A Cistanche Deserticola különböző kivont részeinek hatása a Db / Db fekete egerek hipoglikémiás hatásaira Ⅱ

2 Kísérleti módszerek

2.1 Cistanche deserticola feldolgozott termékek elkészítése Cistanche deserticola:

Vegye ki a Cistanche deserticola gyógyászati ​​anyagokat, mossa le a szennyeződéseket, párolja edényben normál nyomáson 2 órán át, vágja 6 mm-re, és szárítsa meg 70 fokon. Cistanche deserticola: Vegyünk Cistanche deserticola főzetdarabokat, adjunk hozzá megfelelő mennyiségű rizsbort, jól keverjük össze, nedvesítsük 8 órán át (sárga rizsbor: víz=1:1), gőzöljük magas nyomáson 4 órán át, majd szárítsuk kb. 70 fok. (Használjon 30 ml rizsbort minden 100 g Cistanche deserticola-hoz).

TERMÉSZETES SZERVES CISTANCHE KIVONAT

A Wecistanche támogató szolgáltatása – Kína legnagyobb ciszterna exportőre:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel.:+86 15292862950

Vásároljon további specifikációkért:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

2.2 A Cistanche deserticola/Cistanche deserticola különböző kivont részeinek dúsítása

Vegyünk 30 g Cistanche deserticola/Tamarococcus deserticola port, adjunk hozzá 10-szeres mennyiségű vizet, melegítsük és forraljuk visszafolyató hűtő alatt kétszer, 2 órán keresztül, egyesítsük a kivonatokat, sűrítsük, adjunk hozzá etanolt, amíg az alkoholtartalom el nem éri a 60%-ot. alacsony hőmérsékleten 12 órán át, majd leszívással szűrjük. , a csapadék a nyers poliszacharid rész. A felülúszót megfelelő koncentrációra koncentráljuk, D101 makropórusos adszorpciós gyantára vigyük fel, majd sorban eluáljuk különböző koncentrációjú vízzel és etanollal. Gyűjtsük össze a vizes eluátumot, és csökkentett nyomáson koncentráljuk sűrű pasztává, amely a teljes oligoszacharid-frakció; 40%-os etanollal mossuk. Elfolyósítsuk, koncentráljuk és csökkentett nyomáson szárítsuk, ami a Cistanche deserticola teljes glikozidfrakciója.

2.3 A Cistanche deserticola/Cistanche deserticola különböző kivont részeinek tartalom meghatározása

2.3.1. A Cistanche deserticola/Cistanche deserticola teljes poliszacharid tartalmának meghatározása.

Mérje le a glükózmintát 20. 00 mg egy 50 ml-es mérőlombikban a 0 előállításához. 4 mg·mL-es -1 glükóz standard oldathoz pipettázzon 3, 4, 5, 6 és 7 ml-t egy 50 ml-es mérőlombikba, hígítsa fel térfogatra vízzel, és pipettázzon 2,0 ml-t. minden koncentrációgradiens glükózoldatot egy kémcsőbe. Vegyünk még egy azonos mennyiségű desztillált vizet vakkontrollnak, adjunk minden csőhöz 1 ml 5%-os fenolt, jól rázzuk össze, gyorsan adjunk hozzá 5 ml tömény kénsavat, hagyjuk állni 10 percig, tegyük 40 fokos vízfürdőbe. 15 percre, vegyük ki, gyorsan hűtsük le szobahőmérsékletre, és mérjük meg az abszorbancia értéket 490 nm-en, vegyük az abszorbanciát (A) az ordinátának és a glükózkoncentrációt (C) az abszcisszaként, rajzoljunk egy standard görbét, és kapjuk meg a regressziós egyenlet Y=8.37X-0.162 8 (R2=0.994 6). Pontosan mérjünk ki 1,0 g-ot a nyersanyagok és termékek összes poliszacharid porából, helyezzük 50 ml-es mérőlombikokba, adjunk hozzá vizet, hogy feloldódjon, és állítsuk be a térfogatot a jelig, szívjunk pontosan 2,0 ml-t egy kémcsőbe, és mérjünk ugyanabban. módszerrel, mint a standard görbe-előkészítési módszerrel. , ez az.

2.3.2 A Cistanche deserticola/Cistanche deserticola betain-tartalmának meghatározása

2.3.2.1. Összehasonlító oldat elkészítése:

Pontosan mérjünk ki 1,17 mg betain referenciaoldatot, tegyük egy 5 ml-es mérőlombikba, adjunk hozzá 50%-os metanolt, hogy feloldódjon és térfogatra hígítsuk, és kész is.

