A flavonoidok bőrre gyakorolt ​​hatásai szerkezeti jellemzőik szerint: áttekintés

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtovábbi információért

Absztrakt:Háttér: A szívinfarktus (MI) során szívizomsejtek milliárdjai vesznek el. Az optimális terápia hatékonyan pótolja a sérült szívizomsejteket, esetleg olyan őssejtekkel, amelyek képesek beültetni és differenciálódni felnőtt funkcionális kardiomiocitákká. Mint ilyenek, a szív pitvari függelék őssejtek (CASC) megfelelő jelöltek. Az előrehaladott glikációs végtermékek (AGE-k) megnövekedett szintje azonban azokban a szívrégiókban, ahol CASC-ket transzplantálnak, befolyásolhatja regenerációs potenciáljukat. Ebben a tanulmányban azt vizsgáljuk, hogy az AGE-k megváltoztatják-e és hogyan változtatják meg a CASC-k tulajdonságait in vitro. Módszerek és eredmények: A tenyészetben lévő CASC-ket különböző AGE-koncentrációknak (50 ug/ml-től 400 ug/ml-ig) tették ki. A CASC-k túlélése, proliferációja és migrációs kapacitása szignifikánsan csökkent 72 órás AGE-expozíció után. Az apoptózis szignifikánsan megnövekedett az AGE-koncentráció növekedésével. Ezeknek az AGE-knak a káros hatásait részben tompították az AGE-receptorral (RAGE） inhibitor (25 µM FPS-ZM1）) való előzetes inkubáció, jelezve, hogy a RAGE részt vesz a megfigyelt negatív hatásokban. Következtetés: Az AGE-k idő- és koncentrációfüggő negatív hatással vannak a CASC-k túlélésére, proliferációjára, migrációjára és apoptózisára in vitro, részben a RAGE aktiváción keresztül. További vizsgálatot igényel, hogy az anti-AGE terápiák hatékony kezelést jelentenek-e az MI utáni őssejtterápia hátterében.

Kulcsszavak:őssejtek; aldehid-dehidrogenáz; CASC-k; glikált fehérjék; fejlett glikációs végtermékek; proliferáció; apoptózis; migráció; RAGE gátlás

1. Bemutatkozás

A szívkoszorúér-betegség (CHD) továbbra is a vezető halálozási és morbiditási ok világszerte, a szívinfarktus (MI) pedig a szívkoszorúér-betegség leggyakoribb formája [1]. A szívkoszorúér teljes vagy részleges elzáródása okozza. Az ischaemiás területen az oxigén és a tápanyagok korlátozottak, ami a szívizom sejthalálához vezet. Az infarktus mérete számos tényezőtől függ, például a veszélyeztetett ischaemiás terület méretétől, a koszorúér-elzáródás helyétől és időtartamától, valamint a maradék kollaterális véráramlás mértékétől [1,2]. Mivel a felnőtt szívizomsejtek minimális regenerációs tulajdonságokkal rendelkeznek, a sérült szövet belső helyreállítása továbbra is megfoghatatlan. Az elveszett szívszövet helyreállításának egyetlen módja egy olyan terápiás megközelítés megtalálása, amely hatékonyan helyettesíti a szívizom heget funkcionális összehúzódási szövettel.mennyi cistanche-t kell venniSok kutatási erőfeszítést tettek a csontvelősejtekkel (BMC) végzett sejtterápia terápiás lehetőségeinek és mechanizmusainak feltárására. A csontvelő hematopoietikus őssejteket (HSC), endothel progenitor sejteket (EPC) és mezenchimális őssejteket (MSC) tartalmaz [3]. A mononukleáris BMC-kkel és MSC-kkel végzett klinikai vizsgálatok nem eredményeztek jelentős javulást az MI utáni szívműködésben. Mivel a mononukleáris BMC-k és MSC-k nem differenciálódnak kardiomiocitákká, a megfigyelt korlátozott javulás valószínűleg a parakrin mechanizmusoknak tulajdonítható [4,5]. Az MI utáni szívműködés jelentős javítása érdekében a kutatás fókusza a rezidens szív őssejtek (CSC) felé tolódott el, mint például a c-kit plus, Sca-1 plus, Isl-1 plus -sejtek és a kardioszférák, akik valószínűleg előre programozva kardiomiocitákká válnak. Ennek ellenére a szív regenerációjában gyenge sikerük [6].

