A Cistanches Deserticola kivonat hatása a nyúl RTEC-ek H2O2 által okozott sérülésére

Absztrakt: Nyúl vese tubuláris hámsejtjeit in vitro tenyésztettük, hogy tanulmányozzuk a H2O2 hatását a sejtszaporodásra és a Cistanche deserticola kivonat hatását a H2O2 által sérült tubuláris hámsejtekre. Sejtmorfológiával vizsgáltuk a H2O2 hatását a nyúl vese tubuláris hámsejtjeinek proliferációjára MTT módszerrel, valamint a 2,20 és 200 mg·L – 1 C． védő hatását. A deserticola vízkivonatot és az alkoholkivonatot az LDH felszabadulása alapján vizsgálták. Az eredmények azt mutatták, hogy a sejtek morfológiai változásainak száma fokozatosan nőtt. A kapcsolódó sejtek száma fokozatosan csökkent. A sejtproliferáció és az LDH felszabadulás gátlási sebessége nőtt a H2O2 koncentráció növekedésével együtt. Nagy dózisú C. A deserticola kivonat jelentősen csökkentheti a ＲTECs H2O2 általi proliferáció gátló hatását (P ＜ 0． 01) . A C víz extrakciója és alkoholos kivonata. deserticola jelentősen csökkentheti az LDH felszabadulását (P ＜ 0． 01). A H2O2 bizonyos hatást gyakorolt ​​a nyúl ＲTEC-einek proliferációs reakciójára, míg a C． A deserticola kivonat védő hatást fejt ki a H2O2 által okozott TEC-károsodás ellen.

Kulcsszavak: Cistanches deserticola; vese tubuláris epiteliális sejt; sejtkárosodás előszó

A Cistanche deserticola, más néven sivatagi ginzeng a Cistanche deserticola YC Ma vagy Cistanche tubulosa (Schenk) Wish száraz, pikkelyes, mezofil szára az Orobaceae családban. Tonizálja a vese yangot, jótékony hatással van az esszenciára és a vérre, nedvesíti a beleket és enyhíti a székrekedést. Hagyományosan vese yang-hiányra, esszencia- és vérhiányra, impotenciára és meddőségre, derék- és térdfájdalmakra, izom- és csontgyengeségre, valamint bélszárazságra és székrekedésre használták, ez a történelem leggyakrabban használt tonizáló vese yang gyógyszere.. 

Cistanche deserticola

A H2O2, mint a reaktív oxigénfajták egyik formája, erős lipidperoxidációt indukál, és szinte bármilyen sejtkomponenssel reakcióba léphet, lánc lipidperoxidációt okozva, és sejt apoptózishoz és diszfunkcióhoz vezet [2,3]. A kísérlet elsősorban a Cistanche deserticola kivonat hatását vizsgálja a H2O2-indukált proliferáció gátlására és nyúl vese tubuláris hámsejtjeinek sérülésére, és előzetesen feltárja a vesetubuláris hámsejtekre gyakorolt ​​védő hatását.

1 Anyag és módszer

1.1 Kísérleti gyógyszer

A Cistanche deserticola ma-t a Sichuan Chuannan Pharmaceutical Co., Ltd.-től vásároltuk (151201 tételszám).

Sivatagi élő ciszterna

1.2 Állatok

Új-zélandi fehér nyúl, hím, 20 napos, a Guizhou Állattenyésztési Kutatóintézet kísérleti bázisától vásárolva, állatengedély száma: SCXK (Guizhou) 2012-001.

1.3 Reagensek

DMEM/F-12 (1:1), Gbico Corporation; Magzati szarvasmarha szérum, Zhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd.; Dimetil-szulfoxid (DMSO), Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd.; H2O2, Sichuan Jinshan Pharmaceutical Co., Ltd.; Tripszin, Amresco Company; tiazolkék (MTT), Genview; Nem radioaktív citotoxicitási tesztkészlet, Promega Corporation; Vízmentes etanol, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.

