1. rész: Az echinakozid gátolja a glutamát felszabadulását azáltal, hogy elnyomja a feszültségfüggő Ca2 plusz belépést és a protein kináz C patkány agykérgi idegvégződéseiben

Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Cheng Wei Lu 1,2, Tzu Yu Lin 1,2, Shu Kuei Huang 1 és Su Jane Wang 3,*

Absztrakt:

A glutamáterg rendszer részt vehet a neuroprotektáns terápiák hatásaiban.Echinakozid, a kínai gyógynövényből kivont feniletanoid glikozidHerba Cistanche, neuroprotektív hatása van. Ez a tanulmány a hatását vizsgáltaechinakozidaz 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulásról patkány agykérgi idegvégződésekben (szinaptoszómákban). Az echinakozid koncentrációfüggő módon gátolta a Ca2 plus -függő, de nem Ca2 plus -független, 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulását. Az echinakozid csökkentette a citoplazma szabad Ca2 plusz koncentrációjának 4-aminopiridin által kiváltott növekedését is, de nem változtatta meg a szinaptoszómális membránpotenciált. Az echinakozid 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulást gátló hatását az o-conotoxin MVIIC, a Cav2.2 (N-típusú) és Cav2.1 (P/Q-típusú) csatornák széles spektrumú blokkolója akadályozta meg. , de érzéketlen volt az intracelluláris Ca2 plusz felszabadulást gátló dantrolénre és a 7-klór-5-(2-klórfenil)-1,5-dihidro-4 ,1-benzodiazepin-2(3H)-on (CGP37157). Továbbá az echinacoside csökkentette a protein-kináz C 4-aminopiridin által kiváltott foszforilációját, a protein-kináz C-gátlók pedig megszüntették az echinacoside glutamát felszabadulásra gyakorolt ​​hatását. Ezen eredmények alapján azt sugalljuk, hogy az echinakozid gátló hatása a kiváltott glutamát felszabadulásra a feszültségfüggő Ca2 plusz csökkentett bejutással és a protein kináz C aktivitás ezt követő elnyomásával függ össze.

Kulcsszavak:echinakozid; glutamát felszabadulás; agykérgi idegvégződések; feszültségfüggő Ca2 plus csatornák; protein kináz C

1. Bemutatkozás

Echinakozidegy fő fenil-etanol-glikozid, amely jelen vanHerbaCistanche, egy jól ismert hagyományos kínai orvoslás, amelyet a feledékenység, az impotencia és a krónikus székrekedés kezelésére használnak [1].Echinakozidkülönféle bioaktivitásokkal rendelkezik, mint például antioxidáns, gyulladásgátló, rákellenes, májvédő és immunmoduláló [2–4]. Nevezetesen, az echinakozid neuroprotektív hatással rendelkezik; Például védelmet nyújthat az oxidatív stressz vagy a neurotoxin által kiváltott neurotoxicitás ellen primer patkánykérgi neuronokban, humán neuroblasztóma SH-SY5Y sejtekben és pheochromocytoma (PC12) sejtekben [5–8]. Ezenkívül az echinakozid enyhíti az agykárosodást és javítja a kognitív funkciókat a Parkinson-kór, az Alzheimer-kór és a középső agyi artéria elzáródása esetén [9–12]. Azonban a mechanizmus, amelyen keresztülechinakozidneuroprotekciót indukál, nem teljesen ismert.

A neuroprotekció egy összetett folyamat az idegsejtek szerkezetének és funkcióinak megőrzésére toxikus sértések esetén. A glutamát excitotoxicitás csökkentését az agy neuroprotekciójában szerepet játszó potenciális mechanizmusnak tekintik. A glutamát, egy serkentő aminosav neurotranszmitter, számos agyi funkcióban döntő szerepet játszik [13]. Azonban a glutamát receptorok túlaktiválása magas glutamátkoncentráció mellett intracelluláris Ca2 plusz túlterhelést, mitokondriális diszfunkciót, szabadgyök-termelést és neuronhalált okoz [14,15]. Ez a kóros folyamat számos agyi rendellenességben szerepet játszik, beleértve az agyi ischaemiát, a traumás agysérülést, az epilepsziát és a neurodegeneratív betegségeket [16,17]. Ezért a patofiziológiás glutamáterg transzmissziót blokkoló inhibitorok potenciális neuroprotektív gyógyszereknek tekinthetők. Figyelemre méltó példák ezekre a glutamát receptor antagonisták [18,19]; azonban ezekkel a gyógyszerekkel végzett klinikai vizsgálatok kudarcot vallottak a kisebb hatékonyság és a nemkívánatos, sőt citotoxikus mellékhatások miatt [20,21]. A közvetlen glutamát receptor blokád mellett a glutamát felszabadulás gátlása hatékony stratégia lehet a neuroprotekcióban. Számos neuroprotektáns (pl. memantin és riluzol) csökkentheti a glutamát felszabadulását patkány agyszövetekben [22–24].