kérjük kattintson ide további információkért

Az elmúlt években kutatócsoportunk egy új típusú szív őssejteket fedezett fel, a szív pitvari őssejteket (CASC). Más őssejtekkel ellentétben a CASC-k rendkívüli kardiomiogén differenciálódási tulajdonságokat mutatnak, így ígéretes jelöltek a szív regenerációjára [4]. Ennek az őssejt-populációnak a pitvari függelékekből történő izolálása a magas aldehid-dehidrogenáz (ALDH) aktivitáson alapul. Magas ALDH-aktivitásról számoltak be többek között más őssejttípusokban is, például MSC-kben, HSC-kben, valamint idegi és rákos őssejtekben[7-9]. Mivel az ALDH kardioprotektívnek bizonyult, és elősegíti a sejtek túlélését stresszes körülmények között, az ALDH plusz őssejtpopuláció használata ischaemiás körülmények között ebben az összefüggésben előnyös lehet [4,10]. A CASC-k klinikailag releváns számig bővíthetők anélkül, hogy elveszítenék az alapvető jellemzőket, mint például az ALDH aktivitást, a felszíni antigén profilt és a kardiomiogén differenciálódási képességet [11]. Ez döntő fontosságú ennek a terápiás megközelítésnek a klinikára történő átültetéséhez. Ezen túlmenően kimutattuk, hogy az autológ CASC-transzplantáció javult a bal kamrai funkció, a megfelelő őssejt-beültetés és a CASC-k további differenciálódása következtében [4,12].

MI-betegeknél az előrehaladott glikációs végtermékek (AGE-k) szintje megemelkedik [13]Az AGE-k olyan fehérjék és/vagy lipidek, amelyeket visszafordíthatatlanul károsít a glikáció, amely folyamat során a redukáló cukrok nem enzimatikusan reagálnak a lipidekben vagy fehérjékben lévő aminocsoportokkal. . A glikáció mellett az oxidatív stressz a fehérjék és/vagy lipidek oxidációja révén AGE-képződéshez is vezet [14]. Az AGE-k endogén módon képződnek, és természetesen felhalmozódnak a szervezetben az öregedéssel vagy olyan kóros helyzetekben, mint például a szívinfarktus, amikor az oxidatív stressz szintje megnő [15-17].mi az a cistancheEzenkívül korábbi kutatások kimutatták, hogy az AGE-k különböző típusú őssejteket érintenek in vitro [18-20]. Az AGE-k csökkentik az őssejtek szaporodási képességét, és az AGE-k alkalmazásakor az apoptotikus sebesség megnő. Ezek a hatások többféle mechanizmuson keresztül is végrehajthatók, beleértve az apoptotikus útvonal aktiválását, a RAGE-t vagy a túlzott ROS képződést [20]. Továbbra sem ismert, hogy az AGE-k a CASC-k tulajdonságait is befolyásolják-e. Ezek az eredmények felvetik a kérdést, hogy az AGE-k negatívan befolyásolhatják-e az MI kezelésére használt CASC-k terápiás hatékonyságát. Ennek a tanulmánynak ezért az a célja, hogy megvizsgálja az AGE-k in vitro hatásait és a RAGE receptora potenciális aktiválását a CASCS proliferációjára, túlélésére és migrációjára.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Állatkísérletek

Az állatkísérleteket az EU 2010/63/EU állatkísérletekre vonatkozó irányelvével összhangban végezték, és a Helyi Állatkísérletek Etikai Bizottsága (UHasselt, Belgium, Diepenbeek; ID 201919K) jóváhagyta. Minden állatot szabályozott hőmérsékletű környezetben (21 fok, 60 százalékos páratartalom) tartottak 12 órás -12 órás világos-sötét ciklussal. Szokásos pellet diétával etettük őket, ad libitum vízzel. Összesen 62 nőstény Sprague-Dawley patkányt (Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, Franciaország) használtunk.

