A Sargassum Thunbergii kivonat bőrfehérítő és ránctalanító hatásai a TRP{1}} és az MMP-k gátlásán keresztül

Kapcsolatfelvétel: ali.ma@wecistanche.com

Da-Hye Gam 1, Jae-Hyun Park 1, Ji-Woo Hong 1, Seong-Jin Jeon 1, Jun-Hee Kim 1 és Jin-Woo Kim 1,2,*

Absztrakt: Sargassum thunbergiikeleti országokban hagyományosan ehető és gyógyászati ​​alapanyagként használják. Azonban abőrfehérítésésránctalanítóA S. thunbergii hatásait még nem vizsgálták. Ezt a vizsgálatot annak érdekében végezték, hogy optimális extrakciós feltételeket teremtsenek az antioxidáns hatású bioaktív vegyületek előállításához, valamint bőrfehérítő és ránctalanító hatású ultrahanggal segített extrakcióval (UAE) S. thunbergiiben. Az extrakciós idő (5,30~18,7 perc), az extrakciós hőmérséklet (22,4-79,6 ◦C) és az etanol-koncentráció (0.0~99,5 százalék ), amelyek a fő változók az Egyesült Arab Emírségekben, központi kompozit kialakítással optimalizálták. A másodfokú regressziós egyenleteket kísérleti adatok alapján vezették le, és magas determinációs együtthatót mutattak (R2 > 0,85), bizonyítva az előrejelzésre való alkalmasságot. Az összes függő változó, köztük a gyökfogó aktivitás (RSA), a tirozináz gátló aktivitás (TIA) és a kollagenáz gátló aktivitás (CIA) maximalizálására az Egyesült Arab Emírségekben az optimális feltétel a 12,0 perces extrakciós idő, a 65,2 ◦C extrakciós hőmérséklet és az etanol. 53,5 százalékról. Ilyen körülmények között a S. thunbergii kivonat RSA, TIA és CIA értéke 86,5 százalék, 88,3 százalék, illetve 91,4 százalék volt. Azt is megerősítettük, hogy a S. thunbergii kivonat gátolja a tirozinázzal rokon fehérje-1, a mátrix metalloproteináz-1 és a mátrix metalloproteináz-9 mRNS-expresszióját, amelyek a melaninszintézis és a kollagénhidrolízis fő génjei. . Folyadékkromatográfiás-tandem tömegspektrometriát alkalmaztak a S. thunbergii kivonat fő fenolos vegyületeinek azonosítására, és a kávésavat azonosították fő csúcsként, bizonyítva, hogy a magas hozzáadott értékű összetevőkbőrfehérítésésránctalanítóhatások előállíthatók a S. thunbergii-ből és felhasználhatók kozmetikai anyagok fejlesztésére.

Kulcsszavak: S. thunbergii; optimalizálás;bőrfehérítés; ránctalanító; TRP-1; MMP-1; MMP-9

Kattintson ide a cisztanche kivonat előnyei a bőr fehérítéséhez

1. Bemutatkozás

A melanogenezis egy élettani folyamat, amely a melanin pigmentek szintéziséhez vezet [1]. A melanin egy fekete vagy barna pigment, amely az epidermisz bazális rétegében lévő melanocitákból választódik ki, és meghatározza a bőr, a szem és a haj színét [2]. A melanin pigmentek túlzott termelődése azonban hiperpigmentációval összefüggő betegségekhez, például rosszindulatú daganatokhoz vezethet. melanómák [3]. A tirozináz, a themelanin bioszintézisének fő enzime elősegíti az L-tirozin L-DOPA (L-3,4-dihidroxifenilalanin) hidroxilációját, majd elősegíti az L-DOPA oxidációját dopakrómmá és dopakinonná, ami melanint szintetizál a tirozinázzal rokon fehérjék (TRP-1 és 2) autooxidációs folyamatán keresztül, több lépésben [4–6]. Napjainkig a kozmetikai iparban széles körben alkalmazták a melanin képződés gátlására szolgáló módszereket a tirozinázzal rokon fehérjék gátlásával bőrfehérítő szerek kifejlesztésére [7,8]. A hagyományosan használt kojsav, azelainsav és hidrokinon azonbanbőrfehérítésaz összetevőkről számoltak be, hogy allergiát váltanak ki, valamint bőrmérgezést és rákot okoznak [9]. Ezért elengedhetetlen egy biztonságosabb, hatékonyabb, természetes összetevőkön alapuló bőrfehérítő készítmény előállítása [10].

A kollagén egy extracelluláris mátrix (ECM) fehérje, amely védi a bőrt azáltal, hogy erősíti és feszesíti; segít késleltetni az öregedési folyamatot a ráncok és a nedvességvesztés megelőzésével. Az ECM-et a mátrix metalloproteinázok (MMP-k) lebonthatják [11]. Az MMP-1, más néven kollagenáz, részben lebontja a bőrt alkotó 1-es típusú kollagént, míg az MMP-9, az úgynevezett zselatináz, emellett depolimerizálja az MMP-1 által hidrolizált kollagént [12]. Ezenkívül beszámoltak arról, hogy a reaktív oxigénfajták (ROS) által kiváltott oxidatív stressz felgyorsítja ezen enzimek szintézisét, ami az ECM lebomlásához és végső soron ráncok kialakulásához vezet [13]. Ezért olyan természetes összetevőket kell találni, amelyek gátolhatják a TRP és MMP expresszióját, és amelyek antioxidánsokat tartalmaznak, amelyek képesek eltávolítani a reaktív oxigénfajtákat, hogy megakadályozzák a bőr öregedését azáltal, hogy csökkentik a bőr pigmentációját és ráncosodását [14]. A közelmúltban, mivel a kozmetikumok funkcionális összetevőit főként szárazföldi növényekben fejlesztették ki, új fajok és a természetes összetevők stabil kínálatának feltárása terén korlátok merültek fel [15]. Következésképpen a tengeri növényekből származó természetes összetevők iránti érdeklődés és kereslet nőtt, és számos új összetevőt azonosítottak a tengeri erőforrásokból [16].