1.4 Műszerek

CO2 inkubátor, Type 3111, Thermo Fisher Scientific; Enzim marker, 1510 típusú, Thermo Fisher Scientific; Ultra tiszta munkapad, SW-CJ-1FD, Suzhou Purification Equipment Co., Ltd.; Fordított fluoreszcens mikroszkóp, Ningbo Shunyu; Forgó elpárologtató, RE-52AA, Shanghai Yarong Biokémiai Műszergyár; Fagyasztószárító, LGJ-12, Beijing Songyuan Huaxing Technology Development Co., Ltd.

1.5 Módszer

1. 5.1 Cistanche deserticola kivonat elkészítése

Vegye ki a Cistanche deserticola szárított gyógynövényeit, és őrölje apró darabokra. Minden porból pontosan mérjünk ki 100 g-ot, és adjunk hozzá tízszeres mennyiségű desztillált vizet és 75 százalékos etanolt, hogy háromszor melegítsük és forraljuk visszafolyató hűtő alatt. Az első alkalom 3 óra, a második alkalom 1 5 óra, a harmadik alkalommal 1 óra, egyesítsünk 3 szűrletet, csökkentsük a nyomást és sűrítsük a kivonathoz, számítsuk ki a kivonathozamot 22 30 százalékban, etanolos kivonat 21 70 százalék, illékony maradék alkohol, fagyasztva szárító mechanizmus víz és alkoholos kivonatok előállításához a Cistanche deserticola-ból, lezárva, szárítva és sötét helyen tárolva későbbi felhasználás céljából.

1. 5. 2 Sejttenyésztés

Készítsen vese tubuláris epiteliális sejtmodellt Zhao Dan és munkatársai által leírt módszerrel. [4], izolálja és tenyésztse ki a primer vese tubuláris hámsejteket 20-napos nyulakból, és várja meg, amíg a sejtek a tenyészedény több mint 90 százalékára nőnek, majd tripszinnel megemésztik őket. DMEM/F-12 komplett táptalajt használva, amely 1% magzati szarvasmarha szérumot tartalmazott 1 arányban, két × 104 sejtet oltottunk be egy 96 lyukú lemezre, és 37 °C-on és 5% CO2-on tenyésztettük.

1. 5. 3 3 H2O2 által indukált nyúl vese tubuláris hámsejt-sérülési modelljének felállítása

Lásd: 1 5. 2 Oltsuk be a sejteket, és 48 órás stabil sejttenyésztés után használjunk H2O2-t a károsodáshoz. Állítson fel egy kísérleti csoportot és egy üres kontrollcsoportot, mindegyik csoportban 4 ismétlést, háromszor ismételve. Kísérleti csoport: Cserélje ki a teljes táptalajt különböző koncentrációjú H2O2-vel, 550, 500, 450, 400 és 350 μMol · L-1 H2O2 koncentrációkkal, vak kontrollcsoport: Cserélje ki a teljes táptalajt, 37 fokos és 5 százalékos CO2 mellett 24 órán át folytatja a termesztést, végezze el a mikroszkópos vizsgálatot és gyűjtsön képeket. A sejtek H2O2 hatására bekövetkező proliferációjának mérésére MTT [5] módszert alkalmaztunk, az abszorbancia értéket (OD érték) pedig 490 nm-en mértük. Nem radioaktív citotoxicitás-detektáló készlet használata a sejtek LDH-felszabadulásában bekövetkezett változások meghatározására H2O2-kezelés után, LDH-felszabadulás ( százalék )=felülúszó LDH-mennyiség/(felülúszó LDH-mennyisége plusz lizátum LDH-mennyisége) × 100 százalék. AO/EB fluoreszcens festés [6]: Vegyünk 100 μ G/mL AO oldatot és 100 μ 100 g/mL EB oldatot mindegyik μL-re. Keverje össze jól, és adjon hozzá 10-10-et minden egyes μL-es lyukhoz. Azonnal helyezze fordított fázisú kontrasztra. fluoreszcens mikroszkóppal a megfigyeléshez, a megfigyelési látómezőt 5 percen belül változatlanul tartsa, és 450 ± 10 nm-es kék, illetve 532 ± 10 nm-es zöld fényben gyűjtsön képeket. Használjon fluoreszcencia gyűjtő rendszert a fluoreszcencia szintézishez, hogy fluoreszcens festési képeket kapjon.