2.2. Patkány CASC-k elkülönítése és kiterjesztése

A CASC-ket a jobb pitvari függelékből gyűjtöttük be, a korábban leírtak szerint [4]Röviden, a patkányokat heparint fecskendeztek be (1000 egység/kg, intraperitoneálisan (ip), majd túladagolással elaltatták őket nátrium-pentobarbitál (Dolethal, Vetoquinol, Aartselar Belgium, 200 mg/kg, ip). A szíveket begyűjtöttük, normál Tyrode oldattal (137 mMNaCl, 5,4 mMKCl, 0,5 mMMgClz, 1 mMCaClz, 11,8 mM, Nase, 2-0 MglümM, 11,8 mM, Na-2 MPMM) perfundáltuk. pH 7,4), és a jobb pitvari függelékeket összegyűjtöttük.. Az extrahált jobb pitvar függelék szövetet ~1 mm³-es darabokra aprítottuk, foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) mostuk, és 30 percig Hank's Balanced Salt Solution oldatban enzimatikusan disszociáltuk. 0,6 WU/ml kollagenáz NB 4-et (Serva, Heidelberg, Németország) és 20 mM Carly-t tartalmaz.bioflavonoidokAz ALDHt sejteket az Aldefluor kit (STEMCELL Technologies, Evergem, Belgium) szerint festettük. Az ALDHt sejteket CASC-ként határozták meg, és áramlási sorrendben (BD FACS Aria) X-VIVO 15 tápközegben (Lonza, Basel, Svájc) 20% borjúmagzatszérummal (FCS) és 2% penicillin/sztreptomicinnel (P/S) egészítették ki. . Az izolált CASC-ket 6-lyuklemezekbe oltottuk 60,000 sejt/lyuk sűrűséggel, és 37 fokon inkubáltuk párásított inkubátorban 5 százalékos CO2 atmoszférával. A táptalajt 2-3 naponta cseréltük. Amikor a CASC-k elérték a 80 százalékos összefolyást, tripszinnel gyűjtötték be őket. Minden kísérlethez az 1. passzázs CASC-ket használtuk.

A Cistanche öregedésgátló hatású

2.3.AGEs előkészítés

Az AGE-ket a korábban leírtak szerint állítottuk elő [21]. Röviden, szarvasmarha szérumalbumint (BSA; 7 mg/ml) glikolaldehid dimerekkel (90 mM; Sigma-Aldrich, Diegem, Belgium) steril PBS-ben (pH 7,4) inkubáltunk 5 napon keresztül 37 °C-on. Ezt az oldatot PBS ellen dializáltuk kétszer 2 órán át, majd egy éjszakán át 4 fokon, hogy eltávolítsuk a reagálatlan glikolaldehidet (3,4 kDa küszöbérték. Az AGE-ket kiszűrtük (0,2 um szűrő, Sarstedt, Antwerpen, Belgium). A BSA-t PBS-ben (7 mg/ml) inkubáltuk. ) kontrolloldatként használták.

2.4. Szaporodási és túlélési vizsgálat

A proliferációs és túlélési vizsgálatokat propidium-jodid (PI) vizsgálattal végeztük, amint azt korábban Gervois és munkatársai leírták. valamint Lo Monaco és mtsai.[22,23]. Röviden, a CASC-ket 10% FCS-t és 2% P/S-t tartalmazó X-VIVO táptalajba oltottuk egy 96-lyuk lemezre. A proliferációs vizsgálatokhoz üregenként 5000 sejtet oltottunk be. A túlélési vizsgálatokhoz lyukanként 100 sejtet oltottunk be. 24 óra elteltével öt különböző körülményt adtunk a táptalajhoz: 400 ug/ml BSA-t, 50 ug/ml-t, 100 ug/ml-t, 200 ug/ml-t és 400 ug/ml AGE-t. A proliferáció mérésére BSA-t vagy AGE-ket adtunk 2% FCS-t és 2% P/S-t tartalmazó X-VIVO táptalajhoz.vegyél cistanche-tA túlélés mérésére BSA-t vagy AGE-ket adtunk az X-VIVO táptalajhoz 0 százalék FCS-vel és 2 százalék P/S-vel. Három különböző időpont (24, 48 és 72 óra) elteltével a tápközeget A100 lízispufferrel (ChemoMetec, Kaiserslautern, Németország) helyettesítették, majd azonos mennyiségű B stabilizáló pufferrel (ChemoMetec) PI-vel kiegészítve (10 ug/). ml, Sigma). Sötétben 15 perces inkubációs periódus után a fluoreszcenciát Fluostar Optima lemezleolvasóval (BMG Labtech, Ortenberg, Németország) mértük 540 nm-es gerjesztésnél, 612 nm-es emissziós hullámhossznál és 2000-es erősítésnél. három példányban. Az adatokat a 400 ug/ml BSA-val kapott adatokra normalizáltuk.