Sargassum thunbergiiKorea és Kína partvidékén őshonos barna makroalga faj, amely a gulfweed családba tartozik [17]. Felismerték, hogy tengeri szennyező anyag, amely az oldott oxigén kimerítésével károsítja a hínárokat és a halgazdaságokat [18]. Néhányat közülük féreghajtó gyógyszerként használnak a hagyományos terápiában vagy komposztként [19]. Azonban egy rákellenes összetevőt azonosítottak belőle. kivonat 1995-ben; Azóta olyan makroalgának hívták fel a figyelmet, amely nagy potenciállal rendelkezik új bioaktív vegyületek előállítására [20]. A bioaktív vegyületek hagyományos eljárásokkal történő extrahálása, beleértve a mechanikai kilökést, szuperkritikus extrakciót, mikrohullámú extrakciót és ultramagas nyomású extrakciót, olyan korlátokkal jár, mint a felesleges oldószer használatának szükségessége, az alacsony extrakciós hozam és a magas energiafogyasztás [21]. Az új extrakciós módszerek kidolgozása az egyik legnagyobb kihívás a bioaktív vegyületek makroalgáktól való megvédésére irányuló technológiai innováció terén [22]. A hagyományos extrakciós eljárások közül az ultrahang-asszisztált extrakció (UAE) különösen vonzó egyszerűsége, alacsony berendezésköltsége, magas extrakciós hozama a különböző mátrixokból, alacsony energiafelhasználása, kevesebb oldószerigénye és rövidebb ideje miatt [23]. Az Egyesült Arab Emírségekről ismert, hogy 20–100 kHz-es nagyfrekvenciás hanghullámokat foglalnak magukban [24]. Az extrakciós hozam fokozódik az ultrahang hatására, ami a növényi szövetek károsodásának, a szemcseméret-csökkenésnek, valamint az ismételt akusztikus kavitáció során keletkező buborékok összeomlása következtében megnövekedett kivonatok oldószerbe történő átadásának tulajdonítható [25,26] . Ezeknek az előnyöknek köszönhetően az Egyesült Arab Emírségek egy olcsó, megújuló és hatékony eljárás, amelyet széles körben használnak az élelmiszeriparban funkcionális összetevők kinyerésére a szárazföldi és vízi biomasszából [27].

Így ebben a tanulmányban az Egyesült Arab Emírségekben alkalmaztuk a bioaktív vegyületek S. thunbergii-ből való kinyerését, és meghatároztuk az optimális UAE-körülményeket, amelyek lehetővé teszik az antioxidánsok maximális kivonását, valamintbőrfehérítésés ránctalanító összetevőket statisztikai alapú optimalizálással, valamint a S. thunbergii kivonat TRP-1, MMP-1 és MMP-9génexpressziójának különböző gátló hatásait értékelték a bőr állapotának ellenőrzésére -fehérítés ésránctalanítóa származtatott bioaktív vegyületek hatásait, és megerősítik a S. thunbergii kivonat funkcionális kozmetikai összetevőként való felhasználásának lehetőségét.

cistanche kivonat

2. Eredmények és megbeszélés

2.1. A kísérlet tervezése

A modell illesztése kulcsfontosságú a válaszfelületi módszertan (RSM) matematikai modelljének pontosságának értelmezéséhez a gyökfogó aktivitás (RSA), a tirozináz gátló aktivitás (TIA) és a kollagenáz gátló aktivitás (CIA) előrejelzéséhez.S. thunbergiikivonat. Az RSM központi kompozit tervezése (CCD) egy kísérleti tervezési módszer, amely statisztikailag elemzi a válaszfelületet egymástól függetlenül vagy két független, a válaszokat befolyásoló változó kölcsönhatása révén. A CCD előnye, hogy hatékonyan becsüli meg a görbületet a középpont és több axiális pont segítségével az optimális feltételek megjósolásához [28–30]. Ebben a tanulmányban CCD-t alkalmaztak az optimális UAE-feltételek előrejelzésére, hogy maximalizálják a S. thunbergiiextract válaszait, beleértve az RSA-t, a TIA-t és a CIA-t. Az 5 szintet (- , -1, 0, 1, ) kódoltuk, és 17 kísérleti futtatást végeztünk CCD-n (1. táblázat). Korábbi tanulmányaink alapján 3 kulcsfontosságú független változót választottunk ki, beleértve az extrakciós időt (5,30-18,7 perc), az extrakciós hőmérsékletet (22,4-79,6 ◦C) és az etanol-koncentrációt (0-99,5 százalék), hogy megkapjuk a függő változók maximális szintjét. [31]. A másodfokú regressziós modell kidolgozása során a kísérleti változókat az alábbi egyenlet szerint kódoltuk.

xi {{0}} (Xi − X0)/∆X (1)

ahol xi az Xi változó kódolt értéke; X0 az X értéke a középpontban, és ∆X a lépésváltási érték.

A 17 körülmény kísérleti értékeit az extrakciós idő, az extrakciós hőmérséklet és az etanol koncentráció eltéréseivel a 2. táblázat tartalmazza.

