Az antioxidáns grafén-oxid nanoszalag, mint új fehérítőszer, gátolja a melanogenezis mechanizmusát

Kapcsolatba lépni:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hsin-Yu Chou, Hui-Min David Wang,* Chia-Heng Kuo, Pei-Hsuan Lu, Lin Wang, Wenyi Kang és Chia-Liang Sun*

ABSZTRAKT:A melanin szintézis folyamatában az oxidatív reakciók alapvető szerepet játszanak, és jó stratégia a melanintermelés gátlására az oxidatív stressz csökkentésével. A fullerént és származékait vagy komplexeit erős szabad gyökfogónak tekintették, és további többrétegű sp2 nanokarbonokat alkalmaztunk a felfedezéshez.melaninszintézis gátló mechanizmusok. Jelen tanulmányban új nanoanyagokat, például többfalú szén nanocsöveket (MWCNT), rövid típusú MWCNT-ket, grafén-oxid nanoszalagokat (GONR) és rövid típusú GONR-eket használtunk antioxidáns szerekként a melanintermelés szabályozására. Az eredmények azt mutatták, hogy a GONR-ek jobb antioxidatív képességekkel rendelkeznek az intracelluláris és extracelluláris oxidatív stresszelemző platformokon, mint mások. Azt javasoltuk, hogy a GONR-ek oxigéntartalmú funkciós csoportokkal rendelkezzenek. A 2′,7′-diklór-dihidrofluoreszcein-diacetát vizsgálat során azt találtuk, hogy a GONR képes kelátot képezni a fémionokkal a reaktív oxigénfajták megkötésére. A molekuláris betekintés nézetben megfigyeltük, hogy ezek a nanoanyagok leszabályozták a melaninszintézist azáltal, hogy csökkentették a mikroftalmiával kapcsolatos transzkripciós faktorral kapcsolatos génexpressziókat, és hasonló következményekkel jártak a fehérjeexpresszióban. Összefoglalva, a GONR-ek potenciális hatóanyagok, mint új antioxidánsok és bőrfehérítő kozmetikai anyagok.

Cistanche is azpotenciális ügynök mint regényantioxidánsés bőrfehérítéskozmetológiai anyag.

1. BEMUTATKOZÁS

A bőr az a szerv, amely az emberi test külső felületét borítja. Mivel a felület érintkezik a környezettel, a bőrréteg fontos szerepet játszik a szervezet kórokozók elleni védelmében, a túlzott vízveszteség elkerülésében, a testhőmérséklet szabályozásában stb. A melanociták a bőr epidermisz bazális membránjában nőnek, és a sejttartalom 5-10 százalékát teszik ki. Egysejtű "mirigyként" jellemezték őket, vékony, hosszú, szalagszerű dendritekkel és elágazással. A melanociták a közvetlen szomszédságukban lévő epidermális sejteken keresztül mozognak, így minden melanocita körül epidermális sejtekből álló konstellációt hoznak létre. A bőr öregedésének számos belső és külső oka van, és az egyik ilyen tényező a napfény ultraibolya (UV) sugárzása.1 Az UV-sugárzás során a bőr reaktív oxigénfajták (ROS) szintje drámaian megemelkedik, amit oxidatív stressznek nevezünk. Számos környezeti toxicitási tényező is fokozza a bőr oxidatív stresszét, mint például a peszticidek, a szén-tetraklorid, a nehézfémek, az aromás aminok és a 2,5-ös (PM2,5) szemcsés anyag.2 A biokémiai mechanizmusban az intracelluláris oxidánsok a nem oxidatív anyagokból képződnek. enzimrendszer, ROS-okká alakítva a melanogenezis útját.3

A ROS mellett számos tényező befolyásoljamelanin termelés, beleértve a génexpressziót, a gyulladást, az endokrin változásokat és a pigmentfelvételt.1 A melanintermelés első lépéseiben a tirozináz szerepet játszik a tirozin fenomelaninná és eumelaninná történő katalizálásában. Mindkét pigment előállítási mechanizmusa hasonló, beleértve az L-tirozin hidroxilálását 3-sá, a 4-dihidroxi-L-fenilalanin (L-DOPA) és az L-DOPA oxidációját dopakinonná. A következő lépésben a dopamint a tirozinázzal rokon protein 1 (TRP-1) és a tirozinázzal rokon protein 2 (TRP-2) oxidálja a melanoszómában, amit a mikroftalmiával összefüggő transzkripciós faktor ( MITF) melanint képez. Végül a melanin érlelődik és kicsapódik a stratum corneumban.4,5 Ezek behatolnak a bazális réteg szomszédos keratinocitáiba, és megvédik DNS-üket az UV-sugárzás által kiváltott mutációktól vagy módosulásoktól. A melanoszómák érett melaninja átkerül a keratinocitákba6-9, és végül hosszan tartó pigmentációhoz vezet. Lentigins, szeplők és barna/fekete foltok néha szociális problémákat okoznak férfiaknál és nőknél. Az oxidatív stressz blokkolása vagy a tirozináz aktivitás visszaszorítása a hiperpigmentáció és a bőrgyógyászati ​​rendellenességek szindróma leszabályozásának egyik stratégiája. Az antioxidánsok gyógyítják a ROS okozta hiperpigmentációt és a sejtkárosodást.10,11 Ezért a szintetizált antioxidáns vegyületeknek számos biofunkcionális alkalmazása van a bőrápolási alkalmazásokban.