2.5. Migrációs vizsgálat

A CASC-ket egy {{0}}lyukú lemezre oltottuk 5000 sejt/lyuk sűrűséggel X-VIVO tápközegben, 10% FCS-t és 2% P/S-t. Öt körülményt adtunk a táptalajhoz: 400 ug/ml BSA, 50 ug/ml, 100 ug/ml, 200 ug/ml és 400 ug/ml AGE. 72 órás inkubációs periódus után a kondicionált CASC-ket tripszin segítségével gyűjtöttük össze, és transzwell migrációs vizsgálathoz használtuk. A 8 um pórusméretű porózus membránnal rendelkező ThinCertsben (Greiner Bio-One, Vilvoorde, Belgium) állapotonként 100 000 sejtet oltottak be 0% FCS-t és 2% P/S-t tartalmazó X-VIVO táptalajba. A ThinCerteket 2 százalék FCS-t és 2 százalék P/S-t tartalmazó X-VIVO táptalajt tartalmazó 24-lyuk lemezekre helyeztük. 24 órás migráció után a ThinCerteket 4 százalékos paraformaldehiddel (PFA) fixáltuk 15 percig, és 0,1 °C-on inkubáltuk. százalékos kristályibolya 30 percig. A nem vándorolt ​​sejteket eltávolítottuk a ThinCerts felső oldalán, majd a transzmigrált CASC-k mennyiségét AxioVision 4.6 szoftverrel (Carl Zeiss, Zaventem, Belgium) számszerűsítettük. Az adatokat a 400 ug/ml BSA-val kapott adatokra normalizáltuk.

2.6. Apoptózis vizsgálat

A CASC-ket 2% FCS-t és 2% P/S-t tartalmazó X-VIVO tápközegben 96-lyuklemezbe oltottuk 10,00 sejt/lyuk sűrűséggel. Az apoptózis vizsgálatához kaszpáz vizsgálatot végeztünk az IncuCyte8 Caspase{7}}/7 Green Apoptosis Assay Reagent (1/100 arányban hígított, Sartorius, Schaarbeek, Belgium) felhasználásával. Öt körülményt adtunk a táptalajhoz: 400 ug/ml BSA, 50 ug/ml, 100 ug/ml, 200 ug/ml és 400 ug/mL AGE-t. FCS és 2 százalék P/ nélküli X-VIVO tápközegben tenyésztett CASC-k. Az S-t pozitív kontrollként alkalmaztuk. A kísérleteket három párhuzamosban végeztük. A képeket 24, 48 és 72 órás inkubáció után készítettük az IncuCyte@S3Live-Cell Analysis System (Sartorius, Schaarbeek, Belgium) segítségével. Az apoptotikus sejtek által elfoglalt terület elemzését IncuCyte* SX1 Live-Cell Analysis System (Sartorius, Schaarbeek, Belgium) segítségével végeztük. Az adatokat a pozitív kontrollra normalizáltuk (plusz X-VIVO tápközeg FCS nélkül).

2.7. In vitro RAGE gátlás

A RAGE-t gátolta, hogy felmérje a RAGE aktiválásának hozzájárulását a CASC-k proliferációjához, túléléséhez és migrációjához. Röviden, a CASC-ket 37 fokon előinkubáltuk 5 százalékos CO2 inkubátorban a RAGE antagonista FPS-ZM1-gyel (10 és 25 uM, Calbiochem/Merck, Overijse, Belgium). 2 órás előinkubálás után 400 ug/ml AGE-t adtunk hozzá.cistanche Ausztrália24 48 és 72 óra elteltével a proliferációt és a túlélést a fent leírtak szerint értékeltük. 72 órás inkubáció után az előkondicionált CASC-ket összegyűjtöttük, és a fent leírt módon transzwell migrációs vizsgálathoz használtuk.

2.8.Statisztikák

A statisztikai elemzéseket a GraphPad Prism 9.0.0 szoftverrel végeztük.cisztanchAz adatok normál eloszlását Shapiro-Wilk teszttel értékeltük. A normál eloszlású adatokat ismételt mérésekkel egyutas ANOVA tesztnek vetettük alá, majd Holm-Sidak többszörös összehasonlítási tesztjét. Ha az adatok nem voltak normálisan elosztva, a nem-paraméteres Friedman-tesztet, majd a Dunn-féle többszörös összehasonlítási tesztet alkalmaztuk. Az összes adatot átlag ± átlag hibája (SEM) formájában fejezzük ki. A p értéke<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Eredmények

3.1. Az AGE-s expozíció negatívan befolyásolja a CASC-k elterjedését és túlélését

Amint az 1. ábrán látható, az AGE-k jelentősen és fokozatosan csökkentették a CASC-proliferációt az idő múlásával. Az AGE-k negatív hatása a CASC-k proliferációjára szintén koncentrációfüggő volt. 72 óra elteltével a 100 ug/ml, 200 ug/ml és 400 ug/ml AGE-k koncentrációja szignifikánsan csökkentette a CASC-k proliferációját a BSA-hoz képest (1C. ábra; 80% ±7n100 ug/ml, 74% ±3in 200 ug/ml). és 65 százalék ±4 400 ug/ml AGE-ban). A BSA alkalmazása önmagában nem befolyásolta a CASC-k proliferációs kapacitását (Sl ábra a kiegészítő anyagokban). Amint a 2. ábrán látható, az AGE-k növekvő koncentrációja negatívan befolyásolta a CASC túlélését időben. Az AGE-k szignifikáns hatásait 48 (2B. ábra) és 72 óra elteltével figyelték meg (2C. ábra; 85% ±3 100 ug/ml-ben, 73% ±3 200 ug/ml-ben és 64% ±4 400 ug/ml AGE-ban) .A BSA alkalmazása önmagában nem befolyásolta a CASC-k túlélési kapacitását (S1 ábra).