2.2. Az Egyesült Arab Emírségek feltételeinek hatása az RSA-ra

A kitermelésére alkalmazott 17 feltétel szerintS. thunbergiiEgyesült Arab Emírségek alkalmazásával az RSA 2,37-89,9 százalék volt, a maximális érték 12.{5}} perc extrakciós idő, 51.0 ◦C extrakciós hőmérséklet és 50.{11} } százalékos etanol koncentráció és a minimális érték 12.{13}} min extrakciós idő, 51.0 ◦C extrakciós hőmérséklet és 99,5 százalékos etanol koncentráció; ez azt jelzi, hogy az etanol koncentrációja volt a legnagyobb hatással az RSA-ra (2. táblázat). A Design-Expert szoftver javaslatának megfelelően egy másodfokú regressziós egyenletet választottunk ki és illesztettünk mindhárom független változóra és válaszra. A kódolt értékek tekintetében az RSA, TIA és CIA előrejelzett válaszai másodfokú regressziós egyenletekkel fejezhetők ki többszörös regressziós elemzéssel (3. táblázat). A CCD-modell együtthatóit varianciaanalízis (ANOVA) segítségével validáltuk a 4. táblázatban összefoglalt másodfokú regressziós modellek válaszváltozóira. Ha a meghatározási együttható (R2), amely a kísérleti és az előrejelzett értékek közötti egyezést reprezentálja, közel 1, az azt jelenti, hogy elfogadható jó illeszkedés [32]. A másodfokú regressziós egyenlet R2 értéke az optimális UAE feltétel RSA-val való előrejelzésére 0,8554 volt, ami azt mutatja, hogy a kapott becsült érték 85,5 százalékánál nagyobb vagy egyenlő teljes mértékben megmagyarázható, így felismerhető a másodfokú regressziós egyenlet alkalmassága (3. táblázat).

Az egyes modellváltozók szignifikanciáját p értékek segítségével határoztuk meg; egy p-értéke<0.05 indicates="" significance="" whereas="" a="" p-value="" of="">A 0.05 jelentéktelenséget jelez az RSA-n [33]. Az optimalizálási vizsgálat ANOVA eredményei azt mutatták, hogy a modell szignifikáns (p=0.0283), ami alacsonyabb volt, mint a beállított szignifikancia szint, ami azt jelzi, hogy a szignifikancia 5 százalékon belül került felismerésre. Ezért az eredmények azt mutatják, hogy a modellek hatékonyan megjósolhatják a S. thunbergii kivonat RSA-, TIA- és CIA-értékét, ha a független változók az itt bemutatott tartományokon belül vannak. Az egyes független változók szignifikanciájának ellenőrzése során azt találtuk, hogy az etanol koncentrációja volt a legnagyobb hatással az RSA-ra (p=0,0025), míg az extrakciós idő (p=0,7418) és a hőmérséklet (p=0.1622) jelentéktelenek voltak (4. táblázat).

Az egyes független változóknak a függő változóra gyakorolt ​​hatásának értékeléséhez az RSA változását az extrakciós idő, az extrakciós hőmérséklet és az etanol-koncentráció szerint perturbációs diagramként fejeztük ki (1A. ábra).

Következésképpen a legmagasabb érték az extrakciós idő 14,1 percében jelent meg, majd csökkent; a maximális értéket 60,7 ◦C-nál, az extrakciós hőmérsékletnél 46,2 százaléknál, az etanol koncentrációnál pedig 46,2 százaléknál erősítették meg. Ha azonban a háromdimenziós válaszfelületi görbe segítségével megjelenítjük az RSA-ban a változók közötti kölcsönhatások miatti változási sebességet, az extrakciós idő és a hőmérséklet változása csekély hatással volt az RSA-ra, míg az etanol koncentrációja jelentős hatással volt (2A, B ábra).

Ez hasonló volt Kim és munkatársai tanulmányának eredményeihez. az oldószerkoncentráció hatásának azonosítása a Gynostemma pentaphyllum kivonat RSA-jára [34]. Az RSA a maximumra nőtt, majd az etanol koncentrációjával csökkent, a maximális értéket az etanol koncentráció 48,1 százalékánál mutatta. Az extrakciós oldat polaritásváltozása a desztillált víz és az etanol összekeverése miatt a G antioxidáns hatásának növekedéséhez vezet. pentaphyllum és S. thunbergii kivonatok. Ezenkívül ez összhangban van azokkal az eredményekkel, amelyek szerint az algákból forró vizes extrakcióval előállított vízben oldódó bioaktív vegyületek kevésbé antioxidáns aktivitást mutatnak, és az 50 százalékos etanolt tartalmazó kivonatok magasabb antioxidáns aktivitást mutattak, ami arra utal, hogy egy bináris oldószer (víz és etanol) bioaktív vegyületeket termelve előnyös az extrakciós hozam növelésében [35,36].

2.3. Az Egyesült Arab Emírségek feltételeinek hatása a TIA-ra

A TIA ofS. thunbergiiA kísérletben alkalmazott 17 egyesült arab emírségekbeli feltételnek megfelelő kivonatok a 2. táblázatban láthatók. A maximális 92,6 százalékos TIA-értéket 12.0 percnél, 79,6 foknál és 50-nál határoztuk meg.{{13} } százalék, a minimális 55,3 százalékos érték pedig 12.0 min, 51.0 fok és 0.{{20}} százalékos extrakció idő, extrakciós hőmérséklet és etanol koncentráció. Következésképpen az extrakciós hőmérséklet és az etanol koncentrációja jelentős hatást gyakorol a TIA-ra. A kísérleti eredmények alapján CCD segítségével másodfokú regressziós egyenletet származtattunk, és ennek segítségével megjósoltuk az optimális UAE feltételeket (3. táblázat). Az R2 0,8591 volt, ami 85,91 százalékos egyezést jelez a megjósolt modell értékei és a kísérleti adatok között, és arra utal, hogy a másodfokú regressziós egyenlet alkalmas a TIA előrejelzésére. Az RSA, TIA és CIA válaszai esetében a modellek nagyon szignifikánsak voltak, ha a számított F-értékek nagyobbak voltak, mint a táblázatos F-értékek, és a valószínűségi értékek alacsonyak voltak (p < 0,001);="" ez="" azt="" jelzi,="" hogy="" az="" egyes="" válaszmodellekben="" az="" egyes="" kifejezések="" szignifikánsak="" voltak="" az="" interakciós="" hatás="" szempontjából="" [37].="" a="" másodfokú="" regressziós="" egyenlet="" szignifikáns="" hatásának="" statisztikai="" értékelésére="" anova-t="" alkalmaztunk.="" a="" kísérleti="" modell="" szignifikáns="" volt="" (p="0,0262)," ami="" 5="" százalékon="" belüli="" szignifikanciaszintet="" jelez="" (4.="">

