Cisztanche: Az echinakozid elnyomja a hasnyálmirigy-adenokarcinóma sejtnövekedést azáltal, hogy a mitogén által aktivált protein kináz útvonalon keresztül apoptózist indukál

Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

WEI WANG, JINBIN LUO, YINGHUI LIANG és XINFENG LI

Absztrakt.

A hagyományos kínai orvoslásból származó természetes termékek klinikai alkalmazása a rák kemoterápiájában kapott figyelmet.Echinakozid(ECH), az egyik feniletanoid, amelyet a szárából izolálnakCistanche(kínai gyógynövény) szövetvédő és anti-apoptotikus hatást fejt ki a központi idegrendszerre. Azonban továbbra is nagyrészt megfoghatatlan, hogy az ECH rendelkezik-e tumorszuppresszív aktivitással. Jelen tanulmányban kimutatták, hogy az ECH jelentősen gátolja a hasnyálmirigy adenokarcinóma sejtek proliferációját azáltal, hogy indukálja a reaktív oxigénfajták termelődését és a mitokondriális membránpotenciál zavarát, és ezáltal apoptózist vált ki. Továbbá kiderült, hogy az ECH(Echinakozid)gátolja a tumorsejtek növekedését a MAPK aktivitás modulálásával. Összefoglalva, ez a tanulmány feltárja az ECH(Echinakozid) a rák kialakulásának megelőzésében, és arra utal, hogy az ECH alkalmazása potenciális kemoterápiás stratégia lehet a rák kezelésére.

Bevezetés

A p53 tumorszuppresszor útvonal a tumorszuppresszor, az ARF indukcióján keresztül mérsékli az onkogén E3-ligáz egér double minute (MDM)2- által közvetített p53 degradációt (3). Ez egy automatikusan szabályozott, önvédő mechanizmus, amely megakadályozza a sejtek rosszindulatú átalakulását. Nevezetesen, a p53 képes elnyomni a Myc aktivitást azáltal, hogy transzkripciósan aktiválja például a miR{8}}-t, amely megcélozzaMycmRNS transzlációcsendesítéshez (4,5), így negatív visszacsatolású szabályozó hurkot képez.

A rák kezelésének legegyszerűbb és leghatékonyabb stratégiája a rákos sejtek elpusztítása. Az általánosan használt rákellenes szerek, mint például a ciszplatin (6), az aktinomicin D (7) és az adriamicin (8) kimutatták, hogy gátolják a tumor növekedését az apoptózis elősegítésével. A közelmúltban egyre több bizonyíték támasztja alá, hogy számos természetes termék és növényi származék, különösen a hagyományos kínai gyógyászatban (TCM) használt gyógynövényekből, tumorszuppresszív funkciót mutat a rákos sejtek apoptózisának indukálásával, és klinikai alkalmazási lehetőségekkel rendelkezik. a rákterápiában (9). Például a természetes antrakinon emodint számos rákos sejttípusból izolálják (10, 11). A kamptotecin a kínai „boldogfából” származik,Camptotheca kihegyesedő, értékes természetes termék, amely gátolja a DNS ligálását a topo I által közvetített szálszakadást követően (12). Egy másik, összesen 729 előrehaladott emlőrákban szenvedő beteg bevonásával végzett retrospektív populációs kohorsz vizsgálatban azt javasolták, hogy a TCM-terápia hozzájárulhat a rák kezeléséhez. Ebből a csoportból 115 beteg volt TCM-használó, míg 614 beteg nem használt TCM-et. A többváltozós elemzés kimutatta, hogy a nem használókkal összehasonlítva a TCM használata jelentősen csökkentette a bármilyen okból bekövetkező halálozás kockázatát (13). Az összes fent említett megállapítás arra utal, hogy a TCM fontos kiegészítő és alternatív gyógyszer, amely felhasználható a rák kezelésében.

akut tüdőkárosodásban szenvedő egerek (16, 17). Valamint az ECH(Echinakozid)kimutatták, hogy védő hatást fejt ki az idegszövetre, és javítja a viselkedési zavarokat a Parkinson-kór egérmodelljeiben (18). Nevezetesen azt találták, hogy az ECH elősegíti a sejtproliferációt és gátolja az apoptózist az egér bélhám MODE-K sejtjeiben (19). Mindeddig azonban kevesebb figyelmet fordítottak az ECH rákmegelőzésben betöltött lehetséges szerepére.