3.2. Megnövekedett AGE-koncentráció Növeli a CASC-ek apoptózisát

A különböző AGE-koncentrációk (50, 100, 20 és 400 ug/ml) CASC-apoptózisra gyakorolt ​​hatásának tisztázására kaszpáz vizsgálatot végeztünk. A 3/7 kaszpázt expresszáló sejtek százalékos arányát különböző időpontokban mértük: 24 (3A. ábra), 48 (3B. ábra) és 72 (3C. ábra) óra. Az apoptotikus sebesség az idő múlásával fokozatosan nőtt az AGE-k koncentrációjának növekedésével (3C. ábra, 72 óra; 77% ±17 400 ug/ml AGE-ban vs. 18% ±3 BSA-ban).

3.3. AGEs expozíció csökkenti a CASC-k migrációs kapacitását

A CASC-k migrációs kapacitását transzwell migrációs vizsgálattal értékeltük 72 órás inkubáció után, különböző koncentrációjú AGE-kkel. Az 4-E. ábrán a CASC-k migrációjának reprezentatív példái láthatók BSA-val és különböző AGE-koncentrációkkal (50, 100, 200 és 400 ug/ml) végzett inkubáció után. A migráció számszerűsítését a 4F ábra mutatja. A BSA-val összehasonlítva a migráció szignifikáns csökkenése volt megfigyelhető, amikor a CASC-ket 400 ug/ml AGE-vel inkubáltuk (4E. ábra, F; 75% ±5%-ban 400 ug/ml AGE-vel).

3.4. A CASC-ben lévő AGE-k káros hatásait a RAGE aktiválása közvetíti

A RAGE aktivációnak az AGE-k megfigyelt káros hatásaihoz való hozzájárulásának értékelésére a CASC-k proliferációját, túlélését és migrációját értékeltük a RAGE antagonista FPS-ZM1-gyel végzett inkubáció után. A 400 ug/ml AGE-nek való kitettség előtt a CASC-ket 2 órán keresztül előinkubáltuk 10 vagy 25 uM FPS-ZM1-gyel. Az FPS-ZMl önmagában (10 és 25 uM) alkalmazása nem befolyásolta a CASC-k proliferációs kapacitását vagy túlélését (S2 ábra). A CASC-proliferációt (5A-C. ábra) 24 (A), 48 (B) és 72 (C) óra után értékeltük. Amint az 1. ábrán látható, az AGE-k által a CASC-k proliferációjára gyakorolt ​​negatív hatás jelentősen tompul a 25 uM FPS-ZM1-gyel végzett előinkubálás után (5A-C. ábra). Valójában 24 és 48 óra elteltével a CASC-k proliferációja szignifikánsan javult, 400 ug/ml AGEs expozíció mellett (24 óra, 5A ábra; 104% 士8 25 μM FPS-ZM1-ben vs.79% ±5 400 ug/ml AGE-ban); 48 óra, 5B. ábra; 95% ±5 hüvelyk 25 μM FPS-ZM1 vs.70% ±4 hüvelyk 400 ug/ml AGEs）. 72 óra elteltével ugyanez a tendencia volt megfigyelhető. A proliferáció javult a RAGE gátlásakor (ábra: 80% ±8in25μMFPS-ZM1 vs.67% ±5in 400 ug/ml AGEs, p{57}}.06). A túlélést (6A-C. ábra) 24 (A), 48 (B) és 72 (C) óra után értékeltük. Az AGE-k negatív hatása a CASC-k túlélésére (2. ábra) szignifikánsan javult 25 µM FPS-ZM1-gyel végzett előinkubálás után (6A-C. ábra). 24 óra elteltével a túlélés jelentősen javult (6A. ábra; 104 százalék ±7 25 µM FPS-ben). ZM1 vs. 91% ±4 400 ug/ml AGES esetén. Ez a tendencia 48 óra elteltével is megfigyelhető (6B. ábra; 91% ±5 a 25 μM FPS-ZM1-ben vs.81% ±5 in 400 ug/mL AGES,p =0.07). A CASC-k vándorlására 72 órás, 400 ug/ml AGE-vel és FPS-ZMl-lel végzett inkubáció utáni reprezentatív példákat az ábra mutatja be, és számszerűsítjük az ábrán. A CASC-k 25 uM FPS-ZMI-vel történő előinkubálása megakadályozhatja az AGE-expozícióval megfigyelt csökkent CASC-migrációs kapacitást ( 7B. ábra: 98 százalék ±6 25 uM FPS-ZM1-ben vs.7 százalék ±8 in 400 ug/ml AGEs, p{108}}.07）.