1. 5. 4 4 Cistanche kivonatpor hatása a nyúl vese tubuláris hámsejtjeinek H2O2-indukálta károsodására

Cistanche por

Kattintson ide a Cistanche for Kidney betegség termékek megtekintéséhez

【Ask for more】 Email: xue122522@foxmail.com /  Whats App:  0086 18599088692 /  Wechat:  18599088692

1 5 szerint. 2 Oltson be sejteket, és 24 órás stabil sejttenyésztés után adjon 200 ul teljes, Cistanche deserticola kivonatot tartalmazó táptalajt minden egyes lyukba, hogy a sejteket 24 órán keresztül elővédje. Állítson fel egy kísérleti csoportot, egy modellcsoportot és egy üres kontrollcsoportot, csoportonként három ismétléssel. Kísérleti csoport és modellcsoport: cserélje ki 400 μ-re. Komplett táptalaj mol · L-1 H2O2-vel; Üres kontrollcsoport: komplett táptalaj. Folytassa a termesztést 24 órán keresztül. A sejtproliferációt MTT módszerrel, a sejt LDH felszabadulásában bekövetkezett változásokat pedig nem radioaktív citotoxicitási vizsgálati kittel mértük.

1.6 Statisztikai feldolgozás

Az adatok eredményeit x ± s-ban fejeztük ki az SPSS használatával 19 0 statisztikai szoftvert használtunk a statisztikai elemzéshez. A csoportok közötti összehasonlításhoz egytényezős varianciaanalízist, a csoportok közötti többszörös összehasonlításhoz pedig az LSD módszert alkalmaztuk, P-vel.<0 05 indicating statistical significance.

2 Eredmények és elemzés

2.1 A nyúl vese tubuláris epiteliális sejtjeinek H2O2 által kiváltott morfológiai változásai

Miután a nyúl vese tubuláris epiteliális sejtjeit 24 órán keresztül különböző koncentrációjú H2O2-vel kezeltük, mikroszkóp alatt megfigyeltük a nyúl vese tubuláris hámsejtjeinek morfológiáját az 1. ábrán látható módon. A H2O2 koncentráció növekedésével a sejtek száma morfológiai változásokkal fokozatosan nőtt, fokozatosan csökkent a parietális sejthez tapadt sejtek száma, egyes sejtek meghosszabbodtak, a sejtek fényessége csökkent, mérete csökkent. A H2O2 koncentrációja elérte az 550 μ Mol · L-1 értéket, eltűnnek az axonok, felszakadnak a sejtmembránok, zsugorodik a sejt, nő a sejtrés, és rések jelennek meg a sejtfoltok között.

1. ábra A H2O2 koncentráció hatása a nyúl morfológiájáraRTEC (100 × )

2.2 A 2.2 H2O2 hatása a nyúl vese tubuláris epiteliális sejtjeinek proliferációjára

Használjon 350, 400, 450, 500 és 550 μ Mol · L-1 H2O2-val kezelt nyúl vese tubuláris hámsejteket 24 órán keresztül, és az abszorbanciát MTT módszerrel mérjük. Az eredmények azt mutatták, hogy a H2O2 különböző koncentrációi gátolják a nyúl vese tubuláris hámsejtjeinek proliferációját, az IC50 értéke 439 07 μ mol·L – 1 500 μ A H2O2 gátló hatása mol · L-rel -1 a sejtburjánzáson 24 óra elteltével elérheti az 50 százalékot, ezért ezt a koncentrációt választották ki a későbbi kutatásokhoz.