Ebben a tanulmányban azt vizsgálták, hogy az ECH-kezelés befolyásolja-e a tumorsejtek növekedését és proliferációját, és hogy az ECH-e(Echinakozid)apoptózist indukál, növeli a reaktív oxigénfajták (ROS) termelését és csökkenti a mitokondriális membránpotenciált (MMP), következésképpen gátolja a tumorsejtek növekedését. Ezen túlmenően jelen tanulmány célja az ECH által közvetített sejtnövekedés gátlásáért felelős molekuláris mechanizmusok azonosítása volt.

Anyagok és mód

Sejt vonal, reagens, és antitestek.Az SW1990 hasnyálmirigy-adenokarcinóma sejteket (ATCC, Manassas, VA, USA) Dulbecco módosított Eagle táptalajban tenyésztettük 10% magzati szarvasmarha szérummal, 50 U/ml penicillinnel és 0,1 mg/ml sztreptomicinnel 37 ˚C-on. 5 százalék CO2 párásított légkör. ECH(Echinakozid)a Jrdun Biotechnology Corp.-tól (Sanghaj, Kína) vásárolták. Az AKT, P-AKT, ERK, P-ERK, JNK, p-JNK, P38, p-P38 és GAPDH elleni antitesteket a Cell Signaling Technology-tól (Danvers, MA, USA) vásároltuk; az anti-Bax és az anti-Bcl{8}} a Santa Cruz Biotechnology Inc.-től (Santa Cruz, CA, USA) vásárolt; és az anti-Caspase{10}} az Abcam-tól (Sanghaj, Kína) vásárolt.

Sejt életképességétpróba. A tumorsejtek növekedési ütemének felmérésére Cell Counting kit{{0}} (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, USA) használtuk a gyártó utasításainak megfelelően. A sejtszuszpenziókat üregenként 5,000 sejt mennyiségben oltottuk be ECH kezeléssel 0, 12, 24, 48 vagy 72 órán keresztül 96 -lyukú tenyésztőlemezekre. A sejtnövekedés gátlását úgy határoztuk meg, hogy a CCK-8 készletből 10 százalékos végső koncentrációban WST{10}} reagenst adtunk minden egyes lyukhoz, és a minták abszorbanciáját 450 nm-en mértük mikrolemez-leolvasóval (Multiskan MK3; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA).

Hoechst 33342 festés.A sejteket (60 százalékos összefolyás) Hoechst 33342-vel (Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, Kína) kezeltük 1 nm végkoncentrációban.µg/ml, 37 °C-os inkubátorban 15 percig inkubáltuk, foszfáttal pufferolt sóoldattal kétszer mostuk, 4 százalékos paraformaldehidben 30 percig szobahőmérsékleten rögzítettük, majd tárgylemezekre rögzítettük. A sejtmagok morfológiai változásait fluoreszcens mikroszkóp alatt (Olympus BX51, Melville, NY, USA) figyeltük meg. A normál magok kerekek voltak és világoskékre festettek, míg az apoptotikus sejtmagok összezsugorodtak és élénkkékre festettek.

Fluoreszcencia aktiválva sejt válogató (FACS) elemzések.Az apoptózis értékelésére a fluoreszcein-izotiocianát (FITC)-Annexin V Apoptosis Detection készletet (BD Biosciences, Shanghai, Kína) használtuk a gyártó utasításai szerint. Röviden, 5x1{4}}4 sejtet jéghideg PBS-sel mostunk, 0,1 ml kötőpufferben (Beyotime Institute of Biotechnology) újraszuszpendáltunk, és 10 ml FITC-konjugált Annexin V-vel (10 mg/ml) és 10 nm. ml propidium-jodid (PI) (50 mg/ml). Sötétben, szobahőmérsékleten 15 percig tartó inkubálás és 400 ml kötőpuffer hozzáadása után a sejteket áramlási citométerrel (C6; BD Biosciences, Shanghai, Kína) analizáltuk.

Mérés nak,-nek reaktív oxigén faj (ROS).A ROS termelésének értékeléséhez a Reactive Oxygen Species Assay készletet (Vigorous Biotechnology, Peking, Kína) használtuk a gyártó utasításai szerint. Röviden, a sejteket (80 százalékos összefolyás) összegyűjtöttük, és PBS-sel mostuk, mielőtt a dihidroetidium (DHE) oldattal megfestettük (Beyotime Institute of Biotechnology). A sejteket ezután áramlási citometriás analízissel elemeztük.

Mérés nak,-nek mitokondriális membrán lehetséges (MMP).

Az MMP változásainak kimutatására tetrametil-rodamin-metil-észter (TMRM) Assay kit (ImmunoChemistry Technologies, Bloomington, MN, USA) használtunk. Röviden, a sejteket (80 százalékos összefolyás) összegyűjtöttük, PBS-sel mostuk, és TMRM-mel festettük 15-20 percig 37 °C-os inkubátorban. A sejteket ezután egyszer mostuk PBS-sel, és áramlási citometriás analízisnek vetettük alá.

