A Runing II hatása az átültetett daganat növekedésére és metasztázisára emlőrákot hordozó egerekben és annak mechanizmusára

Célkitűzés:

A Runing II (kínai emlőrák elleni gyógynövénykészítmény) hatásának tanulmányozása a MA{0}}T2 egereket hordozó emlőrák transzplantált daganatainak növekedésére és metasztázisára, valamint annak mechanizmusára. Módszerek: Tüdőáttéttel rendelkező TA2 egerek emlőrák MA-891 sejttörzsből transzplantált daganatának modelljét azért fejlesztettük ki, hogy megfigyeljük a Runing II hatását az átültetett daganat növekedésére és metasztázisára. Az immunhisztokémiai módszert és a képanalízist alkalmaztuk a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF), a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor receptor (VEGFR), a mikroerek számának (MVC) és a mikroerek területének (MVA) szintjének kimutatására.

Eredmények: A Running II csoportban a tumortömeg-gátlási arány 37,3%, illetve a tüdőmetasztázis-gátlási arány 65,4% volt, a tumornövekedés és a tüdőmetasztázis nyilvánvalóan gátolt; És a VEGF és VEGFR, az MVC és az MVA szintjei szignifikánsan csökkentek a tumoros kontrollcsoporthoz képest (P<0.05). Conclusion: The Chinese herbal preparation Running II can inhibit the metastasis of tumors by inhibiting angiogenesis, and the mechanism is possibly related to the down-regulation of VEGF and VEGFR expression.

Emellett a kutatással egyidőben megállapítottuk, hogy a Cistanche-ban található echinaceának daganatellenes hatása van. Az echinakozid tumorellenes gyógyszerekben való alkalmazásához a jelen találmány először MTH1-et, szervetlen pirofoszfatázt és dGTP-t ad a reakcióoldathoz (100mM pH8,0 trisz-ecetsav, 40 mM NaCl, 10 mM magnézium-acetát, 0,005% Tween20 és 1mMDTT) Az eljárás során az enzimet és a szubsztrátot szobahőmérsékleten 1 órán át inkubáltuk, majd 25 ul malachitzöld oldatot adtunk hozzá a reakció leállítására. Az abszorbanciát 630 nm-en detektáltuk BIO-RAD iMark mikrolemez olvasóval. Az eredmények azt mutatták, hogy az echinakozid jelentős gátló hatással volt az MTH1 enzimaktivitására; Másodszor, az echinakozid sejtszintű tumorsejtekre gyakorolt ​​hatását MTT vizsgálattal detektáltuk, és az eredmények azt mutatták, hogy az echinakozid jelentősen gátolja az SW480 vastagbélráksejtek és az U2OS humán osteosarcoma sejtek növekedését, és a jelen találmány gátolja az echinakozid növekedését. Az MTH1, egy specifikus enzim, amely fenntartja a túlélést a tumorsejtekben, oxidált nukleotidok beépüléséhez vezet a DNS-be, ami halálos DNS-kettős száltöréseket okoz a rákos sejtekben, ezáltal daganatellenes hatást vált ki. Az új orvosi alkalmazás megalapozza a jövőben új daganatellenes gyógyszerek kifejlesztését.

Kattintson a Cistanche hatású termékre

Kulcsszavak:

emlődaganat; angiogenezis; vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF); Running II (kínai gyógynövénykészítmény emlőrák kezelésére)

Az emlőrák egy rosszindulatú daganat, amely súlyosan veszélyezteti a nők egészségét, és a betegség előfordulási gyakorisága az első helyen áll a női rosszindulatú daganatok között, és évről évre nő. Bár terápiás módszerei előrehaladtak, az emlőrákos betegek hosszú távú túlélési aránya nem nőtt a daganatok invazív növekedése és metasztázisa miatt. A daganatok angiogenezise alapvető feltétele a daganatok növekedésének, inváziójának és metasztázisának.

Ezért a daganatok angiogenezisének gátlása hatékony módja a daganatok képződésének és kialakulásának megelőzésének, valamint a beteg életének meghosszabbításának.1 Jelen tanulmányban a Running II kínai gyógyszer qi-kiegészítő és tápláló yin funkcióinak mechanizmusa, Az átjáró- és fogamzási erek szabályozását, a tömeg feloldását és a detoxikációt a daganatok és az áttétek gátlásában az angiogenezis és annak szabályozó tényezői alapján tanulmányozták tüdőáttéttel rendelkező TA2 egerek emlőrák MA-891 transzplantált daganatában.