Amikor más változók értékeinek rögzítésekor a TIA változás mértékét egyetlen változó változásával vizualizáltuk, az etanol koncentrációból adódó TIA változás volt a legnagyobb, a maximális TIA 76,8 százalékos etanolkoncentrációnál (1B. ábra). A független változók kölcsönhatásait a háromdimenziós válaszfelületi görbe segítségével jelenítjük meg, két változó egyidejű változtatásával (3. ábra).

Az extrakciós hőmérséklet és idő növekedésével a TIA kezdetben nő; azonban a változási tartomány nem nagy, ezért ismét megerősítettük, hogy az extrakciós hőmérséklet és idő interaktív hatása nem szignifikáns, az ANOVA segítségével meghatározva (3A. ábra). Ezzel szemben a TIA növekedett, majd ismét csökkent az etanol koncentrációjával, a maximális TIA pedig 75,6 százalékos etanolkoncentrációnál várható (3B. ábra). Ez az eredmény összhangban van Park és munkatársai tanulmányával, amely kimutatta, hogy a 70-80 százalékos etanol koncentráció magasabb TIA-t eredményez, mint a víz a bioaktív vegyületek vadrizs-kivonatból történő extrakciójában [38]. Ez a tanulmány arról számolt be, hogy az etanol koncentrációja a TIA fő változója volt, és az etanol koncentrációjával arányosan változik.

2.4. Az Egyesült Arab Emírségek feltételeinek hatása a CIA-ra

Amikor mind a 17 körülmény között mértük a CIA-t, azt találtuk, hogy a maximális CIA-érték 92,3 százalék volt 16.0 min, 63.0 fok és 80.{{ 12}} százaléka, a minimális CIA pedig 48,1 százalék volt 12.{14}} perc, 51.{15}} fok és 0.0 százaléka az extrakciós időnek, az extrakciós hőmérsékletnek, és etanol koncentrációja (2. táblázat). Az extrakciós idő, hőmérséklet és etanolkoncentráció alapján generált másodfokú regressziós egyenlet R2 értéke 0,9237, ami azt jelenti, hogy a minta 92,37 százalékos eltérése a független változóknak tulajdonítható, és az összes változásnak csak 7,63 százaléka nem magyarázható modell (3. táblázat). Ez jó fokú korrelációt jelez a CIA előrejelzett és kísérleti értékei között, és elismeri, hogy alkalmas a kísérleti modell előrejelzésére [39]. Az ANOVA statisztikai szignifikanciát (p=0,0037) 1 százalékos szignifikanciaszint alatt mutatott ki, és megerősítette, hogy az extrakciós hőmérséklet (p=0,0030) és az etanol-koncentráció (p=0,0006) a lineáris kifejezések között voltak független változók, amelyek szignifikánsan befolyásolták a CIA-t (4. táblázat).

Az egyes független változók CIA-ra gyakorolt ​​hatásának értékeléséhez a CIA-t összehasonlítottuk az egyik változó változásával egy perturbációs diagram segítségével (1C. ábra). A független változó növekedésével a CIA kezdetben a maximális értékre nőtt, és az etanol koncentrációját találták a leginkább befolyásolónak. A háromdimenziós válaszfelületi görbe a független változók interaktív hatásaiból adódó CIA változást ábrázolta, amely az extrakciós idővel és az etanol koncentrációjával nőtt és csökkent. A CIA az extrakciós idő és az etanol koncentráció növekedésével nőtt, és a maximális CIA értéket 12,1 perc extrakciós időnél és 73,6 százalékos etanolkoncentrációnál mutatta. A CIA változásai az extrakciós hőmérséklettel és az etanol-koncentrációval állandó extrakciós idő mellett szintén azonosak voltak; azonban megerősítették, hogy a CIA változásai jelentősebbek az etanol koncentrációjával (4B. ábra).

A CCD által megjósolt CIA maximális értéke 93,8 százalék volt, 14,5 perces extrakciós idővel, 65,1 ◦C extrakciós hőmérséklettel és 69,3 százalékos etanol koncentrációval. Ez több mint kétszer olyan magas, mint egy korábbi tanulmányban a zöld tea és a fehér tea forróvizes kivonata esetében a CIA 39,4 és 40,3 százaléka [40]. Összegzésként aS. thunbergiiA kivonatot funkcionális kozmetikai összetevőként alkalmasnak tartották a ráncok csökkentésére, mivel visszafogja a kollagenáz aktivitását.

2.5. Az Egyesült Arab Emírségek folyamatának optimalizálása

Az Egyesült Arab Emírségek optimális feltételeinek meghatározása a kitermeléshezbőrfehérítésés a S. thunbergii kivonatból származó ránctalanító bioaktív vegyületekkel, optimális pontot kaptunk a függő változók maximalizálására az RSA, TIA és CIA egyedi válaszfelületeinek átfedésével (5. ábra).