2.3 A 2.3 H2O2 hatása az LDH felszabadulására nyúl vese tubuláris epiteliális sejtjeiben

Nyúl vese tubuláris hámsejtjein 24 órás H2O2 kezelés után a sejtfelülúszóban és a sejtlizátumban megmértük az LDH reakciók OD-értékeit nem radioaktív citotoxicitás kimutatási módszerekkel, és kiszámítottuk az LDH sejtekből történő felszabadulását. Az eredményeket az 1. táblázat mutatja. A különböző koncentrációjú H2O2 fokozhatja az LDH felszabadulását a nyúl vese tubuláris epiteliális sejtjeiben, és minél magasabb a H2O2 koncentráció, annál nagyobb az LDH felszabadulása koncentrációfüggő módon. A 400 mmol · L-1 koncentrációjú H2O2 a sejt LDH felszabadulását több mint 50 százalékkal meghaladja a vak csoportnál, ami súlyos sejtkárosodást okoz.

Tab. 1 A H2O2 hatása a nyúl RTEC-ekből származó LDH-felszabadulásra

Megjegyzés: Az üres kontrollcsoporthoz képest * P<0 05; ＊＊ P ＜ 0. 01

2,4 H2O2-vel kezelt nyúl vese tubuláris hámsejtek 2,4 AO/EB fluoreszcens festési eredményei

Miután a nyúl vese tubuláris epiteliális sejtjeit 24 órán keresztül H2O2-val kezeltük, a sejteket AO/EB fluoreszcenciával festettük, amint az a 2. ábrán látható. Előzetesen úgy ítélték meg, hogy a H2O2 mechanizmusa a nyúl vese tubuláris epiteliális sejtjein elsősorban a nekrózist okoz. A különböző koncentrációjú H2O2 különböző mértékű nekrózist okozhat a nyúl vese tubuláris hámsejtjeiben, ahol a H2O2 koncentrációja kisebb, mint 400 μ A mol · L-1-nál a magkromatin zöld színű körré zsugorodik, amit főként a következőképpen ítélnek meg. korai apoptózis. A H2O2 koncentráció növekedésével több mint 450 μ At mol · L-1, a sejtek narancsvörös, nem kerek gyöngy alakot mutattak, és a nekrotikus sejtek száma koncentrációfüggő módon nőtt.

2.5. A 2.5 Cistanche deserticola hatása a nyúl vese tubuláris hámsejtjeinek H2O2-indukált proliferációjára

Kísérleti tanulmány a Cistanche deserticoláról

A nyúl vese tubuláris hámsejtjeinek túlélési aránya különböző koncentrációjú (2, 20, 200 mg! L-1) vizes és alkoholos Cistanche deserticola kivonat mellett nem mutatott szignifikáns különbséget a normál körülmények között, beavatkozás nélkül tenyésztett sejtekhez képest. Amint a 3. ábrán látható, a modellcsoporttal összehasonlítva a Cistanche deserticola alkoholos és vizes kivonatának nagy koncentrációjú csoportjai jelentősen csökkentették a H2O2 gátló hatását a nyúl vese tubuláris epiteliális sejtjeinek proliferációjára (P<0 01).

2. ábra Nyúl AO/EB festéseRKülönböző H2O2-koncentrációkkal kezelt TEC-ek (100 ×)

Megjegyzés: A modellcsoporthoz képest * P<0 05,＊＊P ＜ 0. 01

3. ábra C hatása. deserticola a H2O2-indukált nyúl gátlásáraRA TEC-ek elterjedése

2.6 A 2.6 Cistanche deserticola hatása a nyúl vese tubuláris hámsejtjeinek H2O2 által kiváltott károsodására

A sejtekben az LDH felszabadulására gyakorolt ​​hatás eredményeit a 4. ábra mutatja. A Cistanche deserticola etanolos kivonatának és vizes kivonatának magas, közepes és alacsony koncentrációjú csoportjai szignifikánsan alacsonyabb LDH-felszabadulást eredményeztek a nyúl vese tubuláris epiteliális sejtjeiben H2O2 után kezelés, mint a modellcsoportban (P<0 01), the results are concentration-dependent, with higher concentrations leading to lower cell LDH release.