ANYAGOK

Hatvan, (20±2) g tömegű, 6-8 hetes SPF nőstény TA2 egeret a Tianjin Orvostudományi Egyetem Laboratóriumi Állatok Tanszékétől vásároltunk. Az egér emlőrák MA-891 sejttörzsét Prof. Luo Liqin, a Kínai Orvostudományi Akadémia Tumor Intézetének Patológiai Laboratóriuma szállította.

A Runing II a következőkből áll: Sheng Huang Qi (Radix Astragali Mongolici), Shan Ci Gu (Pseudobulbus Cremastrae), Tai Zi Shen (Radix Pseudostellariae), Gou Qi Zi (Fructus Lycii), E Zhu (Rhizoma Curcumae Phaeocaulis), Yi Yi Ren ( Semen Coicis), Yin Yang Huo (Herba Epimedii), Dang Gui (Radix Angelicae Sinensis) stb., 1,67: 1,67: 1,33: 1,33: 1,33: 1,33: 1,33: 1 dózisarányban, amelyeket főzetként készítettek. Gyógyszerészeti részleg, Longhua Kórház, hagyományos technikával, és 4 °C-on tartják használatra; A ciklofoszfamidot (CTX, 200 mg/ampula, fiókszám: 981104) és a tamoxifent (TAM) a Shanghai Hualian Pharmaceutical Co. Ltd. állította elő; A normál sóoldatot a Shanghai Fumin Pharmaceutical Co. gyártotta.

Vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) poliklonális antitest (1:25–1:50 munkahígítás), vaszkuláris endoteliális növekedési faktor receptor (VEGFR, munkahígítások 1:30–1:50) és FVIIIAg poliklonális antitest (1:50 munkahígítás) ) a Santa Cruz Biotechnology Inc.-től vásárolták; Az EnVision második antitestet, a nyúl anti-patkány VEGF antitestet, a kecske anti-nyúl FVIII Ag antitestet és a kecske anti-nyúl VEGFR antitestet és az EnVision Kit-et a Dako Co.-tól, Dániától vásároltuk; 3,3- A diaminobenzidint (DAB) a Shanghai Huamei Bioengineering Factory-tól vásároltuk.

MÓD

Állatmodell kidolgozása

Az állatmodellt Luo és Gao et al.2,3 módszerei alapján fejlesztették ki. In vitro tenyésztett emlőrákos egér MA-891 sejteket szelektáltunk logaritmikus túlélési fázisban, és a sejtek koncentrációját 1x107/ml-re szabályoztuk. Aszeptikus körülmények között az emlős rákos sejteket a TA2 egerek jobb hónaljának szubkután részébe oltottuk be (0,2 ml/egér, azaz 2X106 sejt/egér).

Az állatok csoportosítása és az adagolás módjai

Két nappal az oltás után az egereket véletlenszerűen 4 csoportra osztottuk, mindegyik csoportban 15 egér volt. 1) Tumort hordozó kontrollcsoport: 0,4 ml normál sóoldatot adagoltunk intragasztrikusan, naponta egyszer, hetente ötször. 2) II. futtató csoport: a II. szakaszt normál sóoldattal hígítottuk, és ebből a hígításból 0,4 ml 48 g·kg{{10}}·d-1-nak felelt meg. A „Kínai gyógyszerek farmakológiai vizsgálatainak módszertana”4 mellékelt táblázata szerint számítva, „Az emberi és állati testfelületek közötti konverziós táblázat”4, intragasztrikusan adták be, naponta egyszer, hetente ötször. 3) CTX kontrollcsoport: A Jiang Bo által alkalmazott adagról körülbelül 5 CTX-t hígítottunk normál sóoldattal, és 0,4 ml, ami 50 mg·kg-1·d-1-nak felel meg. intragasztrikusan, minden második napon egyszer, hetente háromszor. 4) TAM kontrollcsoport: A TAM-ot normál sóoldattal hígítottuk, és 0,4 ml-t adtunk be intragasztrikusan, naponta egyszer, hetente ötször, ami 2,7 mg·kg-1·d-1-nak felel meg. A gyógyszereket 3 hétig adták mind a négy csoportban.

Mintavétel

A beadást követő 22. napon az egereket nyakcsigolyáik kimozdulásával leöltük, és lemértük. Ezután a daganat tömegét és a tüdőt vettük és lemértük. Az egér valós testtömege=a súlyozott testsúly – a daganat tömege. A tüdő felszínén lévő szürke csomókat, azaz a metasztázis fókuszokat szabad szemmel számoltuk meg. A tumortömeget 10 százalékos semleges formaldehid oldatba helyeztük rögzítés céljából, majd paraffin beágyazás, ultravékony metszet, immunhisztokémiai Envision kétlépéses feszítés, valamint VEGF, VEGFR, mikroerek számának (MVC) és mikroerek területének (MVA) meghatározása következett.