4. Megbeszélés

Vizsgálatunk az első, amely kimutatta, hogy az AGE-k befolyásolják a CASC-k tulajdonságait, nevezetesen a túlélést, a proliferációt, a migrációt és az apoptózist in vitro. Adataink azt mutatják, hogy ezeket a hatásokat részben a RAGE aktiválása közvetíti dózisfüggő módon.

4.1. Az AGE-k szerepe a szívinfarktusban

A keringési AGE-szintek szignifikánsan megemelkednek az akut MI-ben szenvedő betegeknél [24,25] Azonban továbbra sem világos, hogy miként vesznek részt az MI patofiziológiájában. A reaktív oxigénfajták (ROS) a fő szerepet játszanak az AGE-k szintézisében. Az oxidatív stressz reaktív karbonilvegyületek képződését és az Amadori termékek glioxidációját idézheti elő a Maillard-reakcióban. Mint ilyenek, az AGE-k visszafordíthatatlanul képződnek és halmozódnak fel a szívben MI után, és úgy gondolják, hogy potenciálisan tovább rontják a káros szívfenotípust [26,27]. Ezenkívül a neutrofilek és az aktivált makrofágok, amelyek részt vesznek az MI gyulladásos folyamatában, jelentős mértékben hozzájárulnak az AGE-szintézishez [28, 29]. Ezek az immunsejtek AGE-ket szekretálnak, és az AGE-k képződésének kulcsfontosságú indukálóiként szerepelnek MI-ben. 4.2. Az AGE-koncentrációk élettani jelentősége

Vizsgálatunkban az AGE-k koncentrációinak széles tartományát teszteltük (50-400 ug/mL). Az AGE-k őssejtekre gyakorolt ​​hatását vizsgáló más in vitro vizsgálatokban használt AGE-koncentráció 15-500 ug/ml 【20】 között van. Az alkalmazott koncentrációk között jelentős eltérések mutatkoznak, de a magasabb AGE-szintek általában a többféle betegségben szenvedő betegek fiziológiás plazmaszintjét tükrözik. Valójában az AGEs-albumin koncentrációja cukorbetegeknél 50 és 400 ug/ml között mozog[30]. Az AGE-szintek akár 200 ug/ml-re is emelkedhetnek szív- és érrendszeri betegségekben szenvedő betegeknél [31,32]. Korai stádiumú Alzheimer-kórban szenvedő betegeknél a nanoméretű tartományban alacsonyabb AGE-koncentrációról is beszámoltak [33]. Az AGE-k mérésére használt különböző analitikai módszerek és a különböző típusú AGE-k heterogenitása miatt azonban a megbízható AGE-koncentrációk in vivo becslése technikailag továbbra is kihívást jelent, és valószínűleg alulbecslés [34].

4.3. Az AGE-k negatív hatással vannak a CASC-k tulajdonságaira

Még ha a CASC-transzplantáció ígéretes potenciált mutat is a szívinfarktus utáni regenerációban, a sejtek túlélése és regenerációs képessége továbbra is probléma. Az ischaemiás területekről ismert, hogy ellenséges környezet, ahol megnövekedett oxidatív stressz, gyulladás és fibrózis, valamint megnövekedett AGE-szintek szövetekben. Nem ismert, hogy az AGE-k befolyásolják-e a CASC-k regenerációs képességét, de fontos tudás lehet a szív regenerációjával és a CASC-k ígéretes regenerációs kapacitásával összefüggésben[12]. Tanulmányunkban kimutattuk, hogy az AGE-k rontják a CASC-k túlélését, proliferációját és migrációját in vitro. koncentráció- és időfüggő módon. Ezenkívül az AGE-knak való kitettség a CASC-apoptózis fokozatos növekedéséhez vezet. Adataink egybecsengenek az AGE-k hatását vizsgáló tanulmányokkal több más típusú őssejtekre, amelyekben a proliferációs kapacitás megváltozik és az apoptózis fokozódik [20]. Valójában Zhu és munkatársai szignifikáns csökkenést mutattak ki az EPC-k proliferációjában az AGE-k különböző koncentrációinak való kitétele után[16]. Ugyanezt a hatást értékelték Sun et al. EPC-kben is, ahol az apoptotikus ráta növekedését a p38 MAPK útvonal aktivációja közvetítette [35]. Az AGE-nek kitett NSC-k az őssejt-proliferáció dózisfüggő csökkenését eredményezték, a PPARy útvonalon keresztül [36]. A zsírszövetből származó őssejtekben (ADSC-k) a kaszpáz 3 aktiválásának növekedése megnövekedett apoptotikus arányhoz vezet [37]. Yang et al. alacsonyabb proliferációs és migrációs kapacitásokról számoltak be MSC-kben, AGE-koncentráció-függő módon. Ezt a hatást a túlzott ROS-termelés közvetítette[18]. Azt még meg kell határozni, hogy a CASC-kre, egy nagyon eltérő, szív eredetű őssejtpopulációra gyakorolt ​​káros hatások a túlzott ROS-termelésen keresztül is közvetíthetők-e.