A fullerén (C60), szén nanocső (CNT), grafén és grafén nanoszalag (GNR) négyféle sp2 nanokarbon, amelyet világszerte széles körben kutatnak.12 A fullerént és származékait vagy komplexeit erősnek tartják.szabad gyökfogókhosszú ideje. Yodh et al. vízoldható C60-at használtak védőanyagként a katabolikus stressz által kiváltott degeneráció ellen. Inject et al. arra a következtetésre jutottak, hogy a C60(OH)24 erős antioxidáns vegyület, ha az oxidatív stressz túl magas. Okuda et al. felvetették, hogy a C60 komplexek megakadályozhatják az NO által közvetített sejtkárosodást.13,14 Tong et al. kimutatták, hogy a C60-komplexek ígéretes jelöltek lehetnek a megnövekedett szuperoxidszint által okozott agyvel kapcsolatos betegségek kezelésére. Valójában egy japán cég 2006-ban azonosította az erős antioxidáns hatással rendelkező fulleréneket kozmetikai használatra. Lucente-Schultz et al. kimutatták, hogy a funkcionalizált egyfalú CNT-k (SWCNT) oxigéngyök-fogó képessége közel 40-szer nagyobb, mint a dendrites C60.15-19 Fenoglio et al. megfigyelték, hogy a többfalú CNT-k (MWCNT-k) figyelemre méltó gyökfogó képességgel rendelkeznek hidroxil- vagy szuperoxid gyökök külső forrásával érintkezve.20 A sűrűség-funkcionális elméleti számítások feltárták az SWCNT-k szabad gyökfogóinak modelljét is. 2004-ben Novoselov et al. először bizonyították, hogy a grafén erős ambipoláris elektromos hatást fejt ki, és ígéretes lehet az elektronikai alkalmazásokhoz.21 Ezt követően továbbra is kimutatták, hogy a grafén olyan elektronikus tulajdonságokkal rendelkezik, amelyek a Dirac-egyenlet által leírt részecskék 2D-s gázára jellemzőek.22,23 e két úttörő közleményben egyre nagyobb figyelmet szentelnek a grafén alapú kutatásoknak.24−30 Például Qiu et al. 2014-ben kimutatták, hogy a grafén-oxid és a néhány rétegű grafén jelentős antioxidáns aktivitást mutat, és megvédheti a különböző biomolekuláris molekulákat az oxidációtól.31 Han et al. 2007-ben kísérletileg bebizonyította, hogy a GNR-ek energiarését a litográfiai folyamat során a szalagszélesség változtatásával lehet szabályozni.32 ​​A négy nanokarbon közül a GNR-ekre irányult a legkevesebb figyelem. Tudomásunk szerint kevés kutatás folyik a grafén-oxid nanoszalagok (GONR) antioxidáns tulajdonságairól.31,33 Ezért ebben a tanulmányban gondosan előkészítettük az MWCNT-ket, a rövid MWCNT-ket, a GONR-eket és a rövid GONR-eket, és célunk volt ezek antioxidáns tulajdonságainak összehasonlítása és összehasonlítása. kapcsolódó eredmények szisztematikusan.

2. EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS

2.1. Az MWCNT-k és a GONR-ek morfológiája.

Figure 1a shows the low- and high-magnification transmission electron microscopy (TEM) images of MWCNTs and short MWCNTs. Following acidic cutting under ultrasonication, the length of MWCNTs could be shortened from >10 μm-től 2–3 μm-ig. Ezzel párhuzamosan megfigyelhető, hogy a salétromsavas kezelés érdesíti a sima csőfelületeket. A nagy nagyítású képen néhány bevágás és szabálytalan alakzat jelenik meg. Továbbá az MWCNT-k és a rövid MWCNT-k mikrohullámú reakciókkal történő alkalmazásával GONR-t és rövid GONR-t kapunk. Illusztráltuk a GONR és a rövid GONR kis és nagy nagyítású TEM képeit is. A nagy hosszirányú kicipzározás és a kisebb vízszintes vágás miatt úgy tűnik, hogy a GONR-ek rövidebbek voltak, mint az MWCNT-k. Másrészt a nagy nagyítású képek a GONR-ek nagyobb átmérőjét, azaz 0.11-0,18 μm-t mutattak, mint az MWCNT-eké, ami azt jelzi, hogy a kicsomagolási folyamat sikeres volt. Hasonlóképpen, a rövid GONR-ek rövidebb hosszúságot és nagyobb átmérőt mutattak, mint a rövid MWCNT-k. Az új kicsomagolási eljárásunk légkompresszorában a GONR-ek vékony réteges szerkezete kisebb volt, mint amit a korai jelentésben kaptunk ugyanazon 250 W-os mikrohullámú teljesítmény mellett, miközben megtartottuk a vastagabb központi MWCNT-ket.12 Ez egy mag-héj MWCNT-t jelentett. A /GONR heterostruktúra valószínűleg megjelenik a teljesen kibontott nanoszalag szerkezet helyett az összes mikrohullámú teljesítményen keresztül az új eljárásban. Összehasonlítva a korábbi tanulmányainkban a rövid GONR-rel34, a nagyobb mikrohullámú teljesítmény több bevágást generált a szalagok oldalán, és nem képezett szép, sima szalagéleket. Vegye figyelembe, hogy az 1a ábrán két különböző típusú Cu-rácsot használtunk. A megfelelő hosszúságú MWCNT-khez és GONR-ekhez a szénnel stabilizált csipke alakú Gu-rácsot (termékszám: 01881-F, Ted Pella, Inc., USA) használták. A csipkés szénfilm nyitott lyukai megakadályozták, hogy a nanokarbonok és a szénfilm között átfedő átviteli kép alakuljon ki. A sötétszürke hálók a csipkés szénfilmhez tartoznak. Mindazonáltal a szénnel stabilizált formvarral rendelkező Gu-rácsra (termékszám: 01800-F, Ted Pella, Inc., USA) szükség volt a rövid MWCNT-hez és a rövid GONR-hez. Ennek az az oka, hogy a csipkés szénfólián lévő nagy lyukak problémákat okoztak a rövid MWCNT és a rövid GONR hatékony megtartása során. Amint az 1. ábrán látható, a rövid MWCNT-k és a rövid GONR-ek alatti világosszürke kontraszt világos szénréteg. Ez a szénréteg hő- és elektromos vezető tulajdonságai révén stabilizálta az elektronsugárnak kitett formvar filmet.

2.2. MWCNT-k és GONR-ek ragasztási konfigurációi.

A négy nanokarbon Raman-spektrumát az 1b. ábra mutatja be; a GONR-ek D-sávja magasabb volt, mint az MWCNT-eké a kibontási folyamat után. Ez a GONR magasabb oxidációs szintjének és az MWCNT-ekhez képest nagyobb számú élszerkezetének tulajdonítható. Ez a jelenség is hasonló ahhoz, amit a 2011.12-ben tapasztaltunk. A magas grafitizációs szint miatt az MWCNT-k G sávja rendelkezett a legalacsonyabb teljes szélesség-maximum felével. A négy nanokarbon ID/IG aránya rendre {{10}.076, 0.502, 0.483 és 0.700 volt. Röviden, a csökkent hosszúság és a felületi oxidáció növelte a hibaszintet, és így az ID/IG arányok magasabbak lettek. A D' csúcs minden hibás grafénben jelen van, és a minőség mérőszámának tekintik.35 Amint az 1b. ábrán látható, a négy spektrumban a D' csúcsok feltűnőbbé válnak akár a vágási, akár a kicsomagolási folyamat után, ami arra utal, hogy romboló hatásúak. számos hibát okozó folyamatok. Az 1c, d ábra a négy nanokarbon röntgen-fotoelektron-spektroszkópiai spektrumát mutatja. Úgy tűnik, a D′ csúcs a legtisztább a rövid GONR-eknél. Amint az 1c. ábrán látható, az O-szint szignifikánsan 7,6 százalékról (MWCNT) 19,9 százalékra (GONR) nőtt a KMnO4 erős oxidációs képessége miatt savas környezetben. Másrészt az O-szint kis mértékben, 0,8 százalékkal nőtt az MWCNT-ről a rövid MWCNT-kre. Fontos, hogy a legmagasabb O-szint 38,3 százalék a rövid GONR esetében, ami arra utal, hogy a nanoszalagok végei könnyebben rögzíthetők oxigén funkciós csoportok, mint a sík sp2 felületek. A C 1s csúcsok nagyobb teljes szélessége fele maximum számot és a magas kötési energiára való eltolódást mind az MWCNT-k, mind a rövid MWCNT-k kibontási folyamata után az 1d. ábra szemlélteti. Grafén-oxidok esetében a nagy kötési energiájú oldalon lévő dekonvolúciós csúcsok a C−C(CC), C−O, CO és COOH kötésekhez rendelhetők.36 A GONR-t (200 W) 2013-ban jellemeztük. ,37 és az eredmények hasonlóak voltak ehhez a vizsgálati eredményhez. Ez a tanulmány a Raman-spektrum jelenségét zárta le, ami azt jelenti, hogy a cső-szalag átalakulás során több oxigéntartalmú funkciós csoport keletkezett (2. ábra).