Figyelembe véve a glutamát szerepét az excitotoxicitásban és az echinakozid neuroprotektív profilját, a jelen tanulmány a patkány agykéregből megtisztított izolált idegvégződéseket (szinaptoszómákat) használta az echinakozid glutamát felszabadulásra gyakorolt ​​hatásának vizsgálatára, és további lehetséges mechanizmusok feltárására. Az izolált idegvégződési készítmény jól bevált modell a neurotranszmitterek gyógyszerek általi felszabadulásának preszinaptikus szabályozásának tanulmányozására posztszinaptikus hatások hiányában [25]. Ezzel a modellel értékeltük az echinacoside hatását a glutamát felszabadulásra, a membránpotenciálra, a preszinaptikus Ca2 plus beáramlásra és a protein kináz C aktivitásra. Szakirodalmi áttekintésünk szerint ez az első jelentés, amely dokumentálja azt a mechanizmust, amelyen keresztül az echinakozid gátolja az endogén glutamát felszabadulását preszinaptikus szinten.

2. Eredmények

2.1. EchinakozidGátolja az 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulását a patkány agykéreg idegvégződéseiből a vesicularis exocitózis csökkentésével

Az 1. ábra szemlélteti az echinakozid koncentrációtól függő hatását az 4-aminopiridin által kiváltott glutamát-felszabadulásra patkányok tisztított agykérgi szinaptoszómáiból. Az 1 mM CaCl2-vel inkubált szinaptoszómákban az 1 mM 4-aminopiridin 7,4 ± {{1{{20}}},1 nmol/mg/5 perc glutamát-felszabadulást váltott ki, ami csökkent 1, 5, 10, 30 és 50 uM echinakoziddal 6,5 ± 0,2, 5,8 ± 0,3, 4,8 ± 0,2 értékre,

4,1 ± 0,1 vagy 2,3 ± 0,4 nmol/mg/5 perc (F(5,24)=67.1, p=0). 000). Az 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulás echinakozid által közvetített gátlásának dózis-válasz görbéből származtatott IC50 értéke 24 uM volt. Ezenkívül az 1 mM 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulás 300 uM etilénglikol-bisz(-amino-etil-éter)-N,N,N/,N/-tetraecetsavat (EGTA) tartalmazó extracelluláris Ca2 plusz-mentes oldatban 2 volt.{30}}.2 nmol/mg/5 perc (F(2,12)=310.65, p=0.000),

és az 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulásnak ezt a Ca2 plusztól független komponensét nem befolyásolta 20 uM echinakozid (1,8 ± 0,2 nmol/mg/5 perc; p {{1) 0}}.58; 1. ábra). A 0,1 uM bafilomycin A1-gyel, vezikuláris transzporter inhibitorral [26] kezelt szinaptoszómákban az 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulás jelentősen csökkent (2,2 ± 0,2 nmol/mg/ 5 perc F (2,12)=249,518, p=0.000). Bafilomycin A1 jelenlétében 20 uM echinakozid nem gátolta jelentősen a glutamát felszabadulását (2,1 ± 0,2 nmol/mg/5 perc; p=0,94; 1. ábra). Ezzel szemben 10 uM DL-treo-béta-benzil-oxiaszpartát (DL-TBOA, glutamát újrafelvétel-gátló) [27] 11,8 ± 0,4 nmol/mg/5 percre növelte az 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulást. t(8)=-11.31, p=0.000). A 20 uM echinakozid még DL-TBOA jelenlétében is jelentősen gátolta az 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulását (7,7 ± 0,2 nmol/mg/5 perc; F(2,12)=87.23, p=0.000; 1. ábra).