Amikor a független változók tartományát 5,30~18,7 perc extrakciós időre, 22,4-79,6 ◦C extrakciós hőmérsékletre és 0~99,5 százalékos etanol-koncentrációra korlátozták, az optimális UAE állapotot jósolták meg 12,0 perc extrakciós idő, 65,2 ◦C extrakciós hőmérséklet és 53,5 százalékos etanol koncentráció. Az optimális egyesült arab emírségekbeli állapotot az extrakciós idő minimalizálásának kritériumai alapján határozták meg, mivel a rövid folyamatidő előnyös a feldolgozási költségek csökkentésében. A származtatott optimális UAE-feltételek mellett az RSA, a TIA és a CIA 86,5 százalékát, 88,3 százalékát és 91,4 százalékát jósolták. Korábbi tanulmányokban Yuan és mtsai. beszámoltak arról, hogy a bioaktív vegyületek S. thunbergii-ből való extrakciójának optimális feltételei a következők voltak: 120 ml/g folyadék/szilárd arány, 210 perces extrakciós idő és 97 ◦C extrakciós hőmérséklet [41]. Míg Yuan et al. optimalizálta a forró vizes extrakció körülményeit a bioaktív vegyületek extrakciójához, a jelen vizsgálatban a bioaktív vegyületek extrakciójának Egyesült Arab Emírségek feltételeit optimalizáltuk. Emiatt az Egyesült Arab Emírségek körülményei rövid extrakciós idő és alacsony hőmérséklet mellett a korábbi forró vizes extrakciós eljárásokhoz képest hatékony extrakciós eljárásnak bizonyultak a bioaktív vegyületek számára.

Az eredmények ellenőrzésére egy megerősítő kísérletet végeztünk három ismétléssel a CCD-modell által előre jelzett optimális körülmények között. Amikor az RSA, a TIA és a CIA kísérleti értékeit optimális körülmények között értékelték ki, ezek 88,9 százalék ± 3,11 százalék, 85,1 százalék ± 2,76 százalék és 89,7 százalék ± 4.{12}}9 százalék volt, és azt mutatták, erős egyetértés a prediktív modell értékeivel (p > 0,05). Ezért a kísérleti értékek jó egyezést mutattak az előrejelzett értékekkel, ami bizonyítja az Egyesült Arab Emírségek optimalizálási eredményeinek megbízhatóságát.

2.6. A TRP-1, MMP-1 és MMP-9 mRNS expressziója

A TRP-1 5,6-dihidroxi-indol-2-karbonsav-oxidázként működik, amelyről ismert, hogy a bőr pigmentációjának vezető okozója, amely a tirozináz stimulációja és az eumelaninszintézis révén hat a hámsejtekben [42]. Ezzel szemben az MMP-1 és az MMP-9 lebontja az 1-es típusú kollagént, amely a dermális réteg 90 százalékát teszi ki, ezáltal a kollagén lebomlását, rugalmasságának elvesztését és a bőr öregedését okozza [43].

Ebben a tanulmányban,S. thunbergiiA kivonatot a statisztikai alapú optimalizálással megállapított optimális egyesült arab emírségekbeli feltételekkel állítottuk elő, és a kivonatot B{{0}}F0 sejtvonalakon teszteltük, hogy kiértékeljük.bőrfehérítésésránctalanítótulajdonságait a TRP{{0}}, MMP-1 és MMP-9 RNS-expressziós szintjének összehasonlításával. A melaninszintézishez kapcsolódó fő gén, a TRP-1 expressziós szintjét koncentrációfüggőnek találták az S-ben. thunbergii kivonat, és szignifikánsan csökkent 1 és 2 mg/ml kivonattal végzett kezelés után a kontrollcsoporthoz képest (p < 0,05)="" (6a.="">

Azt is megállapítottuk, hogy az MMP{{{{10}}} és MMP-9 expressziója arányosan csökkent a S. thunbergii kivonat koncentrációjával (6B, C ábra). Különösen az MMP-1 és MMP-9 expressziós szintje 58,6%-kal, illetve 78,8%-kal gátolt a 2 mg/ml S. thunbergii kivonattal kezelt csoportban a kontrollcsoportokhoz képest (p < 0,05).="" a="" fenti="" eredmények="" megerősítették,="" hogy="" az="" optimális="" uae-körülmények="" között="" előállított="" s.="" thunbergii="" kivonat="" hatékonyan="" gátolja="" a="" trp-1,="" mmp-1="" és="" mmp-9="" mrns="" expresszióját="" inb16-="" f0="" sejtvonalakat,="" ezáltal="" gátolja="" a="" melanintermelést="" és="" a="" kollagén="">

2.7. Kávésav azonosítása S. thunbergii kivonatban

Egy korábbi kísérletben az Egyesült Arab Emírségek feltételei maximalizálják az antioxidáns, bőrfehérítő ésránctalanítóa S. thunbergii kivonat hatásait optimalizálták; azonban további vizsgálatokra volt szükség a kivonat bioaktív összetevőinek feltárásához. Ezért a fenolos vegyületek aS. thunbergiiA kivonatokat folyadékkromatográfiás-tandem tömegspektrometriával (LC-MS/MS) azonosították, mivel ez a technológia lehetővé teszi a fenolos vegyületek pontos azonosítását szerkezeti jellemzéssel és a kismolekulák kimutatását természetes forrásokból. A csúcsok azonosítása a retenciós idő (RT), a prekurzor ionok és a standard fragmens ionok alapján történt. Az LC-MS/MS rendszerben a kávésav 1,95 perces szobahőmérsékleten mutatott csúcsot (7. ábra).