Kimutatták, hogy azok a mögöttes mechanizmusok, amelyekben az AGE-k negatív hatást fejtenek ki a szervműködésre, a RAGE receptor aktiválásától függenek és/vagy függetlenek [15]. Számos őssejttípuson végzett tanulmányok azt mutatják, hogy az AGE-k hatásait főként a RAGE vagy más apoptotikus útvonalak aktiválásán keresztül közvetítik[20]. Az AGE-k általi RAGE aktiváció a MAPK aktiválását okozza, ami a JNK és a p38 foszforilációjához vezet] Ezek a foszforilált fehérjék fokozzák a különböző pro-apoptotikus transzkripciós faktorok transzkripcióját a sejtmagban, ami az apoptózis növekedéséhez vezet. Emellett a kaszpáz útvonalak aktiválódhatnak, ami AGE-k által kiváltott apoptózist okoz[39]. Továbbra is nyomon követési vizsgálatokra van szükség azoknak a molekuláris mechanizmusoknak a feltárásához, amelyek révén az AGE-k downstream hatásait kiváltják a CASC-kben. Azonban kimutattuk, hogy az FPS-ZM1 általi RAGE-blokkolással az AGE-k megfigyelt hatásai a CASC-kre tompultak. Ezért adataink erősen azt mutatják, hogy az AGE-k a CASC-kre gyakorolt ​​hatásukat valószínűleg a RAGE kötődésén és aktiválásán keresztül közvetítik. Hogy a Jak/STAT, a PI3K/Akt, a MAPK, a túlzott ROS-termelés vagy más jelátviteli útvonalak érintettek-e, még további azonosítás szükséges. Adataink összhangban vannak Zhang és munkatársai által leírt munkával is, ahol az FPS-ZMl szintén megfordította az AGE-k negatív hatásait az ADSC-kben a RAGE blokkolásával, ami tovább erősíti a RAGE aktiválásának fontos szerepét az általa okozott káros hatások közvetítésében. AGE-k[40].