2.3. 2. 2 Kromatográfiás körülmények

A kromatográfiás oszlop Ecosil {0}}AMINO kromatográfiás oszlop (4,6 mm × 25{12}} mm, 5 μm), mozgófázis: acetonitril-víz (99,5 ∶ 0,5) , oszlophőmérséklet: 30 fok, detektálási hullámhossz: 194 nm, áramlási sebesség: 0,6 mL·perc-1, befecskendezési térfogat 10 μL, a kromatogram az 1. ábrán látható. 2.3.2.3 A vizsgálati oldat elkészítése pontosan a nyers és késztermékek teljes oligoszacharid frakciójának porát mérjük ki 1,0 g-ot, 5 ml-es mérőlombikba helyezve, desztillált vízzel feloldjuk és térfogatra hígítjuk, jól összerázzuk, átengedjük 0,45 µl mikroporózus szűrőmembránon, és már kész is.

2.3.2.4 Mintatartalom meghatározása

Pontosan abszorbeálja a teljes oligoszacharid vizsgálati oldatot nyers és elkészített Cistanche deserticolában, mérje meg a "2.3.2.2" pontban leírt feltételek szerint, és számítsa ki a minta betain tartalmát.

2.3.3 Az echinacoside, verbascoside és heterocimicifugarin tartalmának meghatározása a Cistanche deserticola/Cistanche deserticola esetében

2.3.3.1. Összehasonlító oldat elkészítése

Mérjünk be pontosan 4,50 mg echinakozidot, 4,80 mg verbaszkozidot és 5,05 mg heterológ komimicint 5 ml-es mérőlombikokba, adjunk hozzá 50%-os metanolt, hogy feloldódjanak és a jelig híguljanak, majd vegyünk minden kontrollt. Tegyünk 200 µl mintaoldatot az injekcióba. injekciós üvegbe, adjunk hozzá 400 μL 50%-os metanolt, és jól keverjük össze, hogy vegyes referenciaoldatot kapjunk, jól rázzuk fel, és kész is.

2.3.3.2 Kromatográfiás körülmények

A kromatográfiás oszlop Ecosil C18 (4,6 mm×250 mm, 5 μm), metanol az A-mozgófázis, 0,1% hangyasav a B-mozgófázis, gradiens elúció, {{ 12}}~45 perc, 30% A→ 70% A, az áramlási sebesség 1,0 ml·perc-1, az oszlop hőmérséklete 30 fok, a detektálási hullámhossz 330 nm, a befecskendezési térfogat 10 μL, és a kromatogram a 2. ábrán látható.

2.3.3.3. Vizsgálati oldat elkészítése

Pontosan mérjünk ki 1.0 g-ot a nyersanyagok és termékek összes glikozidporából, helyezzük 100 ml-es mérőlombikokba, adjunk hozzá 50%-os metanolt a feloldódáshoz, állítsuk be a térfogatot a jelig, majd rázzuk össze. jól. Minden mintából pontosan szívjon 5 ml-t egy 10 ml-es mérőlombikba, adjon hozzá 50%-os metanolt a térfogat kiegészítéséhez, jól rázza fel, és engedje át egy 0,45 μm-es mikroporózus szűrőmembránon.

2.3.3.4 Mintatartalom meghatározása

Vegyük le pontosan a Cistanche deserticola összes glikozid mintáját, és mérjük meg a „2.3.3.2” pontban leírt feltételek szerint. Számítsa ki az echinacoside, verbascoside és a heterológ cinkos tartalmát a mintában!

2.4 Az állatok csoportosítása, modellezése és gyógyszerbeadása

Az állatszobában 12 óra világos és 12 óra sötétség van, relatív páratartalom 50-70%, szobahőmérséklet 18-22 fok. A db/db fekete egereket és a db/m fekete egereket (normál kontrollcsoport) normál táppal etettük, és a kísérletet 9 hetes korban kezdtük. A normál kontrollcsoport kivételével a fennmaradó db/db fekete egereket véletlenszerűen választottuk ki vércukorszint és testtömeg alapján. 8 csoportra osztva: modellcsoport, pozitív kontrollcsoport, Cistanche deserticola teljes poliszacharid csoport, Cistanche deserticola teljes oligoszacharid csoport, Cistanche deserticola összes glükozid csoportja, Tartschistanche deserticola összes poliszacharid csoportja, Tarthouse deserticola teljes oligoszacharid csoport, Tartschistanco gluco sivatagi oldali csoport. Kivéve a normál vezérlést

A modellcsoport és a modellcsoport kivételével a többi csoportban lévő patkányok intragasztrikus adagolást kaptak 2 ml/100 g dózisban 4 egymást követő héten keresztül. A folyadék koncentrációja 4,1 g·kg-1 volt. A normál kontrollcsoportot és a modellcsoportot azonos módon kezeltük. Adjon egy bizonyos mennyiségű normál sóoldatot a gyomornak.