Negatív ion módban az m/z 179,10 ion, amely a két ioncsúcs egyikét mutatta a tömegspektrumban, megfelel a kávésav és a szeparált fragmens ion m/z 135,56 molekulaképletének. Általában az ütközés által kiváltott disszociációt követően a fenolvegyületek fragmensiont termelnek, amelyet a karbonsavcsoportból származó CO2 (44 Da) elvesztése jellemez. Ennek a veszteségnek köszönhetően a 44-Da CO2 ezt követő lehasítása a tionról 179,10 m/z-nél 135,56 m/z-nél eredményezte az iont. A kávésav egy C6-C3 fenolos vegyület, amelyet a növények fenilalaninból vagy tirozinból állítanak elő a másodlagos anyagcsere shikimút útján, és a fahéjsav (vagy fenilpropanoid) osztály képviselője. Számos zöldségen és gyümölcsön keresztül kerül be az emberi étrendbe [44]. Az elmúlt években számos tanulmány kimutatta, hogy a kávésav fogyasztása számos egészségügyi előnnyel jár az antioxidáns tulajdonságainak köszönhetően, amelyek segítenek megelőzni az oxidatív stresszhez kapcsolódó különféle betegségeket [45]. Így ez a fenolos vegyületekkel kapcsolatos tanulmány nagyon hasznos, és fontos szerepet játszhat a minőség-ellenőrzési folyamatban és a S. thunbergiias jövőbeni feltárásában.bőrfehérítésésránctalanítótulajdonságait.

3. Anyagok és módszerek

3.1. Anyagok és reagensek

S. thunbergiia koreai Jeju-sziget déli partjáról gyűjtöttük össze október 2-án 019-én Para Jejuban (Jeju, Korea) vásárolták. A kísérlet előtt a S. thunbergii-t 0,42 mm alatti hőmérsékleten porítottuk egy daráló segítségével (HMF-3000S, Hanil Co., Wonju, Korea), és hűtőszekrényben tároltuk -5 °C-on. Az oldószeres extrakcióhoz használt etanolt a SamchunChemical Co.-tól vásároltuk (95,0 térfogatszázalék, Pyungtaek, Korea). A kontrollvizsgálatokhoz standardként használt aszkorbinsavat (C-vitamin), arbutint és kojicsavat a Sigma-Aldrich Co., Ltd.-től (St. Louis, MO, USA) vásároltuk. A kísérletben használt összes többi vegyszer analitikai minőségű volt.

3.2. Egyesült Arab Emírségek folyamata

A minta szárított port (1 g) egy nyomástartó edénybe (XF100, AntonPaar Co., Ltd., Graz, Ausztria) helyeztük 10 ml oldószerrel. és vortex keverővel (VM-10, Daihan sci. Co., Wonju, Korea) 1 percig keverjük. Ezeket a mintákat 17 egyedi egyesült arab emírségekbeli körülmények között extraháltuk CCD-ből 5,30-18,7 perc extrakciós idővel, 22,4-79,6 °C extrakciós hőmérséklettel és 0,0-99,5 százalékos etanol koncentrációval. Az Egyesült Arab Emírségekben 200 W elektromos teljesítménnyel és 40 kHz-es frekvenciájú, digitális időzítővel és hőmérséklet-szabályozóval felszerelt ultrahangos készüléket (SD-D250H, Sungdong Co., Szöul, Korea) végeztek. Az extrahálás után a felülúszót 10, 000 fordulat/perc mellett 10 percig centrifugával (1236R, Labogene Co., Daejeon, Korea) elválasztottuk. Ezután az oldatot 0,45 µm porozitású cellulóz-acetát korongszűrőn átszűrtük, és RSA, TIA és CIA elemzésekhez használtuk (8. ábra).

3.3. Kísérlettervezés

Design-Expert szoftvert (Ver. 8.0, Stat-Ease, Minneapolis, MN, USA) használtunk a bioaktív vegyületek kinyerésének maximalizálásáraS. thunbergiiaz Egyesült Arab Emírségek feltételeinek CCD használatával történő optimalizálása révén. Független változóként a kulcsváltozókat, köztük az extrakciós időt (X1), az extrakciós hőmérsékletet (X2) és az etanolkoncentrációt (X3) választottuk ki, és 5 (−1,68, −1, 0, 1, 1,68) szintbe kódoltuk. Az 1. táblázat szerint az RSA, a TIA és a CIA a fő független változók által befolyásolt függő változók. [46]. A következő másodfokú regressziós egyenletet használtuk a függő változók értékeinek kiszámításához a független változók változásai szerint:

Y = β0 + k ∑ i = 1 βiXi + k ∑ i = 1 βiiX 2 i + k ∑ i>1 ijXiXj(2)

ahol Y a függő változókat (RSA, TIA, CIA), a 0 egy állandó együttható, a k pedig egy tesztváltozó. i, ii és ij a lineáris, másodfokú és interakciós tagok regressziós együtthatói.

A független változóra előrejelzett modell értékeléséhez varianciaanalízist (ANOVA) végeztünk 95 százalékos konfidenciaszinttel, hogy értékeljük az egyes változók hatását, beleértve az extrakciós hőmérsékletet, időt és etanol-koncentrációt. Emellett a regressziós modell p-értékét, a regressziós együtthatót (R2) alkalmaztuk a regressziós modell alkalmasságának meghatározására [47].