Megjegyzés: A modellcsoporthoz képest * P<0 05,＊＊P ＜ 0. 01

4. ábra C hatása. deserticola H2O2-on – indukált LDH felszabadulást nyúlbólRTECs

3 Vita

A "sivatagi ginzeng" néven ismert Cistanche deserticola rendkívül magas gyógyászati ​​értékkel rendelkezik, és híres kínai tonik gyógyszer. A "Shennong Materia Medica Classic" [7] a következőképpen írja le a csúcsminőségű orvoslást: "A Shangyao... főként az életet táplálja, hogy reagáljon az égre, nem mérgező, és gyakran kell szedni anélkül, hogy az embereket károsítaná..." Cistanche deserticola kiváló minőségű gyógyszerként szerepel, édes ízű és enyhe hőmérsékletű. A "Híres orvosok listája" [8] rámutat, hogy a Cistanche deserticola "savanyú, sós és nem mérgező". Ezt követően a Cistanche deserticola természetére, ízére és meridiánjára vonatkozó feljegyzések a kínai gyógynövénygyógyászat különböző dinasztiáiban egybehangzóak. Természete enyhén meleg, íze édes, savanykás, sós, ami a vese- és vastagbél meridiánokhoz tartozik. Hagyományosan vese yang-hiányra, derék- és térdfájdalmakra, valamint izom- és csontgyengeségre használták, farmakológiai hatásai és mechanizmusai mindig is a kutatás fókuszában álltak. A modern farmakológiai vizsgálatok kimutatták, hogy a Cistanche deserticola képes ellenállni az öregedésnek, javítja a tanulási és memóriaképességet, valamint szabályozza az immunfunkciókat. Széles körben használják a hagyományos kínai orvoslás klinikai receptjeiben, a hagyományos kínai szabadalmaztatott gyógyszerekben, valamint az egyszerű készítményekben és egészségügyi termékekben.

Cistanche kiegészítő a közelemben

Az oxidatív stressz néhány fő betegség kulcsfontosságú indukálója, ami a szervezetben a reaktív oxigénfajták képződése és eliminációja közötti egyensúlyhiányból adódik, ami a hisztiociták bizonyos fokú oxidatív károsodását eredményezi. Ezért a stresszválasz mechanizmusának mélyreható kutatása ésszerű módszert találhat az ingerlékenységi betegségek hatékony megelőzésére, javítására vagy akár megszüntetésére. Az oxidatív stressz különféle sejt- és fehérjeperoxidációhoz vezethet a szervezetben [9], és a H2O2-t a kutatás során a károsító exogén anyagok közé választják. Erőteljesen indukálja a lipidperoxidációt, lánc lipidperoxidációs reakciókat vált ki, és sejt apoptózishoz és diszfunkcióhoz vezet. Jelenleg ennek az exogén anyagnak a nefrotoxicitásával és antagonista hatásával kapcsolatos kutatások elsősorban állatmodellek kialakítására támaszkodnak, és viszonylag kevés irodalmi adat áll rendelkezésre a kapcsolódó kutatások in vitro modelljeinek létrehozásáról. A nefrotoxicitás állatmodelljeivel összehasonlítva az in vitro nefrotoxikus sejtmodellnek olyan előnyei vannak, mint a hatás egyértelmű célpontja, a rövid gyógyszeres ciklus és az alacsony dózis.