2.3. Az MWCNT-k és GONR-ek antioxidáns tulajdonságai.

2.3.1. Az 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil szabad gyökfogó aktivitás meghatározása.

1,1- Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) szabadgyökfogó aktivitása egy antioxidáns platform, amelyet az antioxidáns kapacitás kimutatására alkalmaznak; a négy nanokarbonra vonatkozó eredményeket a 2. táblázat írja le. A DPPH vizsgálatban 100 μM koncentrációjú C-vitamint használtunk pozitív kontrollként. Az MWCNT-k, a rövid MWCNT-k, a GONR-ek és a rövid GONR-ek antioxidáns hatásának tesztelésére 1, 5 és 10 mg/l dózisokat inkubáltunk a reakcióoldatba a tulajdonságok mérésére. Az MWCNT-k, a rövid MWCNT-k, a GONR-ek és a rövid GONR-ek mérsékelt gátló képességgel rendelkeztek 10 mg/l (19,2 ± 0,3, 12,1 ± 0,3, 26,8 ± 0,3 és 30,0 ± 0,4 százalék), míg a C-vitamin 100 μM (93,4 ± 0,1 százalék) mellett hasonló állapotot mutatott az elnyomás tekintetében.

2.3.2. Ion-kelátképző aktivitási vizsgálat.

Oxidatív stresszhelyzetben a ferrozin Fe2 plusszal komplexet tud kialakítani, amelyet mennyiségileg kell mérni. Kelátképző mediátorok jelenlétében a komplex felbomlik, aminek következtében a vasionok redukálódnak a Fe2 plus komplex sötétvörös színéből. Pozitív kontrollként EDTA-t használtunk. A 2. táblázat azt mutatja, hogy az MWCNT-k, rövid MWCNT-k, GONR-ek és rövid GONR-ek kelátképző aktivitása 10 mg/L (29,2 ± {{10}},8, 28,7 ± 0) 0,7, 69,7 ± 0,6 és 68,9 ± 0,3 százalék), míg a pozitív kontroll hasonló állapotú volt 100 μM-nál (93,4 ± 0,1 százalék).

2.3.3. Vas-csökkentő antioxidáns teljesítménymérés.

A vas-redukáló potenciál vizsgálat egy egyszerű és megbízható teszt, amelyet a Fe(III)-ferricianid komplex szintézisének mennyiségi meghatározására használnak. Ebben a vizsgálatban a vas(III)-TPTZ komplexet termelő négy nanokarbon redukáló erejét az oldat színének sárgáról zöldre és kékre történő változásával mutattuk ki. A 2. táblázat szemlélteti, hogy az MWCNT, a rövid MWCNT, a GONR és a rövid GONR redukálóképessége az optikai sűrűség (OD) 1,11, 1,13, 1,15 és 1,11 volt 10 mg/l-nél.

2.3.4. Az MWCNT-k és a GONR-ek gátolják az intracelluláris ROS-felhalmozódást.

Számos jelentés kimutatta, hogy a ROS tönkreteszi a sejtmembránok szerkezeti integritását, beleértve a sejtmembránokat és a nukleáris membránokat, ami sejtkárosodáshoz és a normál működés elvesztéséhez vezet.38-40 Ezenkívül a ROS a tirozináz képződését katalizáló egyik fontos tényező. melanint, és a ROS termelés gátlása jó stratégia a melanin szintézis leszabályozására. Ebben a vizsgálatban a 2',7'-diklór-dihidrofluoreszcein-diacetát (DCFDA) festési tesztet használtuk az intracelluláris oxidatív stressz szintjének elemzésére MWCNT és GONR kezelt sejtekben. A forbol 12-mirisztát 13--acetát (PMA) oxidatív stimulációt indukált MWCNT és GONR csoportokban, és negatív kontrollként használták.41 Amikor a PMA koncentrációja 20 ng/ml volt, oxidatív stresszt indukált, növelve ezzel az érték 38 százalék; A GONR-ek és az MWCNT-k kezelése után a ROS szintje a normál szintre csökkent. Az adatok azt mutatták, hogy mindkét anyag gátolta az oxidatív stressz szintet, és a GONR-ek antioxidáns hatása magasabb volt, mint az MWCNT-eké (3. ábra). Az 1. táblázat egy hasonló következménylistát mutat be. Azt állítottuk, hogy új megállapításainknak három oka van: először is, ezen anyagok oldhatóságának sorrendje a következő volt: rövid GONR-ek > GONR-ek > rövid MWCNT-k > MWCNT-k, ami azt jelenti, hogy a rövid GONR-ek érintkezési területe volt a legnagyobb, tehát kiváló a ROS ürítéshez. Másodszor, a GONR-ek és az MWCNT-k olyan sp{13}}szénszerkezetek voltak, amelyek addukt képződés vagy elektrontranszfer révén elpusztíthatják a ROS elektromosságát.42 Azt találtuk, hogy a nanoszalag szerkezetek antioxidáns hatásai jobbak, mint a nanocső szerkezeteké, így a nanoszalagok teszik ezt. könnyebb az elektronok átvitele, mint a nanocsövek. Végül, az 1b. ábrán azt látjuk, hogy a GONR sp{16}}szén helye több oxigénfunkciós csoportot tartalmazott, mint az MWCNT-k, a karbonsavcsoportok fémionokat kelátozhatnak, a hidroxilcsoportok pedig H-donorok lehetnek a ROS és gátolja a melanin termelését.