4.4. A szív- és érrendszeri betegségek anti-AGE terápiáinak jövőbeli perspektívái és jelenlegi korlátai

Az anti-AGE terápiák alkalmazásának in vivo megerősítését és azok potenciális hozzáadott értékét az MI utáni őssejt-transzplantációhoz állatmodellben kell megerősíteni, mielőtt ezt a klinikára fordíthatnák. Számos in vitro vizsgálat kimutatta, hogy a PPARy inhibitor roziglitazon [41,42], MAPK inhibitorok [18,35,43] vagy antioxidánsok [4] mérsékelhetik az AGE-k által közvetített hatásokat az őssejteken. Az őssejt-transzplantációval kombinált in vivo terápiás beavatkozásként való hatásukat azonban ez idáig soha nem vizsgálták. Számos stratégia létezik az AGE-szint csökkentésére a szervezetben. A piridoxamin (PM) gátolja az AGE-k képződését azáltal, hogy csökkenti az Amadori-ból AGE-vé való átalakulást, és megköti a karbonilvegyületeket. A PM-kezelés hatékonyságát és biztonságosságát cukorbetegekkel végzett klinikai vizsgálatok igazolták [45]. A NephroGenex 2014-es klinikai vizsgálatát, amelyben a Pyridorin [(azaz PM) antidiabetikus terápiaként tesztelték, azonban pénzügyi problémák miatt leállították [46]. Jelenleg egyetlen más klinikai vizsgálat sem vizsgálja a PM-et terápiaként. Az AGE-k képződésének PM-el történő gátlása azonban stratégia lehet az őssejtpotenciál javítására szívregenerációs célokra. Ezenkívül a jövőben az AGE-k képződésének más gátlóit, például az aminoguanidint is alkalmazni lehetne az AGE-szintek csökkentésére MI után. Az ACTION II klinikai vizsgálat kimutatta az aminoguanidin hatásosságát cukorbetegeknél. Míg az aminoguanidin nem tudta jelentősen csökkenteni az elsődleges végpontot, vagyis a maximális szérum kreatininszint eléréséhez szükséges idő megkétszerezését ezeknél a betegeknél, a cukorbetegség szövődményeire gyakorolt ​​egyéb klinikailag fontos hatásokat is kimutattak, mint például a proteinuria és a keringési lipidkoncentráció csökkenése. Azonban a visszafordítható káros hatások miatt, mint például az autoantitestek indukciója, az influenzaszerű tünetek és a vérszegénység, ezt a vizsgálatot leállították, és a klinikára történő transzláció korlátozott maradt [47, 48]. Ezenkívül az antioxidánsok, például az N-acetil-L-cisztein (NAC) vagy a glutation étrend-kiegészítőként történő alkalmazása jótékony hatással lehet az őssejtterápiára, mivel növelik a genom stabilitását, javítják az adhéziót és serkentik az őssejt-proliferációt. 49]. A sejtspecifikus hatások azonban különböznek az őssejttípusonként, és dózis-válasz klinikai vizsgálatokra van szükség a terápiás hatékonyságuk értékeléséhez, ha őssejt-transzplantációval kombinálják őket. Egy másik lehetőség az AGE-k lebontása ALT-71 terápiával. Az ALT-711 képes lebontani a szén-szén kötéseket a karbonilcsoportok között, ezáltal megszakítja a keresztkötéseket az AGE-molekulákban. Számos klinikai vizsgálat azonban nem tudta megerősíteni az ALT-711 állatkísérletekben megfigyelt jótékony hatásait. Továbbá, a RAGE inhibitorai (mint az FPS-ZM1) vagy a RAGE útvonal downstream molekuláinak inhibitorai interferálhatnak az AGEs/RAGE sejt jelátviteli tengelyében, ezáltal blokkolva az AGE-k által közvetített hatásokat az őssejtekben. A különböző típusú kismolekulák és inhibitorok hatékonyságát az AGE-k blokkolására az őssejtekben számos in vitro kísérletben igazolták [18, 35, 44], de állatmodelleken soha nem tesztelték. Ezért csak feltételezhetjük, hogy ezek az inhibitorok hatékonyan blokkolják az AGE-ket in vivo helyzetben, de bizonyíték-koncepciós kísérletekre van szükség. Végül egy másik lehetőség az AGE-k blokkolására az őssejtterápiával kombinálva maguknak az őssejteknek a genetikai módosítása. Az sRAGE túlzott expressziójáról ismert, hogy fokozza az AGE-k (és más RAGE-ligandumok, például az amiloid-) megkötését a sejtterápia hatékonyságának javítása érdekében. Ezt kimutatták az sRAGE-t kiválasztó MSC-kben Alzheimer-kór [50,51], ízületi gyulladás [52] és Parkinson-kór [53] terápiájaként. Az sRAGE-t szekretáló MSC-k tovább éltek, fokozott migrációs kapacitással rendelkeztek, jobban védettek az apoptózissal szemben, és gyulladásgátló tulajdonságokkal rendelkeztek. Ezenkívül a RAGE leszabályozása, ezáltal az őssejtek AGE-k iránti érzéketlenítése, lehetőség lehet a sejtek működésének javítására. Azt még vizsgálni kell, hogy ezek a stratégiák alkalmazhatók-e az MI és a szívjavítás felállítására is. Összefoglalva, ezek a stratégiák az AGE-k leküzdését célozzák az őssejt-funkcionalitás és -megtartás javítása érdekében. Ezek a terápiás lehetőségek azonban hipotetikusak maradnak, és in vivo vizsgálatot kell végezni CASC-terápiával kombinálva, mielőtt a klinikai környezetbe átültetnék őket. 5. Következtetések

Megállapítottuk, hogy az AGE-k idő- és koncentrációfüggő, fokozatos hatást gyakoroltak a CASC-k tulajdonságaira, növelve az apoptózist, valamint csökkentve a túlélést, a proliferációt és a migrációt in vitro. Az e hatások mögött meghúzódó működési mechanizmusok további vizsgálatra szorulnak, bár kimutattuk, hogy a RAGE aktiváció fontos szerepet játszik ezekben az AGE-kkal kapcsolatos negatív hatásokban. Tovább kell vizsgálni, hogy az AGE-k in vivo megcélzása javíthatja-e a CASC-k terápiás kapacitását MI után.

Ez a cikk J. Clintől származik. Med. 2021, 10, 2964. https://doi.org/10.3390/jcm10132964 https://www.mdpi.com/journal/jcm