A perfluor-oktánsav hatása a bélmikrobiótára és a mikrobiális metabolitokra C57BL/6J egerekbenⅡ
Nov 28, 2023
2. Anyagok és módszerek
2.1. Állatok
Négy hetes, specifikus patogénmentes C57BL/6J hím egereket a Jackson Laboratorytól (Bar Harbor, ME, USA) vásároltunk. Az egerek ad libitum fogyasztottak ivóvizet. A Georgiai Egyetem állattartó létesítményét 22 ◦C-on és 40–70%-os páratartalom mellett tartották, 12:12 órás fény-sötét ciklus mellett. A PFOA expozíciós kísérlet előtt öt egeret helyeztek el egy ketrecben, és az egerek véletlenszerűen ketreceket cseréltek hetente egyszer négy héten keresztül. A PFOA expozíció akkor kezdődött, amikor az egerek nyolc hetesek voltak, és az expozíciós időszak négy hétig tartott. A kísérlet elején az egereket véletlenszerűen besorolták a PFOA expozíciós csoportba vagy a kontrollcsoportba (minden csoportban n=10 egér), egy egeret egy ketrecben. A PFOA-t (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ivóvízzel adtuk be egereknek. A PFOA végső koncentrációja az ivóvízben 1 ppm (ppm) volt. Az adagot korábbi vizsgálatunk alapján választottuk ki [24]. A kontroll egerek ivóvizet fogyasztottak PFOA hozzáadása nélkül. Az állatkísérletet a Georgiai Egyetem Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá (protokollkód: A2014 10-014-Y2-A1).
KATTINTS A székrekedés otthoni gyógymódjaira
2.2. Metabolit kivonás
A metabolitok extrakcióját a korábban leírtak szerint végeztük [25]. Röviden, minden szérummintából 20 µl-t extraháltunk 225 µl metanollal. A mintákat 10 másodpercig vortexeltük. Ezután 750 µl metil-terc-butil-étert (MTBE) és 188 µl vizet adtunk a fenti mintákhoz a fázisszétválás indukálására. A mintákat 4 ◦ C-on 6 percig ráztuk, majd centrifugáltuk 14,000× g-vel 2 percig. Az extrakciós oldószert gáztalanítottuk, és –20 ◦C-ra előhűtöttük. A felső, nem poláris fázist (350 µl) összegyűjtöttük és teljesen szárazra pároltuk egy Labconco Centrivap hidegcsapda koncentrátor (Labconco, Kansas, MO, USA) segítségével. Máj- és székletminták esetén minden minta 10 mg-jához 225 µl metanolt és 750 µl LMTBE-t adtunk. A mintákat aGenoGrinder 2010 (SPEX SamplePrep, Metuchen, NJ, USA) segítségével 1500 ford./perc sebességgel homogenizáltuk 30 homokon, majd vortexeltük és 4 ◦C-on 6 percig ráztuk. Ezután 188 µl vizet adtunk a mintákhoz, majd centrifugáltuk 14,000× g-vel 2 percig. A felső nem poláris fázist (350 µl) összegyűjtöttük, és teljesen szárazra pároltuk. A szárított mintákat ezután 60 µl 4:1 arányú acetonitrilben és vízben (v/v) belső standardokkal újraszuszpendáltuk. A mintákat vortexeltük, majd 5 percig ultrahanggal kezeltük, majd 14,000 × g-vel centrifugáltuk 2 percig. A felülúszót összegyűjtöttük LC-MS analízishez.
2.3. Nem célzott metabolizmus profilalkotás
A nem célzott metabolomikai profilalkotást a korábban leírtak szerint végeztük [25]. A Vanquish UHPLC rendszert (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) használták a metabolitok szétválasztására Acquity UPLC BEH Amide oszloppal (150 mm × 2,1 mm × 1,7 µm), amely egy Acquity VanGuard BEH Amide előtéthez volt csatlakoztatva. oszlop (5 mm × 2,1 mm × 1,7 µm, Waters, Milford, MA, USA). LC-MS minőségű víz (100%) 10 mM ammónium-formiáttal és 0,125% hangyasavval (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO Eközben 95:5 arányú acetonitril: víz (v/v), amely 10 mM ammónium-formiátot és 0,125 % hangyasavat tartalmazott B mobil fázisként. A gradiens 100 % B-vel kezdődött 0-nál 2 perc, 70% Bat 7,7 perc, 40% B 9,5 percnél és 30% B 10,25 percnél, majd 100% B 12,75-16,75 percnél. Az áramlási sebességet 0,4 ml/perc értéken tartottuk. A spektrumokat electrospray ionization (ESI) pozitív módban gyűjtöttük Q-Exactive HF (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) alkalmazásával. A tömegtartományt m/z 60 és 900 között állítottuk be egy adatfüggő móddal az MS/MS spektrumgyűjtéshez. A nem célzott metabolomikai nyersadatokat először ABF-fájlokká konvertálták az ABF konverter segítségével (https://www.reifycs.com/AbfConverter/ (2022. július 6-án érhető el)). A metabolitok azonosítására és mennyiségi meghatározására az MSDIAL 5.1.0.1-es verzióját használták [26]. A Mass Spectral Feature List Optimizer (MS-FLO) segítségével javították a tulajdonságlisták minőségét a jellemzők megjelölésével a további adatkezelés érdekében [27]. Retenciós idő m/z könyvtárakA metabolitok azonosítására a MassBank of North America Fiehn HILIC MS/MS spektrum adatbázisait használtuk.