2.4. Humán dermális fibroblaszt sejtekben kezelt MWCNT-k és GONR-ek citotoxicitása.

A {{0}}(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólium-bromid (MTT) módszert alkalmaztuk a A GONR-ek citotoxikus tulajdonságait Hs68 sejteken (3. ábra), és a sejteket különböző 1, 5 és 10 ug/ml dózisokban tenyésztettük. Megvizsgáltuk, hogy az MWCNT sejtéletképessége 100,7 ± 3,7, 99,8 ± 4,9 és 94,1 ± 4,7 százalék volt 1, 5 és 10 mg/l koncentrációk mellett; a rövid MWCNT életképességét ugyanebben a sorrendben számították ki, és azt 93,9 ± 2,2, 86,4 ± 3,0 és 98,9 ± 2,1 százaléknak találták. Megfigyeltük, hogy a B16-F10 sejteket magas koncentrációban inkubáltuk, és a Hs68 sejtek túlélése több mint 80 százalék volt, ami arra utal, hogy az MWCNT és a rövid MWCNT nem volt toxikus hatással a humán dermális fibroblaszt sejtekre. A GONR és a rövid GONR sejtéletképessége 86,24 ± 2,1, 90,87 ± 3,5, 88,58 ± 2,5, 89,03 ± 3,6, 90,71 ± 2,8 és 90,64 ± 2,5 százalék volt. A 4a. ábrán az is látható, hogy a GONR és a rövid GONR nem gyakorolt ​​észrevehető citotoxikus hatást a HS68 sejtekre. A korábbi jelentések szerint a nem tesztelt nanoanyagok kozmetikai célú felhasználása megkérdőjelezhető volt,43,44, és ez általában a DNS támadása miatt történt, miután a nanorészecskék bejutottak a sejtekbe. A citotoxicitási tesztet követően azt találtuk, hogy anyagaink nem okoztak toxicitást a normál bőrsejtekre. Arra a következtetésre jutottunk, hogy miután a nanoanyagok bejutottak a sejtekbe, a nanoanyagok csak gátolják a melanintermelést az oxidatív stressz csökkentésével és a fémionok kelátképzésével, és nem károsítják a mitokondriumokat vagy a DNS-t, ami azt jelenti, hogy az MWCNT-k és GONR-ek használata biztonságos volt.

2.5. Az MWCNT-k és a GONR-ek két típusa a B16-F10 celluláris tirozináz aktivitásban és a melanintartalomban.

A melanin szintézis útjában a tirozináz kritikus szerepet játszik. A tirozináz oxidálódik, és biokémiai reakciók során eumelanint és pheomelanint képez. Annak megállapítására, hogy a GONR-ek és az MWCNT-k gátolják-e a tirozináz aktivitását és csökkentik-e a melanintermelést, elemeztük a tirozináz aktivitást B16-F10 sejtekben. Azt találtuk, hogy az MWCNT-k és a rövid MWCNT-k körülbelül 17,1 százalékkal, 10 mg/l-nél 23 százalékkal gátolták a tirozináz aktivitást. A GONR-ek és a rövid GONR-ek jobb hatást gyakoroltak a tirozináz aktivitás elnyomására azonos koncentrációk mellett, mint egy másik GONR. Ezek szintén dózisfüggőek voltak, és a tirozináz aktivitás 49,8 százalékában és 44,7 százalékában gátolták, amint azt a 4b. ábra mutatja.