Immunblot vizsgálatelemzések. A sejteket (8% konfluencia) összegyűjtöttük és RIPA pufferben (Jrdun Biotechnology) lizáltuk, amely 50 mM Tris-HCl-t tartalmazott, pH 7,4; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1% nátrium-dezoxikólsav és 0,1% SDS és frissen hozzáadott proteaszóma inhibitorok. Az előzőekben leírtak szerint (20) azonos mennyiségű tiszta sejtlizátumot használtunk az immunblot analízishez.

Statisztikai elemzés.A mennyiségi adatokat átlag ± szórásként fejezzük ki. A statisztikai különbségeket nem párosított Student-féle t-teszttel értékeltük ki statisztikai SPSS 15.0 szoftver segítségével. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Eredmények

ECH (Echinakozid)elnyomja tumor sejtnövekedés. Bár arról számoltak be, hogy az ECH(Echinakozid)védő szerepet tölt be azáltal, hogy gátolja az apoptózist és a gyulladásos jeleket a szomatikus sejtekben, például a neuronális és bélhámsejtekben (16-19), továbbra is megfoghatatlan, hogy az ECH szabályozza-e a rákos sejtek növekedését és proliferációját. Ennek tesztelésére egy sejttúlélési vizsgálatot végeztek, oly módon, hogy a II. fokozatú hasnyálmirigy-adenokarcinómából származó SW1990 sejteket titrált ECH-dózisokkal kezelték, amint az az 1. ábrán látható. Nevezetesen, bebizonyosodott, hogy az ECH szignifikánsan késlelteti a tumorsejtek proliferációját egy dózisban. -függő módon egy 5-napos tenyésztési időszakban (1. ábra).ECH kiváltókapoptózis. Mivel az apoptózis elvesztése a hasnyálmirigyráksejtek ellenőrizetlen proliferációjának hátterében álló egyik fő ok-okozati mechanizmus (21), a jelen tanulmány kísérleteket végzett annak meghatározására, hogy az ECH kiváltja-e az apoptózist. Először is, a tumorsejtek magjainak Hoechst 33342-vel való megfestésével kimutatták, hogy az ECH dózisfüggő módon apoptózist eredményez (2A. ábra). Ezenkívül FACS-elemzéseket végeztünk Annexin V/PI festéssel, hogy tovább erősítsük a ty ECH apoptotikus hatását (2B. ábra). Az apoptotikus sejtek átlagos százalékos aránya 1,1 százalék volt normál tenyésztési körülmények között, míg ez a százalék szignifikánsan 10,6, 21,4 és 51,3 százalékra nőtt az ECH-kezelés hatására dózisfüggő módon (2C. ábra). Ezek az eredmények az 1. ábrán bemutatott sejtéletképességi vizsgálattal együtt azt mutatják, hogy az ECH-kezelés apoptózis kiváltásával elnyomja a tumorsejtek proliferációját.

A DNS-sel interkalálódó etidium generálását ebben a vizsgálatban használtuk a ROS termelés értékelésére. Megállapítást nyert, hogy más rákellenes gyógyszerekhez hasonlóan az ECH is dózisfüggő módon serkenti a ROS-termelést, amint azt az ECH-kezelés hatására megnövekedett fluoreszcencia intenzitás mutatja (3. ábra).