A daganat tömegének gátlási aránya

A tumorgátlási arány=(a kontrollcsoport átlagos daganattömege a kezelés után – a gyógyszeres csoport átlagos daganattömege a kezelés után)/a kontrollcsoport átlagos tumortömege a kezelés után × 100 százalék.

A tüdőmetasztázis gátlási aránya

A tüdőmetasztázis gátlási aránya=(átlagos tüdőáttét csomópontszám a kontrollcsoportban – átlagos tüdőáttét csomópontszám a gyógyszeres csoportban)/átlagos tüdőmetasztázis csomópontszám a kontrollcsoportban x 100 százalék.

Immunhisztokémiai Envision kétlépéses festés

A 4 μm-es paraffin metszetet vettük, majd a rutin paraffinmentesítést xilollal, a gradiens dehidratálást és a PBS-es mosást 5 perc x 3 alkalommal; a metszetet 0.01 mol/l, pH 6,0 citrát pufferbe merítettük, 98 °C-os mikrohullámú sütőbe tesszük 10 percre az antigénjavítás érdekében, majd szobahőmérsékletre természetes módon lehűtjük, miután kivettük belőle. mikrohullámú sütő; az első antitest csepegtetése (a fent említett antitest és a megfelelő antitest hígítása), 37 °C, 90 perc, mosás PBS-sel, 5 perc x 3-szor; Envasion második antitest csepegtetése, szobahőmérsékleten 60 percig, mosás PBS-sel, 5 perc x 3-szor; újonnan készített DAB színfejlesztő oldat csepegtetése, kifejlődési szín szabályozása mikroszkóp alatt 3-10 percig, kontrafestés 45 másodpercig campeachy-val, csapvízzel történő öblítés, szárítás fúvóval, szerelés semleges gumival. A barna-sárga vagy fekete-barna granulátum citoplazmájával rendelkező sejtet pozitívnak tekintettük. Az emlőrák ismert pozitív metszetét használták pozitív kontrollként, és azt, amelyben az első antitestet PBS-puffer helyettesítette, negatív kontrollként.

Képelemzés

ACE videokamerát (930 soros felbontású) és LEICAQ500W képelemzőt és LEICA teljesen automatikus képelemző rendszert használtak. Mikroszkóp x 200 alatt véletlenszerűen választottunk ki metszetenként 2 látóteret a VEGF vagy 3 látóteret a VEGFR és MVA meghatározásához, és minden csoportban kiszámítottuk a pozitív terület teljes látómező területéhez viszonyított százalékos arányát. . Az MVC meghatározásához minden metszetben 5 leggazdagabb vérerekkel rendelkező régiót választottunk ki mikroszkóp alatt x 100, majd x 400 alatt megszámoltuk a mikroereket minden látómezőben 5 átfedés nélküli régióból, és az átlagot használtuk. mint a daganat átlagos mikroér-számlálója (MVC).

Statisztikai módszer

Az arányok összehasonlítására az SPSS8.{1}} szoftvert, a khi-négyzet tesztet, az átlagok összehasonlítására t-próbát vagy egyirányú ANOVA-t használtunk.

EREDMÉNYEK

A Running II tumorgátló és metasztázis-ellenes hatásai tüdőáttéttel rendelkező TA2-t hordozó egerek MA-891-átültetett emlőrákjára

It was shown in Table 1 that the tumor weight inhibition rate was 37.3% in the Runing II group and 86.2% in the CTX control group, both tumor inhibition rates being >30 százalék, jelentős eltéréssel (mindkettő P<0.05) as compared with both tumor-bearing control group and TAM control group, indicating that both Runing II and CTX have a certain tumor-inhibiting effect. And there was a significant difference (P<0.05) between the Runing II group and the CTX control group in the tumor inhibition rate, indicating that the tumor-inhibiting effect of Runing II was lower than that of CTX. The lung metastasis inhibition rate was 65.4% in the Runing II group and 43.9% in the CTX control group, with significant difference (both P<0.05) as compared with a tumor-bearing control group and TAM control group, indicating that both Runing II and CTX have a certain tumor metastasis-inhibiting action. And there was a significant difference between the Runing II group and the CTX control group (P<0.05) in the lung metastasis inhibition rate, suggesting that the anti-metastasis action of Runing II is superior to that of CTX.