A melanin nélkülözhetetlen pigment az emberi szervezetben, de a melanin túlzott expressziója gyakran egy sor betegséget vált ki. Korábbi tanulmányokban Xiao et al. hasonló anyagot, a Radical Sponge-t, egy fullerén nanorészecskét használtak melanin elleni szerként.45 Voltak jó eredmények; a melanintermelés körülbelül 20 százaléka gátolható. Hatékonyságának javítása érdekében továbbfejlesztettük a tesztanyagot a melanin gátlási arányának és molekuláris mechanizmusának mérésére, amint az a 4c. és 5. ábrán látható. Az MWCNT-k és a rövid MWCNT-k 17,6 ± 5,5-tel és 13,2 ± {{-kal csökkentették a melanintartalmat. 16}},2 százalék 10 mg/l-nél és dózisfüggő módon. A GONR-ek és a rövid GONR-ek erőteljesen leszabályozták az értékeket 32,0 ± 2,3 és 35,3 ± 3,4 százalékra 10 mg/l-nél. A kísérleti eredmények azt sugallták, hogy mind a négy típus gátolja a melanin szintézisét, és a GONR-ek erősebb hatást fejtenek ki. Másrészt azt is megfigyeltük, hogy a rövid GONR jobban gátolja a melanintermelést. Arra a következtetésre jutottunk, hogy a rövid GONR-ek több funkciós csoportot tartalmaznak, és hatékonyan képesek megakadályozni a fémionok által katalizált tirozinázt, tovább gátolva a melanin termelődését (2. ábra). Az 1. táblázatban azt látjuk, hogy a fémion-kelátképző rövid típus erőfeszítése nagyobb, mint a normál típusé; ez azt jelenti, hogy ezek a rövid GONR-ek potenciálisan alkalmazhatók a kozmetikai területen bőrápoló szerként.

2.6. Az MWCNT-k és a GONR-ek mechanizmusa gátolta a B16-F10 celluláris melanintartalmat.

A sejtek a fehérje expresszió szabályozásával reagálnak a külső oxidatív stresszre. A B16-F10 sejtek fokozzák a c-myc génexpressziót és a fokozottan szabályozott AMPK-t, hogy csökkentsék az oxidatív szintet,46 és ebben a munkában a MITF a tirozináz specifikus transzkripciós faktora, amely szabályozza a molekuláris melaninszintézis jelútját.47-49 Az ábrán Az 5a. ábrán látható, hogy az MWCNT-k és a GONR-ek az oxidatív stressz csökkentésével leszabályozzák a mikroftalmiával összefüggő transzkripciós faktort, majd a TRP{10}} és a TRP{11}} downstream génje is leszabályozott. A fehérjeszint esetében hasonló jelenséget találtak, amikor is az MWCNT-k és a GONR-ek leszabályozták a MITF-hez kapcsolódó melanogenezis útvonalat, majd végül csökkentették a melanintartalmat (5b. ábra).

3. KÍSÉRLETI ANYAG ÉS MÓDSZER

3.1. MWCNT-k és GONR-ek elkészítése.

A GONR-ek előállításának releváns folyamatáról egy korábbi cikkben számoltak be.12 MWCNT-t (0.05 g) 9:1 H2SO4/H3PO4-ben szuszpendáltunk, és mikrohullámú reaktorral kezeltük (CEM-Discover). 250 W-ra beállított teljesítménnyel 2 percig. KMnO4 (0,25 g) hozzáadása után az oldatokat ugyanazzal a mikrohullámú teljesítménnyel kezeltük 65 fokon 4 percig12 Ezt a folyamatot rövidebb, 8 perces, második fokozatú mikrohullámú idővel módosítottuk légkompresszor segítségével. Itt a légkompresszort a mikrohullámú reaktor hőmérsékletének szabályozására használják a folyamat során. A mikrohullámú teljesítményt 250 W-ra állítottuk be az előzetes tesztek során.

3.2. Rövid MWCNT-k és rövid GONR-ek elkészítése.

A rövid GONR-ek készítésének releváns folyamatáról korábbi cikkünkben számoltunk be.34 A savas kezelési idő 8 óra volt. A mikrohullámú teljesítményt 250 W-ra állítottuk be, ami megegyezik a GONR-ek beszerzésével.

