísérletileg fertőzött állatokkal [22,26,30].

For more information:1950477648nn@gmail.com