2.5 A Cistanche deserticola különböző kivont részeinek hatása db/db fekete egerek vércukorszintjére

2.5.1 Orális glükóz tolerancia (OGTT) teszt

26 napos beadás után 12 órán át koplaltak, és másnap 60 perccel a beadás után minden csoport fekete egerei 20 g·kg-1 glükózt kaptak. itt: 0, {{10}}.5, 1.0 és 2. .0 h farokvénából vettek vért a vércukorszint mérésére. A vércukorértéket az ordinátán, az időt pedig az abszcisszán feltüntetve vércukor változási diagramot készítettünk, és az egyes kísérleti csoportok vércukor-görbéjének vonala alatti területet a következő képlet szerint számítottuk ki (AUC, hmmoL·L{ {13}}) [19]. AUC=A × {{20}}.25 + B × 0.50 + C × 0.75 + D. A képletben: A, B, C és D a vércukorértékek 0, 0,5, 1,0 és 2,0 órában.

2.5.2 Az inzulinrezisztencia index és az érelmeszesedési index kiszámítása

Az inzulinrezisztencia indexet a szakirodalmi módszer szerint számítottuk ki [20]: HOMA-IR=Glükóz × Inzulin / 22. 5. HOMA - =20 × Inzulin / (Glükóz - 3.5) × 100%. Az IR az inzulinrezisztencia és (%) a -sejtfunkció. A glükóz moláris egysége mmoL·L{10}}

. Az inzulint mU·L-1 egységben adják meg. A glükóz és az inzulin mennyiségét éhgyomorra mérik. Az arterioszklerózis indexet (atherogenic index) a Zheng és munkatársai által leírt módszer szerint számítottuk ki. [21]. Számítási módszer: aterogén index=(TC-HDL-C) / HDL-C.

2.5.3 A Cistanche deserticola/Cistanche deserticola különböző extrahált részeinek hatása db/db fekete egerek szérumának INS-ére és HbA1c-jára

Vegye ki a fagyasztott szérummintákat, és melegítse szobahőmérsékletre, mielőtt INS és HbA1c enzimhez kötött immunoassay készlettel tesztelné őket. Szigorúan kövesse a készlet utasításaiban szereplő módszereket és lépéseket.

2.6 A Cistanche deserticola/Cistanche deserticola különböző kivont részeinek hatása a db/db fekete egerek máj oxidatív stressz szintjére

Vegye ki a fagyasztott szérummintákat, és melegítse szobahőmérsékletre, mielőtt MDA és SOD enzimhez kötött immunoassay készletekkel tesztelné őket. Szigorúan kövesse a készlet utasításaiban szereplő módszereket és lépéseket.

2.7 A Cistanche deserticola/Cistanche deserticola különböző extrahált részeinek hatása db/db fekete egerek májzsíranyagcseréjére

A patkányszérum TG-, TC-, HDL-C- és LDL-C-szintjét megfelelő kitekkel mértük. A konkrét mérési lépésekért lásd a készlet utasításait.

2.8 A Cistanche deserticola/Ratiana kámfor különböző kivont részeinek hatása az UA-ra, Cr-ra és mALB-re db/db fekete egerek plazmájában és vizeletében

Vegyen lefagyasztott plazma- és vizeletmintákat, és melegítse azokat szobahőmérsékletűre, mielőtt UA, Cr és mALB enzimhez kötött immunoassay kit teszteléséhez használná őket. Szigorúan kövesse a készlet utasításaiban szereplő módszereket és lépéseket.

2.9 Hasnyálmirigy- és vesepatológiás metszetek megfigyelése HE-festéssel

A 24 órán át 10%-os paraformaldehid fixálóban áztatott hasnyálmirigy- és veseszöveteket eltávolítottuk, desztillált vízzel mostuk és 70%-os etanolban tároltuk. A szövetmintákat eltávolítottuk, osztályozott etanollal dehidratáltuk, megtisztítottuk, paraffinba ágyaztuk, metszettek, majd hematoxilinnel és eozinnal megfestették (H&E festés). Miután a metszetragasztó megszáradt, nagy felbontású digitális képalkotó rendszerrel figyelje meg és készítsen fényképeket a metszetekről.

2.10 A veseszövet IV típusú kollagénjének meghatározása immunhisztokémiával

Az expresszióhoz a vesemetszeteket vízben viaszmentesítettük, majd antigénvisszanyerésnek vetettük alá. 10%-os kecskeszérummal blokkoltuk, és az elsődleges antitesttel 4 fokon egy éjszakán át inkubáltuk. Mosás után a másodlagos antitestet inkubáltuk. A jelenlegi megoldás a DAB volt a színfejlesztésre. A mosást, a dehidratálást és a lezárást optikai mikroszkóp alatt végeztük. Figyelje meg a IV-es típusú kollagén fehérje expresszióját a veseszövetben.

2.11 Statisztikai módszerek

A GraphPad Prism Version 5.01 (2007, GraphPad Software re inc) szoftver használata az adatok és az eredmények elemzéséhez

Az eredmény átlag±SEM Azt jelzi, hogy a két csoport közötti különbség egyirányú

ＡＮＯＶＡ( ｏｌｌｏｅｄｅＢｏｎｅｒｒｎｎ′ egy pár oszlopos teszt) módszer, P<0.05 is a significant difference and has statistical significance.