3.3. DPPH gyökfogó tevékenység.

A DPPH-t gyakran használták a minták befogóképességének és az antioxidáns tulajdonságok meghatározására.50 A DPPH egy lila reagens, amely liláról sárgára változtatja a színét, ha a szabad gyök átkerül az analitba. Megfelelő koncentrációjú pozitív antioxidáns mintákat adtunk az oldathoz, és a mintákat 517 nm-en elemeztük 30 percig. A korábbi DPPH gyökök redukálásához szükséges antioxidáns mennyiségének mérésére a vizsgált mintákon kívül a maradék DPPH százalékos arányát is felhasználtuk. Pozitív kontrollként 100 μM C-vitamint használtunk. Az öblítési aktivitást ( százalék ) a következőképpen mérték

Öblítési kapacitás ( százalék )=(Minta – üres) / (A kontroll – üres) × 100 százalék (1)

3.4. Fémkelátképző tevékenység.

A fémion a lipid túlzott oxidációját okozó tényező, a Fe2 plus pedig az egyik leginkább befolyásoló ion.50 Különböző koncentrációjú nanobioanyagokat (1 μL) töltöttünk egy 96-lyuk lemezre, amely 2 mM FeCl2·4H2O-t tartalmazott. (10 μL), majd ferrozinba (5 mM, 20 μL) töltjük. Az elegyet teljesen összekevertük 69 µl mentollal, és 10 percig szobahőmérsékleten tartottuk. Ezután a minta reakcióoldatát 562 nm-en figyeltük meg. Pozitív kontrollként EDTA-t használtunk 100 μM-nál, és a fémkelátképző aktivitás számítási képlete az 1. egyenlet alapján készült.

3.5. Teljesítmény csökkentése.

A redukáló teljesítmény számítása egy korábbi tanulmányon alapul.50 Először 2,5 μL grafén anyagokat kevertünk össze PBS pufferrel (67 mM, pH 6,8) és K3Fe(CN)6 (2,5 µl, 20 százalék), majd 50 fokon inkubáltuk. 20 percig. Ezután 10%-os triklór-ecetsavat (160 μL) összekevertünk a reagensekkel 300 g-vel, centrifugálva 20 percig. Az abszorpciós hosszt 700 nm-en határoztuk meg, miután 25 µl FeCl3-mal (2 százalék) összekevertük. Butilezett hidroxianizolt (BHA) használtunk 100 μM koncentrációban.

3.6. Sejtburjánzási vizsgálatok.

A HS68 humán dermális fibroblaszt sejtvonalat alkalmaztuk a sejtproliferáció arányának elemzésére. A HS68-at Dulbecco módosított Eagle táptalajban (DMEM) inkubáltuk, amely 10% magzati szarvasmarha szérumot és 1% penicillint és sztreptomicint tartalmazott.50,51 A különböző koncentrációjú minták kezelését követően MTT-t alkalmaztunk a sejtproliferációs arány kimutatására. 8000 sejtet oltottunk 96-lyuklemezekre, és 24 órán át mintákkal kezeltük. A felülúszó oldatot eltávolítottuk, és az MTT oldatot használtuk a tenyésztéshez 2 órán át 37 °C-on. Inkubálás után az MTT-t tartalmazó táptalajt eltávolítottuk és dimetil-szulfoxiddal (DMSO) oldottuk. Az oldatot OD 590 nm-en olvastuk le, és a sebességet 1 egyenlettel számítottuk ki.

3.7. A celluláris melanintartalom értékelése.

Az előző vizsgálaton alapuló módszert kisebb módosításokkal alkalmaztuk.52,53 A Bioresource Collection and Research Centertől (BCRC, CRL 6323, Hsinchu, Tajvan) származó B16−F10 sejtpelleteket 2,0 N NaOH és 10% DMSO. A mintát ezt követően 1 órán át 90 fokon melegítettük, majd 10,{11}}g-vel centrifugáltuk további 10 percig, hogy megkapjuk a kitisztult felülúszót. A melaninszámot a felülúszó OD-jének 475 nm-en történő követésével határoztuk meg.

3.8. B16−F10 sejtes tirozináz aktivitás.

A B16-F10 celluláris tirozináz aktivitás tekintetében néhány módosítással hivatkoztunk az előző munkára. 50 A sejteket 12-lyukú lemezeken tenyésztettük 105 sejtben. A mintákkal végzett kezelések után a sejteket 1%-os Triton X{6}}/PBS-ben és 2 mM L-tirozinban (50 μL) lizáltuk 3 órán át. Az inkubálás után eltávolítottuk a tápközeget, és leolvastuk az abszorbanciát OD 590 nm-en. A tirozináz aktivitás képletét az 1. egyenlet alapján számítottuk ki.

A Cistanche egy tirozináz inhibitor.

3.9. ROS kimutatása DCFDA festéssel.

Az előző vizsgálatra hivatkozva:54 1.2 1.105 B16-F10 sejteket 6-lyuklemezekre oltottunk, és különböző koncentrációjú mintákkal kezeltük. A sejteket PBS-ben szuszpendáltuk, majd DCFDA-val (5 μM) nem-fenolvörös DMEM-ben töltöttük 30 percig 37 °C-on. A DCFDA fluoreszcens jelének kimutatására áramlási citométert (Guava, Merck, Németország) használtunk. A DCFDA gerjesztési és emissziós hullámhossza 488, illetve 535 nm volt.