3.4. Radical Scavenging Activity (RSA) vizsgálat

Az antioxidáns hatása aS. thunbergiiAz extraktumot az 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH, Sigma-Aldrich) szabad gyökökkel szembeni megkötő aktivitásuk alapján értékelték módosított DPPH vizsgálattal [48]. A törzsoldatot úgy állítottuk elő, hogy 0,1 M DPPH-t metanollal oldottunk, majd szobahőmérsékleten tároltuk. A metanollal hígított DPPH-oldatot úgy készítettük el, hogy az abszorbanciája 1.0 ± 0.02 legyen 517 nm-en UV-visspektrofotométerrel (Optizen 2120UV, Mecasys, Daejeon, Korea). . A DPPH oldat 1,25 ml-es aliquot részét összekevertük 0,25 ml hígított S. thunbergii kivonattal (50-500 mg/ml), és szobahőmérsékleten, sötétben 20 percig állni hagytuk. Az abszorbancia változását 517 nm-en követtük, és az RSA-t a következő képlettel számítottuk ki:

RSA (százalék)={1 −Abs (minta) / Abs (kontroll)} × 100 (3)

ahol az Abs(kontroll) a kontroll abszorbanciája, az Abs(minta) pedig a kivonat abszorbanciája. Pozitív kontrollként azonos koncentrációjú aszkorbinsavat (50-500 mg/ml) használtunk.

3.5. Tirozináz Inhibitory Activity (TIA) vizsgálat

A TIA-t Yagi [49] által ismertetett módszer szerint mérték. A reakcióelegy 0,4 ml nátrium-foszfát puffert (67 mM, pH 6,8), 0,2 ml 10 mM3-t, {{10}} tartalmazott. dihidroxi-fenilalanint (L-DOPA, Sigma-Aldrich), 0,2 ml gomba tirozinázt (125 egység/ml, Sigma-Aldrich) és 0,2 ml extraktumot. A reakciót 25 °C-on 30 percig végeztük. A reakció után az abszorbanciát 475 nm-en mértük, és az eredményeket összehasonlítottuk a kontrollal. A TIA-t az alábbi egyenlet alapján számítottuk ki:

TIA (százalék)={1 −Abs (minta) / Abs (kontroll)}× 100 (4)

ahol az Abs(kontroll) a kontroll abszorbanciája, az Abs(minta) pedig a kivonat abszorbanciája.

a cistanche csökkenti a tirozináz aktivitást

3.6. Collagemase Inhibitory Activity (CIA) vizsgálat

A CIA vizsgálatot Wünsch és Heindrich [50] által leírt módszer szerint végeztük. A kollagenázt (0,2 mg/ml, Sigma-Aldrich) 0,1 M Tris-HCl-ben (pH 7,5) oldottuk. A szubsztrátot, a 4-fenil-azobenziloxikarbonil-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg-t (0,4 mg/ml, Sigma-Aldrich) 0,1 M Tris-HCl-ben oldjuk. (pH 7,5), amely 4 mM CaCl2-t tartalmaz. A kollagén hidrolízisének értékelésére szolgáló reakcióelegy kollagenázt (75 µl), mintát (50 µl) és szubsztrát oldatokat (125 µL) tartalmazott. A kontrollcsoport esetében az extraktum helyett 50 µl desztillált vizet adtunk a reakcióelegyhez. Az elegyet 30 percig 37 °C-on inkubáltuk, majd 0,25 ml 25 mM citromsavat adtunk hozzá az enzimreakciók leállítására. Etil-acetáttal való összekeverés után a felülúszót elválasztottuk, és az abszorbanciát 320 nm-en mértük. A gátlás százalékos arányát a következő képlet alapján számítottuk ki:

CIA (százalék) ={1 −Abs (minta)/Abs (kontroll)}× 100 (5)

ahol az Abs(kontroll) a kontroll abszorbanciája, az Abs(minta) pedig a kivonat abszorbanciája.

3.7. A modell érvényesítése

Az Egyesült Arab Emírségek optimalizált feltételeit (extrakciós idő, extrakciós hőmérséklet és etanol koncentráció) az antioxidáns aktivitás in vitro értékelésével validáltuk,bőrfehérítés, és ránctalanító hatások (RSA, TIA és CIA) a CCD-től kapott értékek szerint. Az összes választ ismét az Egyesült Arab Emírségek optimalizált körülményei között határoztuk meg. A kísérleti értékeket összehasonlítottuk a modell által megjósolt értékekkel, hogy értékeljük annak érvényességét. Az optimális körülmények között előállított kivonatokon LC-MS/MS analízist végeztünk, hogy megtaláljuk a fő komponenseketS. thunbergiikivonat.

3.8. Sejtkultúra

A B{{0}}F0 melanomasejteket a Korean Cell Line Bank Co.-tól (KCLB, Szöul, Korea) vásároltuk, és Dulbecco módosított Eagle táptalajban (DMEM, Gibco BRL Co., Ltd., Gaithersburg) tenyésztettük. 10% magzati szarvasmarha-szérumot és 1% penicillint (Thermo Fisher Sci. Inc., Waltham, MA, USA) tartalmaz. A sejteket 37 ◦C-on 5 százalékos CO2-vel (MCO-5AC, Sanyo Co., Ltd., Tokió, Japán) inkubáltuk, és egyrétegű 25 cm2-es tenyészlombikban növesztettük. Amikor egy sejtvonal elérte a körülbelül 80 százalékos konfluenciát, a tenyésztést tripszin-EDTA-val történő kezeléssel végeztük, hogy egyedi sejteket kapjunk a sejtek megfelelő növekedésének és egészségének biztosítása érdekében.