Kínai gyógynövény-cistanche

Tanulmányozza az exogén anyagok által kiváltott in vitro nefrotoxikus sejtmodellt a sejtmorfológia változásán, az exogén anyagok sejtproliferációt gátló hatásán és a sejt LDH felszabadulásában bekövetkező változásokon keresztül. A H2O2 különböző koncentrációi jelentős hatással vannak a sejtek morfológiai változásaira. Az exogén anyagok koncentrációjának növekedésével a sejtdeformációk száma nő. Az MTT assay egy általánosan használt módszer az élő sejtek számának kimutatására. Azokban a kísérletekben, ahol a Cistanche deserticola különböző koncentrációi védik a nyúl vese tubuláris hámsejtjeit a H2O2 károsodástól, a különböző koncentrációjú Cistanche deserticola szignifikánsan csökkentette a H2O2 gátló hatását a nyúl vese tubuláris hámsejtjein, és ez koncentrációfüggő. Ha a sejtmembrán megsérül, intracelluláris LDH szabadul fel a táptalajba. A sejttenyésztő tápközeg LDH-tartalma fontos indikátor a sejthalál kimutatásához. Ez a tanulmány megállapította, hogy a H2O{7}}modellcsoport sejttenyésztő tápközegében az LDH szintje szignifikánsan megemelkedett a nyúl vese tubuláris hámsejtjeiben, míg a különböző koncentrációjú Cistanche deserticola-val kezelt kísérleti csoportban az LDH szint szignifikánsan emelkedett. koncentrációfüggő módon csökkent.A kutatási eredmények azt sugallják, hogy a nyúl vese tubuláris hámsejtjeinek H2O2-indukálta károsodásának modelljének felállítása és a Cistanche deserticola kivonat vese tubuláris hámsejtekre gyakorolt ​​védőhatásának előzetes feltárása nemcsak az okozott sejtkárosodás kutatásának alapjait jelenti. oxidatív stressz által, hanem alapvető adatokat szolgáltat a Cistanche deserticola fejlődéséhez és hasznosításához is.

referencia:

［1］ Ch. P( 2015) Vol Ⅰ［S］. 2015: 135.

［2］ Kim JH, Choi W, Lee JH stb. Az asztaxantin gátolja a H2O2 – által közvetített apoptotikus sejthalált egér idegi progenitor sejtekben a p38 és MEK jelátviteli útvonalak modulálásával (J］ Microbiol Biotechnol, 2009, 19(11): 1355-1363.

［3］ Siu PM, Wang Y, Alway SE. H2O2 által kiváltott apoptotikus jelátvitel – közvetített oxidatív stressz differenciált C2Cl2 myo csövekben［J］． Life Sci, 2009, 84(13): 468–481. ［4］ Zhao Dan, Zhang Xue, Guan Jing stb. Tanulmány számos kínai gyógynövény hatásáról a primer vesetubuláris hámsejtek proliferációjára nyulakban ［ J ］. Journal of Mountain Agricultural Biology, 2017, 36 (4): 76-79

［5］ Chen Lizhen, Feng Tingting, Huang Junfei és munkatársai Tanulmány az ipriflavonnak az oszteoklasztok aktivitására és az oszteoblasztok proliferációjára és differenciálódására gyakorolt ​​hatásáról ［ J］. Journal of Mountain Agricultural Biology, 2015, 34 (3): 042-047

［6］ Chen Meng, Li Huatao, Li Xiang és munkatársai Paklitaxel által indukált apoptózis kimutatása kutya emlődaganat sejtjeiben in vitro AO/EB kettős festési módszerrel [J]. Guangdong Állat- és Állategészségügyi Tudomány és Technológia, 2011, 36 (1): 39-42

［7］ Gu GG, Yang P J. Shen Nong Ben Cao Jing［M］． Peking: Xueyuan Press, 2013: 73.

［8］ Tao HJ, Shang Z J. Ming Yi Bie Lu［M］． Peking: Népi Orvosi Kiadó, 1986: 51.

［9］ Cash TP, Pan Y, Simon M C. Ｒeaktív oxigénfajták és celluláris oxigénérzékelés［J］． Ingyenes Ｒadic Biol Med, 2007, 43(9): 1219-1225.