ECH (Echinakozid)csökkenti MMP.Kimutatták, hogy a mitokondriális diszfunkció szerepet játszik az apoptózis kiváltásában. Kimutatták, hogy a mitokondriális permeabilitás átmeneti pórusának megnyílása a transzmembrán potenciál depolarizációját és pro-apoptotikus faktorok felszabadulását idézi elő (23). Ezért megvizsgálták, hogy az ECH indukálhat-e MMP veszteséget a tumorsejtekben egy TMRM vizsgálat elvégzésével, amely egy jól bevált megközelítés, mivel a TMRM fluoreszcencia intenzitása arányos a membránpotenciáljával. Kimutatták, hogy az ECH-kezelés dózisfüggő módon szignifikánsan csökkenti az MMP-t (4. ábra).ECH vezérlők tumor sejt növekedés keresztül mitogén által aktivált fehérjeVizsgálták az ECH által közvetített tumorsejthalál molekuláris alapjait, számos olyan létfontosságú jelátviteli útvonal, mint a MAPK és az AKT (24,25), aktivitását, amelyek szabályozzák a sejttúlélést és -elhalást. A MAPK-k evolúciósan konzervált, prolin által irányított Ser/Thr protein kinázok, beleértve az extracelluláris szignál által szabályozott kinázokat (ERK), a c-Jun NH2- terminális kinázt (JNK) és a p38 család tagjait, amelyek három sejten keresztül aktiválódnak. szint kináz jelátviteli kaszkádok (26, 27). Ebben a vizsgálatban a MAPK-k és AKT-k expresszióját, valamint ezek aktivált foszforilált formáit vizsgáltuk, és kiderült, hogy az ECH jelentősen elnyomja a JNK és ERK1/2 aktivitást, de fokozza a p38 aktivitást (5. ábra). Nevezetesen kimutatták, hogy az AKT-aktivitást, amely szintén kritikus fontosságú a sejtproliferáció szempontjából, nem befolyásolja az ECH-kezelés (5. ábra). Ezenkívül kimutatták, hogy az ECH-kezelés növeli a Bax és a Caspase{16}} expresszióját, miközben csökkenti a Bcl-2 expresszióját (5. ábra), ami összhangban van a 2. ábrával. Így az eredmények azt mutatják, hogy Az ECH a MAPK útvonalon keresztül tumorsejt apoptózist vált ki.

Vita

Legjobb tudomásunk szerint ez az első olyan vizsgálat, amely kimutatta, hogy az ECH tumorszuppresszív funkcióval rendelkezik azáltal, hogy apoptózist vált ki (2. ábra), elősegíti a ROS termelést (3. ábra) és indukálja a mitokondriális membránpotenciál depolarizációját (4. ábra). , következésképpen a tumorsejtek növekedésének gátlásához vezet (1. ábra). Továbbá kimutatták, hogy az ECH által közvetített tumorsejt-halál molekuláris alapja a MAPK jelátviteli útvonalak szabályozása révén következik be (5. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az ECH új funkciója van a daganatképződés megelőzésében, és így azt sugallják, hogy a rákterápia jelöltje lehet.

A rákellenes gyógyszerek többsége tumorsejt apoptózist, öregedést és/vagy sejtciklus leállást válthat ki, ami a tumorsejtek növekedésének és proliferációjának gátlásához vezet. A sejtciklus leállása egy sejtválasz enyhe stresszjelekre, amelyek lehetővé teszik a sejtek számára, hogy helyrehozzák a sérült DNS-t a replikatív DNS-szintézis vagy mitózis megkezdése előtt, míg az apoptózis és az öregedés (permanens sejtciklus-leállás) olyan stresszjelekre reagálva következik be, amelyek megszüntetik a helyrehozhatatlan vagy rosszindulatú sejteket. 28,29). Ezért ebben a vizsgálatban csak az ECH tumorsejtekre gyakorolt ​​apoptotikus hatását értékelték, mivel a rákos sejtek elpusztítása a rákellenes szerek hatékonyságának értékelésének fő kritériuma. Nevezetesen kimutatták, hogy az ECH indukálja aBax(5. ábra), egy pro-apoptotikus gén, amelyet a p53 tumorszuppresszor transzkripciósan aktivál (30). Ezért érdemes megvizsgálni, hogy az ECH képes-e aktiválni a p53 jelátviteli útvonalat. Ha igen, az ECH p53-függő sejtciklus-leállást, öregedést, apoptózist vagy autofágiát is kiválthat. Ebben a vizsgálatban az ECH tumorszuppresszív funkcióját vizsgálták az SW1990 hasnyálmirigy-adenokarcinóma sejtvonalban. Azonban további vizsgálatokra van szükség több hasnyálmirigyrák sejtvonal megfigyelésére. Kimutatták, hogy a RAS onkogén fehérje és a p53 tumorszuppresszor mutációi összefüggenek a hasnyálmirigyrák kialakulásával (31); azonban az SW1990 sejtvonal nem tartalmaz p53 mutációt az IARC p53 adatbázisa szerint (http://p53.iarc.fr/CellLines.aspx). Ezért fontos megvizsgálni, hogy az ECH befolyásolhatja-e más hasnyálmirigyrák-sejtvonalak növekedését és proliferációját, amelyek különböző p53 mutációkkal rendelkeznek. Ezenkívül érdekes lenne meghatározni, hogy az ECH képes-e elősegíteni az apoptózist és gátolni más típusú daganatok növekedését.