3.10. Kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció.

Lin és munkatársai módszereit követtük. (2018).1 A valós idejű kvantitatív reverz transzkripciós-polimeráz láncreakció (qRT-PCR) egy exkluzív primer próbából állt, amely fluoreszcenciát generált. Fluoreszcencia-detektálási technikát alkalmazott, amely minden ciklust egy 7500 qRT-PCR rendszer (Applied Biosystems, USA) segítségével érzékel. A felszabaduló fluoreszcencia mennyisége alapján detektálta a ciklust, majd az egyes ciklusok szorzatát kiszámította a generált tartalomra, ami valós idejű kvantitatív célokat eredményezett. Trizolt (Invitrogen, USA) használtunk a tüdőszövet teljes RNS-ének kivonására, a gyártó utasításai szerint. Ezt követően egy reverz transzkripciós készletet (Takara, Japán) használtak a DNS előállításához. Az 1. táblázatban felsorolt ​​primereket használó qRT-PCR során először a mintát melegítettük, hogy egyetlen DNS-szálat képezzenek; majd egy primer kötődés történt, így kettős szálú DNS (dsDNS) keletkezett, amely után a SYBR Green dsDNS-t kombinálták, amihez a SYBR green plus reagens készletet (Roche, Basel, Swiss) használtuk, ami felszabadító fluoreszcenciát eredményezett. A kapott anyagot fluoreszcens detektáló rendszeren engedtük át. A fluoreszcens jelek detektálása az egyes ciklusok elongációs vagy lágyítási fázisában történt; A detektálás után a minta tartalmát a detektált fluoreszcencia intenzitással visszanyomtuk.55 A célgének expressziós szintjeit -tubulin szintre normalizáltuk 2−ΔΔCt módszerrel.

miricetin

3.11. Western Blot teszt.

A B16-F10 sejteket egy éjszakán át 4 fokon lizáltuk proteáz inhibitorokat tartalmazó radioimmunprecipitációs vizsgálati pufferrel (Thermo Scientific Co., USA). A fehérje mennyiségének meghatározásához a bicinchoninsav fehérje vizsgálati készletet (BCA, Sigma-Aldrich Corp., USA) használtuk. A mintafehérjéket 10%-os nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélen választottuk el, és polivinilidén-difluorid (PVDF) membránra vittük át (PALL Life Science, Ann Arbor, MI, USA). A PVDF membránt blokkoló pufferrel (Thermo Scientific) blokkoltuk 1 órán át, és a specifikus primer antitesttel egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk. Ezután a membránt Tris-pufferolt sóoldat-Tween 20 pufferrel kétszer mostuk, és másodlagos antitestekkel 1,5 órán át inkubáltuk. Ezt követően a membránt kemilumineszcenciás detektáló reagensekbe mártották (Thermo Scientific), és MiniChemi Chemiluminescence képalkotó berendezéssel (Beijing Sage Creation Science, Kína) elemezték. Az antitestek forrásai a nyúl anti-MITF, nyúl anti-TRP-1, nyúl anti-TRP-2 és -aktin (Thermo Scientific) voltak.

3.12. Anyagelemzés.

TEM-et (JEOL JEM-1230, 100 kV) használtunk a nanokarbonok morfológiájának megfigyelésére. Mikro Raman spektrométert (PTT, RAMaker) alkalmaztunk a nanokarbonok rezonanciamódusának ellenőrzésére. Röntgen fotoelektron spektroszkópiás (XPS, Kratos Axis Ultra DLD) méréseket is végeztünk az összetétel-elemzés meghatározásához.12,34

3.13. Statisztikai analízis.

Minden mintát és standard kísérletet legalább háromszor megismételtünk. Az átlagértékek átlagának ± szórás statisztikai összehasonlítására és kifejezésére Student-féle t-próbát alkalmaztunk.

4. KONKLÚZIÓK

Összefoglalva, megfigyeltük, hogy a rövid GONR potenciális anyaga volt a bőrápoló termékeknek, számos biofunkcionális tulajdonsága miatt (6. ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy a nanokarbonok extracelluláris és intracelluláris antioxidánsként játszottak szerepet. Eközben a nanokarbon gátolta a tirozináz aktivitást és a melanin tartalmat, és nem okozott komoly sérülést a pigmentsejtekben. Ez a munka négyféle nanokarbon melanogenezis-ellenes funkcióját állapította meg; A jövőbeni tanulmányok e vegyületek mechanizmusát vizsgálják a melanin érésével, szállításával és felhalmozódásával kapcsolatos specifikus gén- és fehérjeexpressziókon.

A Cistanche javítja a fehérítést.

Kérjük, kattintson a képre és tudjon meg további részleteket.