2.4. 16S rRNS génszekvenálás
A teljes DNS-t a székletmintákból a PowerSoil® DNS izolációs készlettel (MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, USA) extraháltuk a gyártó utasításait követve. Az 515F és 806R primereket a 16S rRNSgén V4 régiójának amplifikálására használtuk, majd normalizálással és vonalkódolással. A DNS-t az IlluminaMiSeq v2 kittel szekvenáltuk 500 ciklussal. A 16S rRNS gén szekvenálási adatait a Quantitative Insights in Microbial Ecology (QIIME) II [28] segítségével elemeztük. Röviden, a nyers szekvenálási adatokat a DADA2-n keresztül denomináltuk, majd az operatív taxonómiai egység (OTU) kiválasztása következett. Adatbázisként a SILVA-t (138-as verzió), amelyet a scikit-learn Naïve-Bayes-alapú osztályozó fejlesztett ki.
2.5. Statisztikai analízis
Lineáris diszkriminanciaanalízis hatásméretet (LEfSe) alkalmaztunk azon baktériumnemzetségek meghatározására, amelyek a legnagyobb valószínűséggel magyarázták a PFOA és a kontrollcsoportok közötti különbségeket [29]. A metabolitok összehasonlításához Mann-Whitney U tesztet használtunk a PFOA és a kontrollcsoport közötti p-értékek kiszámítására. A hamis felfedezési arányt a többszörös összehasonlítások korrigálására használták. A < 0.05 p-értékű metabolitokat jelentősnek tekintették. A részleges legkisebb négyzetek diszkriminancia analízisét (PLS-DA) és az útvonal-dúsítási analízist a MetaboAnalyst 5.0 segítségével végeztük [30]. A MixOmics-t a bélmikrobióta és a széklet metabolitjainak integráló elemzésére használták – ez egy integratív keretrendszer az omics adatok többváltozós elemzéséhez [31].
Természetes növényi gyógyszer a székrekedés enyhítésére-Cistanche
A Cistanche az Orobanchaceae családjába tartozó parazita növények nemzetsége. Ezek a növények gyógyászati tulajdonságaikról ismertek, és évszázadok óta használják őket a hagyományos kínai orvoslásban (TCM). A Cistanche fajok túlnyomórészt Kína, Mongólia és Közép-Ázsia más részein találhatók száraz és sivatagi régiókban. A Cistanche növényeket húsos, sárgás száruk jellemzi, és potenciális egészségügyi előnyeik miatt nagyra értékelik. A TCM-ben úgy gondolják, hogy a Cistanche tonizáló tulajdonságokkal rendelkezik, és általában a vese táplálására, a vitalitás fokozására és a szexuális funkciók támogatására használják. Az öregedéssel, fáradtsággal és általános jóléttel kapcsolatos problémák kezelésére is használják. Míg a Cistanche-t régóta használják a hagyományos orvoslásban, a hatékonyságával és biztonságosságával kapcsolatos tudományos kutatások jelenleg is folynak és korlátozottak. Ismeretes azonban, hogy különféle bioaktív vegyületeket tartalmaz, például fenil-etanol-glikozidokat, iridoidokat, lignánokat és poliszacharidokat, amelyek hozzájárulhatnak gyógyhatásaihoz.
Wecistanche-écisztanche por, cisztanche tabletta, cisztanche kapszula, és más termékek felhasználásával készülteksivatagcistanchealapanyagként, melyek mindegyike jó hatással van a székrekedés enyhítésére. A konkrét mechanizmus a következő: A Cistanche a hagyományos felhasználása és bizonyos vegyületei alapján feltételezhetően potenciális előnyökkel jár a székrekedés enyhítésében. Míg a Cistanche székrekedésre gyakorolt hatásával kapcsolatos tudományos kutatások korlátozottak, úgy gondolják, hogy számos olyan mechanizmusa van, amelyek hozzájárulhatnak a székrekedés enyhítésére. Hashajtó hatás:CistancheA hagyományos kínai gyógyászatban régóta használják székrekedés elleni gyógyszerként. Úgy gondolják, hogy enyhe hashajtó hatása van, ami elősegítheti a bélmozgást és székrekedést okozhat. Ez a hatás a Cistanche-ban található különféle vegyületeknek tulajdonítható, mint például a fenil-etanoid glikozidok és poliszacharidok. A belek nedvesítése: A hagyományos használat alapján a Cistanche hidratáló tulajdonságokkal rendelkezik, különösen a beleket célozza meg. A belek hidratálásának és kenésének elősegítése segíthet a szerszámok lágyításában és megkönnyítheti a járást, ezáltal enyhíti a székrekedést. Gyulladáscsökkentő hatás: A székrekedés néha emésztőrendszeri gyulladással járhat. A Cistanche bizonyos vegyületeket tartalmaz, köztük fenil-etanol-glikozidokat és lignánokat, amelyekről úgy gondolják, hogy gyulladásgátló tulajdonságokkal rendelkeznek. Azáltal, hogy csökkenti a bélgyulladást, javíthatja a bélmozgást és enyhítheti a székrekedést.