Az ECH-kezelés által okozott ROS-emelkedés és MMP-csökkenés alapvető fontosságúnak bizonyult az apoptózis indukciójában (22). Ezenkívül azt találták, hogy a ROS indukálhatja a mitokondriális pórusok oxidációját, hozzájárulva a citokróm felszabadulásáhozc, az apoptózis közbenső terméke, az MMP megzavarása miatt (22). Így még meg kell határozni, hogy az ECH megzavarja-e az MMP-t közvetetten a ROS indukcióján keresztül. Ezenkívül kimutatták, hogy a ROS által kiváltott oxidatív stressz számtalan sejtnövekedést szabályozó szignál, köztük a p53, NF-κB, HIF és PI3K modulálásában is szerepet játszik (32). Azt még meg kell határozni, hogy az ECH szabályozza-e ezeket a fontos jelátviteli útvonalakat, és ha igen, hogyan. Nevezetesen, az oxidatív stressz különböző neurodegeneratív betegségeket okoz a magas oxigénfogyasztás, a gyenge antioxidáns rendszer és a központi idegrendszer terminális differenciálódási jellemzői miatt (33). Számos tanulmány azonban kimutatta, hogy az ECH védő és anti-apoptotikus hatással bír az idegszövetre. Ebben a tekintetben ésszerű feltételezni, hogy az ECH csökkentheti a ROS termelést a terminálisan differenciált idegsejtekben. Ezért azt is meg kell határozni, hogy a ROS termelés ECH általi szabályozása függ-e a sejt differenciálódási állapotától. Ezért a jelen eredmények és más tanulmányok azt mutatják, hogy az ECH, a széles körben használt TCM, nemcsak a neurodegeneratív betegségek, hanem a rosszindulatú karcinómák kezelésében is fontos kemoterápiás stratégia lehet.

Az utóbbi időben a TCM alkalmazása a rákterápiában egyre nagyobb figyelmet kapott. A TCM-ben használt gyógynövényekből készült természetes termékekben rejlő lehetőségeket a tudományos közösség még a nyugati világban is felismerte (9). Erőfeszítésekre van szükség e természetes termékek mögött meghúzódó hatásmechanizmusok tisztázása érdekében, ami végül hatékony és biztonságos rákterápiás gyógyszerek kifejlesztéséhez vezethet.

Összefoglalva, a jelen tanulmány bemutatta az ECH tumorgátló funkcióját, és kidolgozza az ECH által közvetített tumorszuppresszió molekuláris alapjait is, így utalva az ECH lehetséges klinikai alkalmazására a rákterápiában.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a tanulmányt az FMU Tudományos Kutatási Kulcsprogramja (09ZD014 sz. támogatás) finanszírozta és támogatta. A szerzők köszönetet mondanak a Biomedworldnek (Sanghaj, Kína) a kézirat szerkesztésében nyújtott segítségért.

Hivatkozások

1. Hanahan D és Weinberg RA: A rák jellemzői: A következő generáció. 144. cella: 646-674, 2011.

2. Alderton GK: Transzkripció: A MYC transzkripciós hatásai. Nat Rev Cancer 14: 513, 2014.

3. Zindy F, Eischen CM, Randle DH, Kamijo T, Cleveland JL, Sherr CJ és Roussel MF: Az ARF tumorszuppresszoron keresztüli Myc jelátvitel szabályozza a p53-dependens apoptózist és az immortalizációt. Genes Dev 12: 2424-2433, 1998.

4. Sachdeva M, Zhu S, Wu F, Wu H, Walia V, Kumar S, Elble R, Watabe K és Mo YY: a p53 elnyomja a c-Myc-et a miR-145 tumorszuppresszor indukciójával. Proc Natl Acad Sci USA 106: 3207-3212, 2009.

5. Liao JM, Cao B, Zhou X és Lu H: Új betekintés a p53 funkcióiba a megcélzott mikroRNS-eken keresztül. J Mol Cell Biol 6: 206-213, 2014.

6. Zamble DB és Lippard SJ: Ciszplatin és DNS-javítás a rák kemoterápiájában. Trends Biochem Sci 20: 435-439, 1995.

7. Kleeff J, Kornmann M, Sawhney H és Korc M: Az Actinomycin D apoptózist indukál és gátolja a hasnyálmirigyráksejtek növekedését. Int J Cancer 86: 399-407, 2000.

8. Tacar O, Sriamornsak P és Dass CR: Doxorubicin: Frissítés a rákellenes molekuláris hatásról, a toxicitásról és az új gyógyszeradagoló rendszerekről. J Pharm Pharmacol 65: 157-170, 2013.

9. Efferth T, Li PC, Konkimalla VS és Kaina B: A hagyományos kínai orvoslástól a racionális rákterápiáig. Trends Mol Med 13: 353-361, 2007.