A Running II hatása a VEGF és VEGFR expresszióra MA{0}} TA2-t hordozó egerek transzplantált daganatában

Amint a 2. táblázatban látható, a VEGF és VEGFR expressziója mind a Running II csoportban, mind a CTX kontrollcsoportban szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a tumort hordozó kontrollcsoportban (P<0.05), with a significant difference between the two. In the Running II group, the VEGF and VEGFR expressions were not significantly different from those in the CTX control group (P>0.05), a VEGF expresszió szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a TAM kontrollcsoportban (P<0.05), and the VEGFR expression was similar to that in the TAM control group (P>0.05). In the CTX control group, the VEGF and VEGFR expression was lower than those in the TAM control group. In the TAM control group, the VEGF expressions were similar to that in the tumor-bearing control group (P>0,05), és a VEGFR expressziója alacsonyabb volt, mint a tumort hordozó kontrollcsoportban (P<0.05).

A II. futtatás hatása a transzplantált daganat MVA-jára és MVC-jére MA{0}}TA2-t hordozó egerekben

Amint a 3. táblázat mutatja, az MVA és MVC szintje a transzplantált rákban a gyógyszeres csoportokban szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a daganatos kontrollcsoportban (P<0.05); in the Running II group, the levels of MVA and MVC were significantly higher than those in the CTX control group (P<0.05), the level of MVC was lower than that in the TAM control group (P<0.05), and the MVA level was similar to that in the TAM control group (P>0.05).

VITA

A hagyományos kínai orvoslás azt vallja, hogy a daganatok keletkezése és kialakulása az idiopátiás és empatikus tényezők átfogó hatásának eredménye, de az előbbiekre nehezedő stressz hatására. Lu és Tang professzor egy korábbi klinikai tanulmányában úgy vélte, hogy a létfontosságú-qi hiánya, valamint az átjárók és a fogantatási erek belsejének diszharmóniája a daganat keletkezésének fő oka, és a rákkórokozók belső inváziója, mozgása és terjedése a fő feltétele a daganat kialakulásának. emlőrák növekedése és metasztázisa.6 Ezért a kezelés során a létfontosságú qi táplálását és a tömegek eltávolítását támogatják. A Running II egy kínai gyógynövény-formula, amelyet a sokéves klinikai gyakorlat foglalja össze a kezelési elv szerint: először a szervezet ellenálló képességét erősíti, másodsorban pedig a patogén tényezőket. A képletben a Sheng Huang Qi (Radix Astragali Mongolici), Tai Zi Shen (Radix Pseudostellariae), Gou Qi Zi (Fructus Lycii), Yin Yang Huo (Herba Epimedii) szuverén összetevők, amelyek kiegészítik a qi-t és táplálják a yint, szabályozzák. átjáró és fogantatási erek, amely megfelel az emlőrák általánosan tapasztalt jellemzőinek, mint például a qi és a yin hiányának, valamint az átjáró- és fogamzási erek diszharmóniájának. Klinikailag ez a formula azt a nyilvánvaló hatást éri el, hogy meghosszabbítja a túlélési időt, javítja az életminőséget, stabilizálja a daganatos fókuszt és megakadályozza a rák áttét kialakulását.

A jelen tanulmány létrehozta tüdőáttéttel rendelkező TA2 egerek emlőrák MA-891 sejttörzsből transzplantált daganatának modelljét, és megfigyelte a Running II hatását a szilárd tumor növekedésére és a tüdőáttétekre, és azt találta, hogy a tumorban jelentős különbségek vannak. gátlási arány és a tüdőmetasztázis gátlási arány a Running II csoport és a tumort hordozó csoport, valamint a Running II csoport és a CTX kontrollcsoport között, ami azt mutatja, hogy a Running II nyilvánvaló funkciója a tumornövekedés gátlása és az áttétképződés ellenes. Ezenkívül a tamoxifen (TAM) nem rendelkezik azzal a nyilvánvaló funkcióval, hogy gátolja a tumornövekedést és az áttétképzést a modell egerekben, mivel hasonló ahhoz az eredményhez, hogy az emlőrák MA-891 egy ER-sejt törzs, és a közvetlen hatásról szóló jelentés. alacsony koncentrációjú TAM külföldön.7