3.9. Reverz transzkripciós polimeráz láncreakció (RT-PCR)

Az RT-PCR végrehajtásához 10 × 106 sejtet szélesztettünk egy 24-lyukú lemez üregenként. A TotalRNS-t AccuPrep univerzális RNS extrakciós kittel (BioneerCo., Daejeon, Korea) extraháltuk a sejtekből. A reverz transzkripciót 0,5 µg teljes RNS forcDNS szintézisével végeztük az amfiRivert cDNS szintézis platina master mix (GenDEPOTCo., TX, USA) felhasználásával. A cDNS-t mindegyik primerrel amplifikáltuk, például TRP-1, MMP-1, MMP-9 és -aktin (5. táblázat). A PCR-t 20 µl térfogatban végeztük, amely 1 µl cDNS-t, 10 µLTaq Premixet (Genet bio, Daejeon, Korea) és 9 µl dietil-pirokarbonátot (DEPC) tartalmazott. A PCR-körülmények a következők voltak: 94 ◦C 5 percig, majd 25 ciklus 95 ◦C-on 5 másodpercig, 60 ◦C 31 másodpercig (TRP-1) vagy 55 ◦C 30 másodpercig (MMP esetén {26}}) vagy 59 ◦C 30 s-ig (MMP esetén{29}}), és 72 ◦C 30 s kiterjesztéshez. Mindegyik PCR-terméket 1%-os agarózgélen elektroforetizáltuk, és a Gel Doc TM XR plus rendszerrel és egy mennyiségû szoftverrel (Bio-Rad Co., Hercules, CA, USA) tettük láthatóvá. Az -aktint, mint háztartási gént a TRP-1, MMP-1 és MMP-9 expressziós szintjének normalizálására használták.

3.10. LC-MS/MS analízis

A S. thunbergii kivonat kromatográfiás elválasztását Finni gan Surveyor Plus HPLC rendszerrel (Thermo Electron Corporation, San Jose) végeztük. Az elválasztást 150 mm oszlophosszú, 3 mm belső átmérőjű és 3 µm részecskeméretű ROC C18 oszlop használatával (RESTEK Co., Bellefonte, PA, USA) 0,1 gradientelúcióval végezték. százalék hangyasav vízben (A mozgófázis) és 0,1 százalék hangyasav acetonitrilben (B mozgófázis) 0,2 ml/perc áramlási sebesség mellett, az alábbiak szerint: 5 százalék 100 százalék B-mozgófázis 11 percig, 100-5 százalék B-mozgófázis 4 percig, 37 százalék B-mozgófázis 2 percig, 37-10 százalék B-mozgófázis 0,1 percig és 10 százalék B-mozgófázis 2,4 percig . Az injekciós térfogat 10 µl volt, és az oszlopot 30 °C-on tartottuk. A tömegspektrometriás kísérleteket Thermo Finnigan TSQ Quantum Ultra EMR tripla kvadrupolemassza spektrométerrel (Thermo Fisher Sci. Inc., Waltham, MA, USA) végeztük. A S. thunbergii kivonatot negatív ionos elektrospray ionizációval elemeztük elektrospray ionizációval (ESI), konkrétan a turbóionos permetezési módot alkalmazva. Az ESI forrás beállításai a S. thunbergii extrakció ionizációjához negatív üzemmódban a következők voltak: gázhőmérséklet, 270 ◦C; gázáramlás, 19 l/perc; köpenygáz hőmérséklet, 400 ◦C; köpenygáz áramlás, 10 L/perc; kapilláris feszültség, 3000 V; fúvóka feszültsége, 1000 V. A tömegspektrumokat negatív ionmódban vettük fel 100 és 500 m/z között, ütközési gázként nitrogént használva. A főkomponensek elemzése inS. thunbergiiA kivonatot úgy végeztük, hogy a kapott molekuláris ionokat és LC-MS/MS-eredmények fragmentációs mintázatait összehasonlították az irodalomból származó adatokkal és a standard vegyületek tömegkönyvtárával.

4. Konklúziók

Ez a tanulmány olyan optimális feltételeket javasolt az Egyesült Arab Emírségek folyamatához, amelyek maximalizálják az antioxidáns mennyiségét,bőrfehérítés, ésránctalanítóhatások a délkelet-ázsiai szubtrópusi partvidéken széles körben elterjedt S. thunbergii-ből származó értéknövelt bioaktív vegyületek előállítására, amelyek tengerszennyezést és ökológiai zavarokat okoznak. Az egyesült arab emírségekbeli optimalizálás során a legbefolyásosabb változó az etanol koncentrációja volt, ami megerősítette, hogy a vízből és etanolból álló bináris oldószerek használata és koncentráció-meghatározása fontos szempont volt az Egyesült Arab Emírségekben. Az egyes válaszfelületek átfedésekor az RSA, a TIA és a CIA egyidejű optimalizálásához 120 perc extrakciós időt, 65,2 ◦C extrakciós hőmérsékletet és 53,5 százalékos etanolkoncentrációt jósoltak, mely körülmények között RSA. 86,5 százalékos értékeket, 88,3 százalékos TIA-értékeket és 91,4 százalékos CIA-értékeket azonosítottak.

Amikor a TRP-1, MMP-1 és MMP-9 expresszióra gyakorolt ​​hatását az optimális Egyesült Arab Emírségekben előállított S. thunbergii kivonat felhasználásával mRNS-szinten értékelték, bebizonyosodott, hogy a S. thunbergii kivonat csökkentheti a TRP-1, MMP-1 és MMP-9 mRNS szintjét, és ezáltal megakadályozza a melanintermelést, valamint a bőr kollagén lebomlását.

És így,S. thunbergiiA kivonatot várhatóan széles körben használják fel a tengeri biomasszából származó új forrásként kozmetikumok, élelmiszerek és gyógyszerek funkcionális összetevőinek gyártásában. Ezen túlmenően a bioaktív vegyületek Egyesült Arab Emírségek felhasználásával történő extrahálásának folyamatáról úgy gondolják, hogy alapvető adatokat szolgáltat a folyamat fejlődéséről, és hozzájárul a optimális extrakciós feltételek meghatározása új funkcionális összetevők S.thunbergii-ből és más makroalgákból történő előállításához.