2.2 Az echinakozid csökkenti a citoszol Ca2 plusz koncentrációt, de nem változtatja meg a szinaptoszómális membrán potenciált

Az 1 mM 4-aminopiridin okozta szinaptoszóma-depolarizáció növelte a Ca2 plusz koncentrációt (p=0.000; 1. táblázat). A 20 uM echinakozid alkalmazása nem befolyásolta szignifikánsan az alap Ca2 plusz koncentrációt (t(8)=0.06, p=0.95), de jelentősen csökkentette az 4-aminopiridin által kiváltott növekedést Ca2 plusz koncentráció (t(10)=6.16, p=0.000). Ezenkívül 1 mM 4-aminopiridin nőtt a 3',3',3'-dipropil-tiadikarbocianin-jodid [DiSC3(5)] fluoreszcenciájában (p=0.000). 20 uM echinakozid hozzáadása nem változtatta meg a nyugalmi membránpotenciált (t(8)=0.976, p=0.36), és nem változtatta meg jelentősen a DiSC3 4-aminopiridin által közvetített növekedését (5) Fluoreszcencia (t(8)=-0.014, p=0.99; 1. táblázat).

2.3 A Cav2.2 (N-típusú) és Cav2.1 (P/Q-típusú) csatornákon keresztüli csökkent Ca2 plusz beáramlás összefüggésbe hozható az 4-aminopiridin által kiváltott glutamát echinakozid általi felszabadulás gátlásával

A 2. ábra azt mutatja, hogy 2 uM o-conotoxin MVIIC, egy N- és P/Q-típusú Ca2 plusz csatorna blokkoló, csökkentette az 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulást 7,4 ± {{10}} értékről. 2-2.0 ± 0,1 nmol/mg/5 perc (t(9)=25.35, p=0.000). Az o-konotoxin MVIIC jelenlétében 20 uM echinakozid hatása az 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulásra nem volt szignifikáns (1.8 2± plusz 0,2 nmol/mg/5 perc; t(8)=1.06, p=0.32). Dantrolen (10 uM), az intracelluláris Ca endoplazmatikus felszabadulás gátlója

reticulum [28], csökkent 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulás (5,6 ± 0,3 nmol/mg/5 perc; F(2,14) {{10}}). 95. o.,=0.{13}}). Azonban dantrolén jelenlétében 20 uM echinakozid még mindig jelentősen gátolja a glutamát felszabadulását (3,3 ± 0,2 nmol/mg/5 perc; p=0.000). Hasonló eredményeket figyeltek meg 100 uM 7-klór-5-(2-klórfenil)-1, 5-dihidro-4,1-benzotiazepin -2(3H)-on (CGP37157), a mitokondriális Na+/Ca2+csere membránáteresztő blokkolója. Az öt vizsgált szinaptoszomális készítményben 20 uM echinakozid 100 uM CGP37157-tel kombinálva 48,3%-kal ± 5,2%-kal csökkentette az 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulását (F(2,13) ​​= 136}. 49}}.000), hasonlóan az echinakozid önmagában történő gátlásához (46,2% ± 2,3%; p=0,89; 2. ábra).

2.4 EchinakozidGátolja az 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulását a protein-kináz C-n keresztül

A 3. ábrán látható módon 10 uM 2-[1-(3-dimetilaminopropil)indol-3-il]-3-(indol-3-il)-maleimid (GF109203X), egy általános protein kináz C-inhibitor [29], csökkentette az 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulását (F(2,13) ​​= 19.46, p=0.{17 }}). A GF109203X-szel kezelt szinaptoszómákban 20 µM echinakozid csak 5,5 ± 1,8 százalékkal csökkentette az 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulását (p=0,89), ami kevesebb, mint az echinakozid egyedüli alkalmazása esetén (42,4 ± 2,3 százalékkal). százalék ; p=0.000). Hasonló eredményeket kaptunk az 5,6,7,13-tetrahidro-13-metil-5-oxo-12H-indolo[2,3-a]pirrolo[3-mal ,4-c]karbazol-12-propánnitril (Go6976), amely szelektív a Ca2 plusz-függő protein kináz C izoformákra ( , I, II, y) [29]. 3 µM Go6976 jelenlétében 20 µM echinakozid 11,9 ± 2,9 százalékkal csökkentette a glutamát felszabadulását (p=0,59), ami jelentős csökkenést jelent az echinakozid önmagában történő kezeléséhez képest (42,4 százalék 2,3 százalék; p {{ 65}}.000; 3. ábra). Ezzel szemben 3 uM rottlerin, egy Ca2 plusz-független protein kináz C6 inhibitor [30], nem változtatta meg szignifikánsan az 4-aminopiridin (1 mM) által kiváltott glutamát felszabadulást (p=0,45). Mindazonáltal rottlerin jelenlétében 20 uM echinakozid átlagosan 37,1 ± 5,6 százalékos gátlást okozott a felszabadulásnak (F(2,13) ​​= 19.72, p=0.{{88 }}), hasonlóan az echinakozid önmagában történő használatához (p=0,41; 3. ábra). Ezenkívül a mitogén által aktivált protein kináz inhibitor 2-(2-amino-3-metoxifenil)-4H-1-benzopirán-4-on) (PD98059) ) (50 uM) és a protein kináz A inhibitor N-[2-(p-bróm-cinnamilamino)etil]-5-izokinolinszulfonamid (H89) (100 uM) csökkentette az 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulását (p=0.{110}}). 20 uM echinakozid még PD98059 vagy H89 jelenlétében is hatékonyan csökkentette a felszabadulást (F(2,13) ​​= 52.3, p=0.000; 3. ábra).