A daganat tipikus véredényfüggő betegség, növekedése, beszűrődése és metasztázisa az angiogenezistől függ. Ugyanakkor a neovaszkularizáció ismét metasztázis csatornát biztosít a tumorsejtek számára, kedvező feltételeket teremtve a daganat növekedéséhez, metasztázisához és diffúziójához. 8, 9 A VEGF egy pro-angiogén faktor, amely a legerősebb, egyedülálló és specifikus hatással van az ér endothel sejtekre, és számos tumorsejt képes VEGF-et kiválasztani, amely növeli az érpermeabilitást, és közvetlenül hat a vaszkuláris endotélsejtekre a VEGF receptorhoz való kötődés révén. serkenti osztódását és proliferációját, indukálja a tumor angiogenezisét és befolyásolja a mikroerek számát, elősegíti a daganat növekedését és áttét képződését.10,11 A legtöbb tumorsejtben magas a VEGF expresszió, míg a normál szövetekben csak kis számú szerv, mint pl. a vese, petefészek stb. magasabb VEGF-expresszióval rendelkezik. Emiatt egyes tudósok úgy vélik, hogy a VEGF felhasználható a tumor metabolizmusának és metasztázisának markereként12, és ideálisabb célpontja lehet a daganatok neoangiogenezisének blokkolásának,13 és megzavarhatja a daganatok vaszkuláris szabályozó tényezőit és azok ható kapcsolatát, szabályozva az angiogenezis faktorok expresszióját, és Az angiogenezis gátlása esetleg szabályozza a tumor növekedését és metasztázisát.

A jelen tanulmány eredményei azt mutatják, hogy a Runing II csökkentheti a VEGF és VEGFR expresszióját, hogy esetleg blokkolja a VEGF által kiváltott migráció és az endothelsejtek proliferációjának jelvezetését, és tovább gátolja az angiogenezist a daganatokban, ezáltal daganatellenes és metasztázis-ellenes hatást fejt ki. .

Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a rosszindulatú daganatok növekedési folyamatában a szövet túl gyors növekedése elkerülhetetlenül súlyos anoxiát váltott ki a helyi szövetekben, és az anoxia serkentheti a VEGF mRNS szintézisét és lelassíthatja a VEGF mRNS lebomlását, hogy indukálja a szövetek genezisét. nagyszámú lokális új kapilláris ér.14,15 Az immunhisztokémiailag pozitív festődésű sejtek megfigyelése során a szerzők nyilvánvaló VEGF-expressziót találtak a haldokló nekrotikus daganatsejtek citoplazmájában, ellenkezőleg, az aktív proliferációval rendelkező daganatsejtekben a VEGF expressziója kevésbé vagy egyáltalán nem , amely összefüggésbe hozható a tumorsejtek magasabb szintű anoxiát indukáló faktorával, a Talks KL és munkatársai jelentésének megfelelően.16 A Running II tartalmaz Dang Gui-t (ᔧᔦ Radix Angelicae Sinensis), E Zhu-t (Rhizoma Curcumae Phaeocaulis), Sheng Yi Yi Ren (Semen Coicis), Shan Ci Gu (Pseudobulbus Cremastrae) stb., amelyek aktiválják a vérkeringést, oldják a váladékot és eltávolítják a zavarosodást. Gátolják a VEGF szintézisét és szekrécióját, esetleg a daganat lokális mikrocirkulációjának javításán, a daganatsejtek oxigénellátásának fokozásán keresztül, ezáltal gátolják a daganat növekedését az áttétek elleni küzdelem érdekében.

IRODALOM

1. Folkman J. Angiogenesis és mellrák. J. Clin. Oncol. 1994; 12: 441-443.

2. Folkman J. Angiogenezis kutatás: laboratóriumtól klinikáig. Forum (Genova) 1999; 9: 59-62.

3. Potgens AJ. A vaszkuláris permeabilitási faktor expressziója befolyásolja a tumor angiogenezist a meztelen egerekre xenografált humán melanoma vonalakban. Am J. Pathol 1995; 5: 775-782.

4. Sauter ER, Nesbit M, Watson JC és mtsai. A vaszkuláris endothel növekedési faktor a fej és a nyak laphámsejtes karcinómáiban a tumor invázió és metasztázis piaca. Clin Cancer Res 1999; 5: 775-782.

5. Warren RS, Yuan H, Matli MR és társai. Vaszkuláris endothel növekedési faktor szabályozása hipoxiával. J. Biol. Chem. 1996; 271: 2746-2753.

6. Levy AP, Levy NS, Goldberg MA. A vaszkuláris endothel növekedési faktor poszt-transzkripciós szabályozása hipoxiával. J. Biol. Chem. 1996; 271: 2746-2753.

7. Talks KL, Turley H, Gatter KC, et al. A hipoxia által indukálható HIF-1 alfa és HIF-2 alfa faktorok expressziója és eloszlása ​​normál emberi szövetekben, rákos megbetegedésekben és tumorhoz kapcsolódó makrofágokban. Am J Pathol 2000; 157: 411-421.

For more information:1950477648nn@gmail.com