A 4. ábra azt mutatja, hogy 1 mM 4-aminopiridin növelte a protein kináz C foszforilációját a szinaptoszómákban (t(4)=-6.871, p=0.002). Amikor a szinaptoszómákat 20 uM echinakoziddal 10 percig előkezelték az 4-aminopiridin hozzáadása előtt, az 4-aminopiridin által kiváltott protein-kináz C foszforilációja jelentősen csökkent (F(2,6)=29).202 , p=0.001).

2.5 A glutamát felszabadulás echinakozid által közvetített gátlása nem tartalmaz A típusú gamma-aminovajsav (GABAA) receptort

Az 5. ábrán az echinakozid hatását hasonlították össze az 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulásra SR95531 (a GABAA receptor antagonistája) hiányában vagy jelenlétében. Ezenkívül 100 uM SR95531 nem változtatta meg szignifikánsan az 4-aminopiridin (1 mM) által kiváltott glutamát felszabadulást. Az SR95531--kezelt szinaptoszómákban 20 uM echinakozid alkalmazása 43%-os gátlást eredményezett az 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulásban (F(2,12)=42.63, p { {18}}.000), amely nem különbözött szignifikánsan az echinakozid által önmagában kiváltott gátlástól (40 százalék; p=0.000). Hasonló eredményt kaptunk egy másik GABAA receptor antagonistával, a bicuculline-nal (50 uM). A bicucullin és az echinakozid jelenlétében mért felszabadulás szignifikánsan különbözött a csak bicucullin jelenlétében mért felszabadulástól (p=0.000).

3. Megbeszélés

Ebben a tanulmányban,echinakozid, a Herba hatóanyagaCistanche, gátolta az 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulását a patkány agykéreg idegvégződéseiben. A lehetséges mögöttes mechanizmusok aechinakozidA glutamát felszabadulás közvetített gátlását itt tovább vizsgáljuk és tárgyaljuk.

3.1 A glutamát felszabadulás echinakozid által közvetített gátlásának hátterében álló mechanizmusok

Az 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulás két komponensből áll: egy fiziológiailag releváns Ca2 plusz-függő komponens, amely a glutamátot tartalmazó szinaptikus vezikulák exocitózisával képződik; valamint egy Ca2 plusztól független komponens, amely elhúzódó depolarizációból származik, ami a glutamát transzporter egyensúlyi állapotának membránpotenciál-közvetített eltolódását okozza kifelé, így befolyásolva a citoszolos glutamát effluxot [31]. Itt megfigyeltük, hogy az echinakozid nem gátolta szignifikánsan az 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulását Ca2 plusz mentes tápközeg jelenlétében (Ca2 plusztól független felszabadulás). Ezenkívül az 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulás megfigyelt echinakozid által közvetített gátlását hatékonyan megakadályozta a bafilomicin A1 (amely kimeríti a szinaptikus vezikulák glutamát tartalmát), de nem a DL-TBOA (amely nem szelektíven gátolja az összes serkentő aminosavat) transzporter altípusok). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az echinakozid befolyásolja a glutamát felszabadulás Ca2 plus -függő exocitózisát anélkül, hogy befolyásolná a glutamát Ca2 plus -független citoszolos kiáramlását az idegterminális plazmamembrán glutamát transzporterének megfordításán keresztül. A szinaptikus terminálisokban a Na plus csatorna gátlás vagy a K plusz csatorna aktiváció stabilizálja a membrán ingerlékenységét, következésképpen csökkenti a kiváltott Ca2 plus bejutást és neurotranszmitter felszabadulást [32,33]. Ezért az echinakozid által közvetített glutamát-felszabadulás gátlása mögött meghúzódó lehetséges mechanizmus magában foglalja a szinaptoszómális ingerlékenység csökkenését. Ez a lehetőség azonban két megfigyelés alapján tarthatatlan: (1) az 4-aminopiridin által kiváltott membránpotenciál depolarizációt, amelyet a membránpotenciálra érzékeny DiSC3(5) festékkel mértek, az echinakozid hozzáadása nem befolyásolta; és (2) az echinakozid nem befolyásolta az 4-aminopiridin által kiváltott Ca2 plusz-független glutamát felszabadulását, amely a felszabadulásnak csak a membránpotenciáltól függ [31]. Ha a hatást nem a szinaptoszómális ingerlékenység szuppressziója okozza, akkor a Cav2.2 (N-típusú) és Cav2.1 (P/Q-típusú) Ca2 plusz csatornák aktivitásának csökkenésében nyilvánulhat meg, amihez glutamát exocitózis társul. idegvégződések [34–36]. A fura-2 használatával kimutattuk, hogy az echinakozid jelentősen csökkenti a Ca2 plusz koncentrációjának 4-aminopiridin által kiváltott növekedését. Ezen túlmenően adataink azt mutatják, hogy az echinakozid gátló hatása az 4-aminopiridin által kiváltott glutamát-felszabadulásra 42,4 százalékról 2,3 százalékról 12,1 százalékra, 3,9 százalékra csökkent a Cav2.2 (N-típusú) és Cav2 blokkolóval való érintkezést követően. .1 (P/Q-típusú) Ca2 plusz csatornák. Megfigyeltük továbbá, hogy az echinakozid továbbra is jelentős mértékben gátolja az 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulását intracelluláris Ca2 plusz felszabadulást gátló szerek jelenlétében. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a Cav2.2 (N-típus) és Cav2.1 (P/Q-típusú) Ca2 plusz csatorna aktivitás egyidejű szuppressziója az echinakozid által közvetített glutamát-felszabadulás gátlása mögött meghúzódó potenciális mechanizmus. A Cav2.2 (N-típusú) és Cav2.1 (P/Q-típusú) Ca2 plusz csatornaaktivitás együttes aktiválása azonban nem tudta teljesen blokkolni az echinakozid hatását. Ezért a Ca2 plusz csatornák más azonosítatlan típusai vagy más preszinaptikus útvonalak is részt vehetnek a gátlásban. Például a GABAA receptorok preszinaptikus szinten vannak jelen, és aktivációjukról kimutatták, hogy gátolja a Ca2 plusz beáramlást és a glutamát felszabadulását [37]. Jelen tanulmányban a GABAA receptor antagonisták, az SR95531 és a bicuculline nem blokkolták a glutamát felszabadulás echinakozid által közvetített gátlását, ami arra utal, hogy a GABAA receptorok nem vesznek részt a feszültségfüggő Ca2 plusz csatorna aktivitás csökkentésében és a glutamát felszabadulás ezt követő gátlásában. A Ca2 plusz feszültségfüggő Ca2 plus csatornákon keresztül történő bejutása számos protein-kinázt aktivál, amelyek a glutamát felszabadulásával kapcsolatosak az idegvégződésekben, beleértve a mitogén által aktivált protein kinázt, protein kináz C-t és protein kináz A-t. Itt bemutatjuk, hogy a protein kináz C gátlók hatékonyan antagonizálták az echinakozidot. -a glutamát felszabadulás közvetített gátlása; mindazonáltal a mitogén által aktivált protein kináz inhibitor PD98059 vagy a protein kináz A inhibitor H89 hatástalan volt. Ezenkívül a protein-kináz C 4-aminopiridin által kiváltott foszforilációja csökkent a szinaptoszómákban, miután echinakoziddal előkezelést végeztek olyan koncentrációban, amely hatékonyan gátolja a glutamát felszabadulását. Ezért az echinakozid által közvetített glutamát felszabadulás gátlás jelátviteli útvonala magában foglalhatja a protein kináz C-t. A protein kináz C fontos intracelluláris jelátviteli rendszer, amely preszinaptikus szinten van jelen, és döntő szerepet játszik a neurotranszmitterek exocitózisában. Például számos szinaptikus fehérjét, amelyek részt vesznek a szinaptikus vezikulák kereskedelmében vagy toborzásában és exocitózisában, mint például a mirisztoilezett alaninban gazdag C-kináz szubsztrát, a protein-kináz C foszforilálja [38,39]. Ez a foszforilációs folyamat fokozható a depolarizáció által stimulált Ca2 plusz bejutással, ami elősegíti a glutamát felszabadulását [40]. Ezért ésszerűen feltételezhetjük, hogy az echinakozidnak a Ca2 plusz bejutását itt megfigyelt gátló hatása csökkentheti a protein kináz C aktivitást és ennek következtében a glutamát felszabadulását.

Kérem kattintson ide a 2. részhez